Spectrométrie de masse MALDI-TOF
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개요
Désorption-ionisation laser assistée par matrice (MALDI) est une source d’ions de spectrométrie de masse idéale pour l’analyse de biomolécules. Au lieu de rayonnements ionisants composés à l’état gazeux, les échantillons sont noyées dans une matrice, qui est frappée par un laser. La matrice absorbe la majorité de l’énergie ; une partie de cette énergie est ensuite transférée à l’échantillon qui s’ionise en conséquence. Les ions échantillon peuvent ensuite être identifiées à l’aide d’un analyseur de temps de vol (TOF).
Cette vidéo couvre les principes de MALDI-TOF, notamment la sélection de la matrice et comment la TOF est utilisée pour élucider les rapports masse sur charge. Cette procédure montre la préparation d’une plaque MALDI, le chargement d’échantillons sur la plaque et le fonctionnement du spectromètre de masse TOF. Dans la dernière section, variations et applications apparaissent, y compris l’analyse de cellules entières, de la caractérisation des échantillons biologiques complexes et ionisation de pulvérisation électronique.
Désorption-ionisation laser assistée par matrice MALDI, est une source d’ions de spectrométrie de masse idéale pour l’analyse de biomolécules. La plupart des sources d’ions supprimer information structurale de biomolécules grande, fragile. MALDI maintient l’intégrité structurale et par conséquent les informations, tout en accélérant les molécules dans l’analyseur de masse, qui sépare les composés basés sur la taille et de la charge. Le plus souvent couplée avec la MALDI est le temps de vol, ou TOF, analyseur de masse. Cette vidéo va expliquer les concepts de MALDI ionisation, une procédure générale et certaines de ses utilisations en biochimie.
Pour la spectrométrie de masse à fonction, molécules doivent être ionisés dans l’état gazeux. MALDI, l’échantillon est noyée dans une matrice, typiquement un organique composé contenant aromatiques et conjugués doubles liaisons.
Quand une impulsion laser frappe ce mélange la matrice absorbe la majorité de l’énergie, rapidement s’échauffe et est désorbé ou libéré, de la surface. La matrice sous tension transfère une partie de son énergie aux biomolécules, désorption et puis ionisant eux.
MALDI est généralement associé à une heure de vol, ou TOF, analyseur de masse. Un champ électrique s’applique à l’énergie cinétique aux ions, plaçant dans une région sans champ appelée un tube de dérive. La vitesse des ions qui se déplacent dans le tube est liée à leur rapport masse-à-charge, donc les particules les plus lourdes se déplacent plus lentement à travers l’instrument. Un détecteur à l’extrémité du tube de mesure le temps de vol de chaque ion. Avec ces connaissances, ainsi que la longueur du tube et la force de champ appliqué, le ratio de la masse de charge de chaque ion peut être élucidé.
Cette parcelle d’intensité du signal à la masse-à-charge-ratio, connu comme un spectre de masse, peut être comparé à une bibliothèque de spectres collectés. Si aucune correspondance n’est trouvée, il peut les molécules peuvent être identifiés par les autres techniques, comme la spectrométrie de masse. Pour plus d’informations, voir la vidéo de cette collection sur le sujet.
Maintenant que nous ayons discutés les rudiments de MALDI-TOF, examinons le processus en laboratoire.
Avant de commencer une expérience, il est important de considérer le choix de la matrice, d’où les échantillons seront être désorbées. Il doit absorber l’énergie du laser, être stable dans le vide, pas réagissent avec les molécules de cible et pouvoir se désorber. Selon l’échantillon, les différentes matrices sont préférés. Pour une grosse protéine, une combinaison de CHCA et DHB a montré la meilleure séparation des pics, appelé résolution, que les matrices individuels.
Il y a un certain nombre de façons de préparer les échantillons. Nous allons montrer ce que l’on appelle le « double couche », ou « “, » méthode sandwich”. Pour commencer, nettoyez la plaque MALDI avec réactifs ultra pures, comme la spectrométrie de masse est très sensible à la contamination. Sécher la plaque avec un courant de gaz inerte.
Ensuite, une solution saturée de matrice est faite, généralement avec un solvant organique. La solution est striée sur le plat de MALDI et séchée. Une deuxième solution saturée de matrice contenant l’acide trifluoroacétique ou TFA, est établie. TFA aide des ions en phase gazeuse.
Ensuite, la solution de l’échantillon est ajoutée sur le dessus de la tache séché matrice. Ajouter la solution de matrice contenant des AGT sur le dessus de l’échantillon, complétant ainsi la matrice « sandwich ». Homogénéité de la tache peut être vérifiée sous un microscope à faible puissance.
Plaque d’un étalon, qui est un mélange avec une large gamme de masses connues et sert à établir une corrélation entre le temps de vol à m/z. Enfin, la plaque la matrice seule comme témoin négatif.
Pour analyser les taches, placer la plaque de la cible dans l’instrument. S’assurer il n’y a aucun débris présents, permettant la formation d’un vide serré. Dans le logiciel, sélectionnez le contrôle standard, négatif et des échantillons d’intérêt. Les taches avec l’identification correcte de l’étiquette.
Les tensions de source et l’objectif d’ions peuvent être manipulées pour améliorer les performances de l’analyse. Cela dépendra de la spécificité de l’instrument et l’échantillon. Mettre l’accent sur l’endroit standard et calibrer l’appareil avec le logiciel.
Ensuite, recueillir des spectres de chacune des taches échantillon. Essayez quelques endroits différents sur le terrain pour optimiser la qualité des données recueillies. Une fois terminé, la plaque MALDI peut être collectée et réutilisée après le nettoyage.
Maintenant que nous avons passé en revue une procédure, nous allons étudier quelques-unes des façons que MALDI est utilisée et une technique d’ionisation différents.
En plus des biomolécules, MALDI peut être utilisé pour analyser des cellules vivantes. Les macrophages sont des cellules immunitaires qui prennent l’une de plusieurs formes différentes, issus de leur microenvironnement. Après avoir exposé les cellules à divers signalisation des molécules, ou cytokines, ils peuvent être ajoutés directement à la plaque et analysés. Les spectres MALDI peuvent être utilisés comme uniques « empreintes », selon la cytokine utilisé.
Des échantillons biologiques complexes comme les sécrétions sébacées mammifères nécessitent une étape de purification avant l’analyse par MALDI. Chromatographie sur couche mince est une telle technique qui repose sur la polarité des composants. Les composés sont prélevés dans le pâté de TLC, purifiées et transférés vers une matrice MALDI. Les spectres qui en résulte vérifier l’identité et la pureté de la biomolécules séparées de la sécrétion sébacée chez les mammifères.
Une autre source d’ions communs pour les biomolécules est ionisation par électronébulisation ou ESI. Dans cette méthode, l’échantillon est injecté dans l’instrument, où une tension élevée est appliquée, créant un aérosol de gouttelettes chargées. Lorsque le solvant dans la goutte s’évapore, la charge est déplacée vers les molécules de l’échantillon, jusqu’à ce qu’ils sont complètement gazeux. ESI ne nécessite pas la procédure de repérage, et l’échantillon peut être injecté directement dans l’instrument. En revanche, ESI est plus sensible à la présence de composants de tampons et d’autres contaminants, ce qui signifie la que MALDI est plus robuste.
Vous avez juste regardé les vidéo de Jupiter à la spectrométrie de masse MALDI. Cette vidéo décrit la théorie derrière l’instrument, est allé sur une procédure générale et recouvert certaines des utilisations de la technique. Merci de regarder !
Procedure
Disclosures
내레이션 대본
Matrix-assisted laser desorption ionization, or MALDI, is a mass spectrometry ion source ideal for the analysis of biomolecules. Most ion sources remove structural information from large, fragile biomolecules. MALDI maintains structural integrity, and therefore information, while accelerating the molecules into the mass analyzer, which separates the compounds based on size and charge. The most commonly coupled with MALDI is the time of flight, or TOF, mass analyzer. This video will show the concepts of MALDI ionization, a general procedure, and some of its uses in biochemistry.
For mass spectrometry to function, molecules must be ionized into the gaseous state. In MALDI, the sample is embedded in a matrix, typically an organic compound containing aromatic and conjugated double bonds.
When a laser pulse strikes this mixture the matrix absorbs the majority of the energy, rapidly heats, and is desorbed, or released, from the surface. The energized matrix transfers some of its energy to the biomolecules, desorbing and then ionizing them.
MALDI is typically paired with a time of flight, or TOF, mass analyzer. An electric field applies kinetic energy to the ions, moving them into a field-free region called a drift tube. The velocity of the ions as they move through the tube is related to their mass-to-charge ratio, so heavier particles travel slower through instrument. A detector at the end of the tube measures each ion’s flight time. With this knowledge, as well as the tube length and applied field strength, the mass-to-charge ratio of each ion can be elucidated.
This plot of signal intensity to mass-to-charge-ratio, known as a mass spectrum, can be compared to a library of collected spectra. If no matches are found, it can molecules can be identified by further techniques, such as tandem mass spectrometry. For more information, see this collection’s video on the topic.
Now that the basics of MALDI-TOF have been discussed, let’s look at the process in the laboratory.
Before beginning an experiment, it’s important to consider the choice of matrix from which samples will be desorbed. It must absorb the laser energy, be stable in a vacuum, not react with the target molecules, and be able to desorb. Depending on the sample, different matrices are preferred. For a large protein, a combination of CHCA and DHB has shown better separation of the peaks, called resolution, than the individual matrices.
There are a number of ways to prepare samples. We’ll show what is known as the “double-layer”, or “sandwich,” method. To begin, clean the MALDI plate with ultra-pure reagents, as mass spectrometry is very sensitive to contamination. Dry the plate with a stream of inert gas.
Next, a saturated matrix solution is made, typically with an organic solvent . The solution is streaked onto the MALDI plate and dried. A second saturated solution of matrix containing trifluoroacetic acid, or TFA, is prepared. TFA helps ions into the gaseous phase.
Next, the sample solution is added on top of the dried matrix spot. Add the matrix solution containing TFA on top of the sample, thereby completing the matrix “sandwich”. Homogeneity of the spot can be verified under a low-powered microscope.
Plate a calibration standard, which is a mixture with a wide range of known masses and is used to correlate the time-of-flight to m/z. Finally, plate the matrix alone as a negative control.
To analyze the spots, place the target plate into the instrument. Ensure there’s no debris present, allowing for the formation of a tight vacuum. In the software, select the standard, negative control, and samples of interest. Label the spots with the correct identification.
The ion source and lens voltages can be manipulated to improve performance of the analysis. This will depend on the specifics of the instrument and sample. Focus on the standard spot and calibrate the instrument with the software.
Next, collect spectra from each of the sample spots. Try a few different locations on the spot to maximize the quality of the collected data. Once finished, the MALDI plate can be collected and reused after cleaning.
Now that we’ve reviewed a procedure, let’s look at some of the ways MALDI is utilized, and a different ionization technique.
In addition to biomolecules, MALDI can be used to analyze living cells. Macrophages are immune cells that take on one of several different forms, based on their microenvironment. After exposing the cells to various signaling molecules, or cytokines, they can be added directly to the plate, and analyzed. The MALDI spectra can be used as unique “fingerprints”, depending on the cytokine used.
Complex biological samples like mammalian sebaceous secretions require a step of purification before MALDI analysis. Thin layer chromatography is one such technique that relies on the components’ polarity. The compounds are collected from the TLC pate, purified, and transferred to a MALDI matrix. The resulting spectra verify the identity and purity of the separated biomolecules from the mammalian sebaceous secretions.
Another common ion source for biomolecules is electrospray ionization, or ESI. In this method, the sample is injected into the instrument, where a high voltage is applied, creating an aerosol of charged droplets. As the solvent in the droplet evaporates, the charge is moved to the sample molecules, till they are completely gaseous. ESI doesn’t require the spotting procedure, and the sample can be injected directly into the instrument. On the other hand, ESI is more sensitive to the presence of buffer components and other contaminants, meaning MALDI is more robust.
You’ve just watched JoVE’s video on MALDI mass spectrometry. This video described the theory behind the instrument, went over a general procedure, and covered some of the uses of the technique. Thanks for watching!
