Süperoksit/hidrojen peroksit ve NADH üretim mitokondriyal Dehydrogenases Flavin içeren tarafından eş zamanlı ölçüm

Bu prosedürün genel amacı, mikroplaka florometri kullanılarak saflaştırılmış flavin içeren mitokondriyal dehidrojenazların süperoksit/hidrojen peroksit ve NADH üretim hızını ölçmektir. Mitrokondri, izole edilmiş mitokondri ile farklı substrat ve inhibitör kombinasyonları kullanılarak tanımlanmış 12 farklı süperoksit/hidrojen peroksit oluşturma bölgesi içerebilir. Bununla birlikte, izole edilmiş mitokondrideki bireysel üretim bölgelerinin salım kapasitesinin doğru bir şekilde ölçülmesi konusunda hala bazı zorluklar devam etmektedir.

Ve bu, aynı zamanda reaktif oksijen türleri üreten istenmeyen yan reaksiyonlarla ilişkilidir, aynı zamanda antioksidanların varlığı ve ölçümlere müdahale edebilecek katkı maddelerinin kullanımına ek olarak özgüllüğü olmayan inhibitörlerin kullanımı ile ilişkilidir. Burada, saflaştırılmış flavin bağımlı mitokondriyal dehidrojenazlar tarafından süperoksit/hidrojen peroksit ve NADH üretiminin eşzamanlı ölçümü için yöntemi sunuyoruz. Bu yöntem avantajlıdır, çünkü istenmeyen yan reaksiyonları ve herhangi bir reaktif oksijen türü söndürme sistemini ortadan kaldırarak bireysel üretim alanlarının ROS üretme potansiyelinin doğrudan ve doğru bir şekilde ölçülmesine izin verebilir.

Hem ROS hem de NADH üretiminin eşzamanlı ölçümü, mitokondri ile deneyler yapılmadan önce ROS üretimi için inhibitörlerin taranması için değerli olabilecek süperoksit / hidrojen peroksit oluşturma potansiyelinin ve bireysel enzimlerin aktivitesinin doğrudan karşılaştırılmasına da izin verir. Buradaki amaçlarımız doğrultusunda, örnek olarak domuz kalbi kökenli piruvat dehidrojenaz kompleksi ve alfa-ketoglutarat dehidrojenaz kompleksini kullanacağız. Her ikisi de flavin içeren enzimlerdir ve reaktif oksijen türleri için bilinen kaynaklardır.

Ek olarak, bu iki enzim kolayca saflaştırılabilir. Süperoksit/hidrojen peroksit ve NADH'nin eş zamanlı ölçümü, çiçeklenmedeki değişikliklerin izlenmesiyle elde edilir. NADH, üretiminin kolay ölçülmesini sağlayan kendi içsel floresan özelliklerine sahiptir.

Bu arada süperoksit / hidrojen peroksitteki değişiklikler süperoksit dismutataz, yaban turpu peroksidaz ve amplex ultrared reaktif gerektirir. Yaban turpu peroksidaz ve hidrojen peroksit varlığında, amplex ultrared, floresan olmayan bir molekülden floresan resorufin'e dönüştürülür. Süperoksit dismutaz, incelenen dehidrojenaz tarafından oluşturulan herhangi bir süperoksidin hidrojen peroksite dönüştürülmesini sağlar.

Tahlil kurulmadan önce çalışma solüsyonları hazırlanır. Tahlili kolaylaştırmak için, tüm reaktifler 20 mikrolitrelik alikotlarda 96 oyuklu siyah bir plakanın kuyucuklarına eklenir. Kuyudaki her reaksiyonun hacmi 200 mikrolitredir, bu nedenle çalışma çözeltileri reaksiyon kuyusunda bulunan konsantrasyonun 10 katıdır.

Ardından, mikroplaka okuyucuyu, NADH otofloresan ve resorufin floresansının ikili ölçümü için kinetik bir test çalıştıracak şekilde programlayın. Bu, önce Prosedür seçilerek ve 25 santigrat dereceye ayarlanarak yapılır. Ardından, Kinetiği Başlat'ı tıklayın.

Süreyi yaklaşık beş dakika çalışacak şekilde ayarlayın ve ardından 30 saniyelik bir floresan okuma aralığı seçin. Ardından, Oku'ya tıklayın ve testiniz için floresan ölçüm parametrelerini ayarlayın. Burada probun konumu, çiçeklenmedeki değişiklikleri izlemek için kullanılan dalga boyları ve okunacak kuyular yazılıma girilir.

Floresan okumalar için farklı kanallar da seçilir ve biri 376 nanometre uyarma ve 450 nanometre emisyon dalga boylarına ayarlanmış NADH'nin otofloresansına ayrılmıştır. Resorufin çiçeklenmesindeki değişiklikler 565 nanometre ve 600 nanometrede izlenir. Tahlil koşulları oluşturulduktan sonra, ayrı kuyulara aynı anda hem NADH hem de süperoksit/hidrojen peroksit üretimini ölçmek için gereken tampon ve farklı reaktifler yüklenir.

Kuyuların farklı reaktiflerle yüklenme sırası aşağıdaki gibidir. İlk olarak, kuyuya gerekli miktarda tampon eklenir, ardından 20 mikrolitre saflaştırılmış enzim çözeltisi eklenir. Enzim, cihazın içinde birkaç dakika boyunca tampon içinde dengelenir.

Ardından, kalan reaktifler aşağıdaki sırayla eklenir. Alt tabaka eklendikten sonra Başlat'a basın. Plaka taşıyıcı okuyucuya girecek ve protokol başlatılacaktır.

Tahlil sırasında, ham bağıl floresan üniteleri veya RFU'lar için gerçek zamanlı çıktılar yazılım kullanılarak izlenebilir. Kullanıcı, kuyu düzeninin üzerindeki Veri sekmesini kullanarak farklı floresan okumalar arasında geçiş yapabilir. Farklı floresan okumaları için eğrilerin seçilebileceğini unutmayın.

Ek olarak, klavyede Control'ü basılı tutarak ve kuyucuklara sol tıklayarak, farklı reaksiyonların gerçek zamanlı karşılaştırmalarına izin veren bir bileşik grafik elde edilebilir. Deneyin tamamlanmasının ardından, mikroplaka taşıyıcı cihazdan çıkacaktır. Bu noktada, RFU'daki değişiklikler için temsili grafikteki sonuçlar Excel'e aktarılır.

Ham RFU değerleri, önce temsili RFU grafiğindeki Veriler'e tıklanarak dışa aktarılır. Bu, NADH ve resorufin floresansı için ham RFU değerlerinin bir tablosunu verecektir. NADH veya resorufin çiçeklenmesindeki değişikliklere karşılık gelen ham RFU numaraları aynı anda dışa aktarılamaz.

Dışa aktarıldıktan sonra, sonuçlar analiz için düzenlenir. Test yapılmadan önce oluşturulan NADH ve resorufin floresanı için standart eğriler kullanılarak, zamanla oluşan mikromol içindeki NADH ve pikomoldeki süperoksit/hidrojen peroksit miktarı hesaplanabilir. Bunu, NADH ve süperoksit/hidrojen peroksit üretim hızının hesaplanması takip edebilir.

Bu prosedür için, tahliller yapmadan önce izole edilmiş flavin içeren dehidrojenazınızın saflığını kontrol etmeniz çok önemlidir. Bu, proteinler için basit bir coomassie boyası yapılarak veya farklı substratların varlığında enzimin aktivitesini test ederek elde edilebilir. DTT gibi indirgeyici ajanların, flavin bağlı dehidrojenazlar tarafından süperoksit/hidrojen peroksit üretimi için bir substrat görevi görebileceğinden, testten çıkarılması tavsiye edilir.

Genel olarak, bu yöntem, süperoksit/hidrojen peroksit üretimi için inhibitörleri taramak için kullanılabilmesi ve ayrıca farklı flavin bağlantılı mitokondriyal dehidrojenazların ROS oluşturma kapasitesinin doğrudan karşılaştırılmasına izin vermesi bakımından oldukça esnektir. Bu videoyu izledikten sonra, saflaştırılmış dehidrojenazlar tarafından ROS ve NADH üretiminin nasıl ölçüleceği konusunda samimi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu tahlil, izole mitokondri ile daha karmaşık deneyler için bir basamak taşı görevi görebilir.