Name: 一种研究空间记忆在小鼠本能防御中作用的行为分析法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: 学习基于Barnes迷宫的行为分析方法，用于研究小鼠本能防御行为中的空间记忆作用。该方法通过视觉和听觉刺激诱发逃逸反应，无需预先训练即可探究目标导向导航行为。

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本工作由惠康信托/皇家学会亨利·戴尔研究员项目（098400/Z/12/Z）、英国医学研究理事会（MRC）资助项目MC-UP-1201/1、惠康信托与盖茨比慈善基金会SWC研究员项目（授予T.B.）、MRC博士生奖学金（授予D.E.和R.V）以及勃林格殷格翰基金会博士生研究员项目（授予R.V）资助。我们感谢Kostas Betsios编写数据采集软件，感谢LMB机械与电气车间搭建实验场地。

所有实验均在当地伦理审查通过后，依照英国1986年《动物（科学程序）法案》（PPL 70/7652）进行。
1. 行为实验装置的设置
注意：行为实验装置的主要组成部分是一种巴恩斯迷宫的变体13，由一个白色亚克力圆形平台（直径92 cm）构成，平台上沿半径方向均匀分布着20个直径为5 cm的圆形孔洞，孔洞距平台边缘5 cm。其中19个孔洞需用黑色塑料塞（深5 mm）封闭，剩余一个孔洞通向一个黑色有机玻璃避难所（尺寸为15 × 5.8 × 4.7 cm），小鼠可轻松进出。实验区域的中心部分为一个固定的圆形平台（直径22 cm），外围部分安装在一个支架上，可通过计算机控制的步进电机实现360度旋转。平台距离地面高度为45 cm，以防止小鼠爬下。参见图1中的示意图。
<ol>
	<li>在平台边缘周围至少距离边缘 2 cm 处附上视觉线索（不同形状、颜色和图案的二维或三维符号），以防止小鼠接触到这些线索。 
	注意：视觉线索的示例包括面积为 262 cm2 的纯蓝色正方形，或直径为 15.5 cm、填充紫色斜条纹的圆形。</li>
	<li>将约 2 g 来自小鼠居住笼的垫料放入庇护所内部，作为局部嗅觉线索。可选地，在庇护所入口处放置一个发光二极管（LED），以提供局部视觉地标线索。</li>
	<li>为使小鼠与外界远端视觉线索隔离，在实验区域周围安装一个八边形或圆柱形围壁，围壁应高出平台表面 40 cm，并深入平台表面下方 15 cm，且距离平台边缘 10 cm。</li>
	<li>在平台中心正上方 50 cm 处放置一个超声波扬声器，用于传递厌恶性听觉刺激。</li>
	<li>在实验区域正上方 64 cm 处放置一个半透明屏幕，利用投影仪背投传递令人厌恶的上方视觉刺激。</li>
	<li>投影仪提供的光线将照亮行为装置；校准光源，使平台表面中心处照度为 5–10 lx。在平台上方放置红外光源和红外相机，并配备长通滤光片（&#62;700 nm），以防止投影仪闪烁干扰所采集的视频。</li>
	<li>使用 commercially available software 或合适的算法在线追踪小鼠的位置。对于在白色实验区域上追踪黑色小鼠，采用简单的阈值分割操作，随后计算掩膜质心即可满足要求。</li>
	<li>理想情况下，应将行为装置置于隔音且避光的箱体内，以防止外部线索影响实验结果。</li>
</ol>
2. 传递固有厌恶刺激
注意：下述刺激可通过多种不同软件包生成，包括 LabVIEW 和 Matlab。
<ol>
	<li>视觉刺激
	<ol>
		<li>将刺激投影到位于实验区域上方64 cm处的屏幕上。刺激由灰色背景上一个线性扩大的黑色圆形组成22（韦伯对比度 = -0.98，亮度 = 7.95 cd/m2）。 
		注意：标准圆形理想情况下应居中于小鼠正上方，在起始时对应的视觉角度为2.6°，并在200 ms内以224°/s的速度线性扩大至47.4°，随后保持该角度250 ms，然后消失。</li>
		<li>施加视觉刺激时，应将其中心对准小鼠位置。可通过等待小鼠进入实验区域中预设的特定区域，或通过实时追踪小鼠位置并利用追踪坐标确定圆形中心来实现。 
		注意：尽管我们建议将视觉刺激投影在小鼠正上方，但将相同刺激投影在小鼠前方（仍与地面平行）也可引发防御行为。根据我们的经验，至少在小鼠前方30 cm范围内均能观察到此类反应。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>听觉刺激
	<ol>
		<li>触发一个由三个频率调制上扫信号组成的刺激序列，频率从17 kHz上升至20 kHz23，每次上扫持续3 s，总共持续9 s。声压级（SPL）在平台高度测量时，应在73至78 dB之间。</li>
		<li>将声卡和放大器连接至位于实验区域上方的超声波扬声器，以传递听觉刺激。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 动物：
<ol>
	<li>使用6至24周龄的雄性或雌性C57BL/6J小鼠。将动物维持在12小时光照周期中，并可自由获取饲料和水。</li>
	<li>确保小鼠在行为检测前至少单独饲养72小时，并在光照周期的光照相期间进行测试&#160;。 
	注意：我们发现单独饲养小鼠的基础探索行为在个体间的可比性高于群养小鼠。此外，用于神经活动记录或操控并带有手术植入物的动物通常需要单独饲养，因此在相同饲养条件下获得对照数据集可能是有益的。</li>
</ol>
4. 标准行为学实验：
<ol>
	<li>使用70%乙醇或乙酸仔细清洁平台表面，以去除不需要的嗅觉线索。用水冲洗躲避处，再用70%乙醇清洗，之后再次用水冲洗，以减少乙醇气味。</li>
	<li>将平台和躲避处彻底干燥，因为如果躲避处潮湿，小鼠可能会避免进入。</li>
	<li>每次试验前通过旋转平台来随机化躲避处在平台上的位置。躲避处在测试区域中的位置将被固定，但相对于行为装置的围栏方向会发生旋转。</li>
	<li>将小鼠连同其饲养笼一起带入实验房间，并将笼子放置在测试平台上方，进行10分钟的适应期。</li>
	<li>从饲养笼中取出小鼠时应避免抓取尾巴：可用手掌托起，或让其爬到可提起的丰富化物品上。已证明抓取小鼠尾巴会增加其焦虑水平&#160;，从而可能影响其对威胁的行为反应24。</li>
	<li>轻柔地将小鼠放置在测试区域中央，并开始视频采集。</li>
	<li>给予7分钟的适应期，在此期间不施加任何厌恶刺激。确保小鼠有足够时间至少一次找到并进入躲避处。当四只肢体均进入躲避处时，视为一次成功进入。大多数小鼠在7分钟内应能完成该行为；若未发生，则每次延长5分钟适应时间，直至确认至少一次进入为止。</li>
	<li>可通过观察实时视频画面手动触发厌恶刺激（听觉或视觉）的呈现，也可通过在线追踪动物位置并在测试区域中预设兴趣区域，当动物进入该区域时自动触发刺激。视觉刺激通常利用在线视频追踪坐标直接投射在动物正上方。</li>
	<li>若需在同一实验阶段诱发多次逃避反应，应等待小鼠自愿离开躲避处后再进行下一次刺激。如果小鼠在上一次厌恶刺激后未能成功逃至躲避处，则需至少等待60秒后再施加下一次刺激。</li>
	<li>实验结束后，将动物放回其饲养笼中。如需对同一只小鼠进行后续测试，应至少间隔48小时后再进行重复实验。</li>
	<li>在测试下一只动物前，按照步骤4.1和4.2所述方法清洁平台和躲避处。</li>
</ol>
注意：步骤 5、6 和 7 是标准行为实验的独立变体，可各自单独进行。
5. “导航策略”行为学实验：
注意：本实验的目的是确定小鼠在引导逃避行为时所利用的线索。在本实验中，当小鼠位于固定的中央区域时，平台可移动的外圈部分会被旋转，从而导致庇护所、庇护所内部的嗅觉线索以及附着在平台上的近端视觉线索发生径向位移。如果小鼠依赖的是随平台旋转的任一线索来导航至庇护所，它将正确逃向庇护所的新位置；但如果小鼠利用的是保持不动的其他线索，则会朝向庇护所原先的位置移动。
<ol>
	<li>执行上述标准行为学实验的步骤 4.1 至 4.8，至少诱发一次逃跑反应作为基线数据。</li>
	<li>让小鼠主动离开庇护所，并等待其移动至平台中央区域。在平台中心放置一个装有垫料的小碟，以促进小鼠探索行为，并使其在中央平台停留足够长的时间，以便完成外圈平台部分的旋转。在小鼠进入庇护所后、且在平台旋转前成功完成一次逃跑反应之后，将小碟和垫料放置到位。如果小鼠在逃跑反应期间未能进入庇护所，则需等待其自愿进入庇护所后再添加小碟和垫料。</li>
	<li>使用步进电机将平台至少旋转 36 度（2 个孔位），然后立即施加感觉刺激以诱发逃跑反应。需要注意的是，旋转过程本身可能引发惊吓反应，甚至直接触发逃跑行为。 
	注意：根据我们的经验，约有 55% 的小鼠会在外部平台仍在旋转时即跑出中央（非旋转）平台区域，此类试验应从分析中剔除。</li>
	<li>按照步骤 4.10 和 4.11 所述，清洁平台和庇护所，并将小鼠放回其饲养笼中。</li>
</ol>
6. “动态环境”行为学实验：
注意：该实验旨在评估小鼠如何适应环境中的突发变化。在这些实验中，先诱发至少一次逃跑反应，然后改变庇护所的位置，并允许小鼠在下一次逃跑反应被触发前访问新位置一次。如果小鼠能够准确更新庇护所的新位置，并意识到原位置已无庇护所，则应逃向新位置。否则，小鼠可能尚未记住庇护所的新位置，或同时记住了两个位置但更倾向于逃向旧位置。
<ol>
	<li>在完成上述步骤 4.1 至 4.8 后进行本实验，至少诱发一次飞行反应作为对照。</li>
	<li>当小鼠自愿离开庇护所后，移除该庇护所，并将其重新放置于平台另一端的新孔洞中。</li>
	<li>允许小鼠探索环境，直至其进入新位置的庇护所内。</li>
	<li>当小鼠自愿从庇护所中出来时，给予其厌恶刺激并观察其反应。</li>
	<li>本实验使用听觉刺激，因其持续时间较长；在持续威胁下，若动物初次未能找到庇护所，可能会向其他位置执行额外的逃逸反应。</li>
	<li>按照步骤 4.10 和 4.11 所述，清洁平台和庇护所，并将小鼠放回其居住笼中。</li>
</ol>
7. “无庇护所”行为实验：
注意：本实验的目的是了解环境中缺乏庇护所对防御行为表达的影响。
<ol>
	<li>堵住全部20个洞。在本实验中，实验区域内不提供任何庇护所。</li>
	<li>清洁并干燥平台后（步骤4.1和4.2），执行步骤4.4–4.6。</li>
	<li>给予7分钟的适应期。</li>
	<li>呈现视觉刺激并观察防御性反应。由于缺乏庇护所，小鼠通常表现出僵直行为，该行为一般持续整个视觉刺激期间。可使用一个缓慢扩大的斑点（例如.&#160;起始时视觉角度为2.6°的圆形，以11.2°/s的速度线性扩张，持续4秒至47.4°，随后保持该大小1秒后消失），以利于观察僵直反应。</li>
	<li>若需记录同一只小鼠多次反应，每次刺激之间应至少间隔60秒。</li>
	<li>在无庇护所条件下获取所需数量的反应后，将一个庇护所置于其中一个洞下方，让小鼠探索环境至少5分钟。大多数小鼠可在5分钟内发现并进入新引入的庇护所；若未发生进入行为，可每次延长5分钟，直至确认至少一次进入行为。</li>
	<li>重复步骤4.8和4.9，观察在环境中存在庇护所时小鼠表现出的逃逸反应。</li>
	<li>按照步骤4.10和4.11所述，清洁平台和庇护所，并将小鼠放回其饲养笼中。</li>
</ol>
8. 数据分析：
注意：以下每个数据分析步骤均可独立执行。
<ol>
	<li>逃避反应可被明确识别为在呈现厌恶刺激后出现的突然加速。通过测量从刺激呈现到头部朝向逃避目标的旋转运动起始点或加速运动起始点之间的时间（以先发生者为准），来量化逃避潜伏期。</li>
	<li>冻结反应的特征是动物除呼吸运动外完全静止不动25，持续时间至少为0.5秒7。通过测量从厌恶刺激呈现到静止期开始之间的时间，来量化冻结潜伏期。</li>
	<li>对于每次逃避反应，通过计算小鼠与庇护所之间的直线距离与实际逃逸路径位移的比值，来量化逃逸轨迹的直线性。</li>
	<li>对于每次逃避反应，通过测量动物逃向的洞口与通往庇护所的正确洞口之间的偏差距离，来计算其准确性。由于共有20个洞口，每偏离一个洞口即代表准确率下降10%（例如，偏离2个洞口可表示为80%的准确率）。</li>
	<li>在“导航策略”行为实验中，相对于平台旋转前的庇护所位置来量化反应的准确性。若平均准确性与旋转前无显著差异，则表明动物未利用任何随平台旋转的感官线索来导航至逃避目标。</li>
	<li>在“动态环境”行为实验中，将每次诱发的逃避反应分类为朝向新庇护所位置、旧庇护所位置，或两者皆非的方向。评估诱发防御行为在多次重复过程中的反应模式变化。</li>
	<li>在“无庇护所”行为实验中，比较在有或无庇护所条件下，呈现厌恶视觉刺激后小鼠的运动速度，并计算防御反应启动的潜伏期。此外，分别计算在两种条件下由刺激诱发冻结反应的概率。</li>
</ol>

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</ol>

结果部分包含的大多数数据是Vale et. al 2017年所发表数据的一个子集。

本文所述的实验在技术上易于操作，除平台旋转实验外，均可在标准的巴恩斯迷宫中轻松实施。然而，仍可能出现一些问题：一方面，小鼠可能表现出不愿进入避难所，这可能是由于避难所未充分清洁或干燥所致&#160;；另一方面，小鼠可能在避难所内停留极长时间。在这些实验中至关重要的是，绝不能手动将动物从避难所中移出，因为这会干扰路径整合过程，同时引起动物应激反应，并改变其对威胁的反应行为。我们建议在90分钟后终止实验，必要时可在48小时后重新测试。另一个重要的实际考虑是，当小鼠探查平台边缘时，若其头部倾斜至边缘之外，可能无法感知视觉刺激，因此我们建议在此类情况下暂停刺激呈现。此外，小鼠偶尔可能从平台上跳下。我们建议终止实验，并在48小时后重新测试。一旦小鼠主动离开平台一次，则未来再次发生该行为的可能性较高，此类个体可能需要从研究中剔除。最后，根据我们的经验，大多数小鼠会对视觉刺激产生反应（36只小鼠中有34只出现反应）。然而，若小鼠对视觉刺激完全无反应（无论是惊吓、逃跑或僵直反应），则应将其从研究中排除。
需要考虑的一个重要问题是，感觉线索的控制通常是空间记忆检测中的一个难题，因为通常很难消除所有可能的干扰线索来源。我们的实验装置通过用墙体包围迷宫来减少外部视觉线索，并将装置放置在隔音柜内以实现声音隔离。为了尽量减少嗅觉线索，我们建议在每次实验之间使用70%乙醇或乙酸对装置进行彻底清洁。
我们的行为学检测方法通过利用本能防御行为来探究空间记忆，并聚焦于生态学相关的情境，从而补充了以往研究空间导航的方法26。本方法与标准避暗检测（BM）之间的一个关键区别在于无需进行训练阶段。在我们的检测中，适应期可确保小鼠至少一次（通常更多次）进入庇护所，我们此前已证明这足以使小鼠记忆庇护所的位置2。我们认为，尽管没有训练过程，小鼠仍能高效且准确地找到庇护所，一个重要原因是在实验过程中从未被动转移动物，从而使路径整合成为一种可行的导航策略。然而需要指出的是，我们的检测仅涉及在单次实验过程中形成并评估的记忆，尚未检验对庇护所位置的长期记忆，而后者通常是标准BM实验的目标。最后，与在实验全程使用常见的风扇或蜂鸣刺激不同，我们的检测采用离散的、天生令人厌恶的刺激，从而能够很好地控制两种可能依赖不同导航策略的行为：觅食行为和朝向庇护所的逃逸行为。我们认为，将这些检测方法与现代神经科学技术（用于记录和操控神经活动）结合使用，将有助于深入理解神经回路如何计算并产生行为。

本能防御行为通常被认为是固有的刺激-反应模式，例如鱼类和两栖类中的C型启动运动，这种动作可使动物迅速远离威胁源1。然而，如果防御行为能够灵活地结合&#160;个体对当前环境所习得的信息，则可能更具适应性。此类灵活性的一个例子是啮齿类动物在面临威胁时，根据先前对环境中是否存在庇护所的认知，从逃跑行为转变为静止不动（冻结）行为2,3。其他先天行为灵活性的例子包括：根据猎物与庇护所之间的距离调整逃跑启动阈值或逃逸速度4，依据与威胁的距离5,6以及过往经验11,12进行调整，根据厌恶刺激的感官特性选择不同的防御策略7，甚至在饥饿等竞争性动机面前抑制防御行为8,9,10。行为选择对环境空间特征的已知信息的依赖性，使得小鼠的本能防御行为成为研究目标选择、空间记忆与导航机制的有力模型。本文中，我们描述了一种常用行为实验任务——巴恩斯迷宫（Barnes maze, BM）空间记忆检测方法13的改进应用，用于探究空间环境对小鼠防御性行为选择的影响，以及其在逃向庇护所过程中的导航策略。
用于研究小鼠学习和空间记忆的标准巴恩斯迷宫由一个直径约90 cm的圆形平台组成，平台上均匀分布着20个孔，其中19个孔封闭，1个孔通向地下避难所&#160;小鼠会寻找庇护所，以避免暴露在平台的开阔环境中。实验中通常会持续使用较弱的厌恶刺激（如蜂鸣器、强光、风扇），使环境具有厌恶性，从而促使小鼠进入庇护所14在最常用的检测方法中15,16，动物会进行一次适应性试验，实验者将其放置在平台上后，立即手动引导其进入庇护所。随后是为期4天的获取阶段，每天让小鼠在迷宫中自由探索3分钟，若在规定时间内未能到达庇护所，则再次由实验者手动引导至庇护所。检测的最后阶段是在第5天进行一次探查试验th 天（尽管也常进行为期七天的长期记忆测试），此时动物在所有孔洞均关闭的情况下探索迷宫。学习和长期记忆通过获取阶段找到庇护所所需的时间、探错孔洞的次数，以及在探测试验中停留在关闭的庇护孔洞附近的时间来量化。典型结果表现为：在获取阶段，错误次数和到达庇护所的潜伏期逐渐减少；在探测试验中，动物在目标孔洞所在象限停留的时间显著高于随机水平。15.
尽管已有多种BM实验方法的变体被报道过17,18,19，但我们在此描述的范式相较于标准实验方法具有三个根本性改变。首先，动物被允许自主探索迷宫并自行发现庇护所，测试在动物找到庇护所后不久的同一实验阶段内进行，此时动物正处于探索行为活跃的时期。尽管该设置并不检测动物对庇护所位置的长期记忆，但其设计旨在模拟动物在捕食威胁下探索新环境的自然情境。此外，该设置还允许研究动物如何适应环境中的急性变化，例如景观的突然改变。其次，本实验方法的一个关键特征是实验人员从不强制将动物放入或移出庇护所，因为这种操作可能使动物迷失方向，并排除路径整合20作为一种可行的导航策略21。路径整合是一种利用自身运动线索（如来自运动输出整合所产生的本体感觉和前庭觉线索）来持续更新动物当前位置并导向目标的导航策略；若动物被实验人员被动移动，则该策略无法实现。第三，我们使用先天具有厌恶性的视觉22和听觉23刺激来诱发动物逃向庇护所的行为，这种逃避行为可轻易与持续进行的觅食行为相区分，从而能够评估并量化动物在应对迫在眉睫威胁时所采用的特定导航策略。我们提出，该实验方法将有助于解析空间记忆在防御行为选择与执行中的作用，更广泛地也适用于目标导向导航及短期空间记忆的研究。本文所述实验方案由Vale et al. 于2017年首次提出，有关实验设计原理与结果的深入讨论，建议读者参考该文献。

<table><tbody><tr><td>红外照明器 TV6700</td><td>Abus</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>DLP 投影仪 Infocus IN3126</td><td>Infocus</td><td>0001740992-00000001</td><td></td></tr><tr><td>超声波扬声器 Pettersson L60</td><td>Pettersson Elektronik</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>放大器 QTX PRO240</td><td>QTX</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>声卡 Xonar D2</td><td>Asus</td><td>90-YAA021-1UAN00Z</td><td></td></tr><tr><td>HP Z840 台式机</td><td>HP</td><td>F5G73AV</td><td></td></tr><tr><td>100 微米绘图纸</td><td>Xerox</td><td>3R98145</td><td></td></tr><tr><td>近红外相机：Basler acA1300-60gmNIR</td><td>Basler</td><td>106202</td><td></td></tr><tr><td>National Instruments BNC-2110</td><td>National instruments</td><td>777643-01</td><td></td></tr><tr><td>LabVIEW 2015 64 位</td><td>National instruments</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>定制 Barnes 迷宫</td><td>MRC 分子生物学实验室机械车间</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠本能防御过程中空间记忆作用的研究行为学实验

A Behavioral Assay for Investigating the Role of Spatial Memory During Instinctive Defense in Mice

进化过程选择了一系列防御行为，这些行为对于所有动物物种的生存至关重要。这些行为通常是针对天生具有厌恶性的感觉刺激所引发的刻板动作，但其成功执行需要足够的灵活性，以适应不同的空间环境，而这些环境可能迅速发生变化。本文介绍了一种行为学检测方法，用于评估小鼠空间认知学习对防御行为的影响。我们改进了广泛使用的巴恩斯迷宫空间记忆检测方法，用以研究小鼠在面对天生厌恶性感觉刺激时，如何在新环境中朝庇护所逃逸，以及它们如何适应环境的急性变化。这种新检测方法是一种基于动物行为学的实验范式，无需预先训练，可利用小鼠自然的探索模式和导航策略。我们提出，本文所述的一系列实验方案是研究目标导向行为和刺激触发导航的有力手段，应同时引起本能行为和空间记忆研究领域的关注。

小鼠在受到听觉或视觉刺激后，会启动快速逃跑反应，刺激开始与逃跑启动之间的潜伏期较短。对视觉刺激的平均逃跑潜伏期为 202 ± 16 ms（来自 26 只动物的 51 次反应），而听觉刺激的潜伏期显著更长：510 ± 61 ms（来自 15 只动物的 36 次反应，视觉与听觉刺激之间的 p&lt;0.0001，t检验；图 2A）（步骤 8.1）。逃跑反应准确指向庇护所（视觉刺激的平均准确率为 97.2 ± 1.4%，听觉刺激为 95.0 ± 1.4%，两种刺激类型之间差异无统计学意义，p = 0.1655，t检验；图 2B）（步骤 8.4），且逃跑轨迹接近直线（视觉刺激的位移与到庇护所距离的平均比值为 107.3 ± 1.3%，听觉刺激为 113.9 ± 1.5%；图 2C）（步骤 8.3）。观察到刺激后的短潜伏期有助于区分刺激诱发的行为与归巢行为，而逃跑轨迹的高度线性表明，逃跑反应的目标是抵达庇护所，而不仅仅是远离刺激源。
当小鼠静止于中心平台时（旋转角度范围为36°–90°，平均56°），在迷宫外圈部分旋转后呈现刺激可成功诱发逃避反应（步骤5）。所有小鼠均逃向遮蔽物原先所在的位置，且与旋转前的试验相比，逃逸轨迹的准确性和线性未见下降。以原始遮蔽物位置为参照，旋转前的平均准确率为96.3 ± 1.3%（n = 8只小鼠的25次反应），旋转后甚至略有升高（100 ± 0%，旋转前后比较的p = 0.009，t检验）。相对于原始遮蔽物位置的平均轨迹线性度在旋转前为109.4 ± 5.0%（8只小鼠的25次反应），旋转后为109.1 ± 2.1%（n = 8只小鼠的8次反应），旋转前后比较的p = 0.957（t检验），图3A和B）。这些结果表明，近端视觉线索并未用于引导逃向遮蔽物的行为（步骤8.3–8.5）。
在诱发一次成功的逃跑反应后改变庇护所的位置（步骤6），小鼠会在位置改变后很快前往新的庇护所位置（到达新庇护所的平均时间为33.1 s，范围为4–82 s）。随后连续进行的声音刺激试验显示，小鼠逃向新位置的概率逐渐增加（第一次试验时为44.4%），到第五次试验时所有动物均100%逃向新位置（n = 9只动物，图3C）。这些实验探究了更新庇护所位置记忆以适应环境变化的动态过程（步骤8.6）。
在迷宫中经过7分钟的适应期（无遮蔽物，步骤7）后，呈现持续5秒的视觉刺激会引发小鼠的僵直行为而非逃跑行为（僵直概率 = 95.2%，平均僵直时间 = 7.9 ± 2.7 s，n = 7只动物）。在同一次实验中随后引入遮蔽物并再次呈现长时视觉刺激，则稳定地诱发了逃跑反应，表明小鼠可根据是否存在庇护所灵活切换防御策略（图3D）（步骤8.1和8.7）。
<img alt="行为实验装置的旋转平台示意图，包含投影仪和摄像头，作为视觉提示。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56988/56988fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：行为实验装置示意图。 从顶部（右）和侧面（左）观察的行为实验装置主要组件示意图。平台的大部分可以旋转，包括庇护所及其附带的视觉提示。俯视图中的深色圆圈为可连接庇护所的孔位，所有孔位均相同（图中指明了一个示例的庇护所位置）。整个实验装置置于一个隔音柜内。 <a href="/files/ftp_upload/56988/56988fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="行为反应箱线图；对视觉斑点与声音线索的反应潜伏期、准确性和逃逸位移。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56988/56988fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：逃逸反应是快速且准确的目标导向行为。（A）从小鼠接受视觉或听觉刺激开始到启动逃逸的潜伏期。（B）逃逸过程中导航至庇护所的准确性，其测量方式定义为：若小鼠直接跑向正确庇护所，则得分为100%；每偏离一个孔位，得分减少10%（e.g.，若首先到达的孔比正确孔位偏移两个孔，则得分为80%）。（C）小鼠逃逸过程中的位移与动物初始位置和目标位置之间直线距离的关系图，显示逃跑路径接近直线。箱线图（须线表示10–90百分位数），其余数据点以圆圈表示。红色曲线为听觉刺激下的数据（来自15只动物的36次反应），黑色为视觉刺激下的数据（来自26只动物的51次反应）。<a href="/files/ftp_upload/56988/56988fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="行为反应分析；逃避位移、准确性、刺激反应、速度变化的图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56988/56988fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：小鼠不利用近端视觉线索或与庇护所相关的线索来引导逃避反应。 (A) 位移图，如 图 2C，用于分析平台旋转前后的小鼠反应。（B）平台旋转前后逃逸过程中的导航准确性。旋转后的准确性以庇护所的初始位置为参照，结果显示小鼠返回原始庇护所位置而非其新位置。（C）朝向新庇护所位置的逃逸反应比例随刺激次数的变化图。在第5次刺激后th 刺激呈现时，所有动物均直接逃向新的庇护所位置（n = 9）。(D) 动物在视觉刺激下的平均速度，红色表示有庇护所可用（表现为逃跑反应），蓝色表示无庇护所（表现为僵直反应）。速度已标准化为基线水平，并以反应时间（定义为逃跑或僵直反应的起始时刻，虚线所示）为对齐点。阴影区域表示标准误（SEM）（n = 7）。对于图2A和2B，箱线图显示10–90百分位范围内的数据，其余数据点以圆形表示。红色数据点为平台旋转前听觉刺激的反应（来自8只动物的25次反应），蓝色数据点为平台旋转后听觉刺激的反应（来自8只动物的8次反应）。 <a href="/files/ftp_upload/56988/56988fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

本方案描述了一种基于巴恩斯迷宫测试的行为学实验，用于研究空间环境知识如何调节本能防御行为。

进化选择了一系列防御行为，这些行为对于所有动物物种的生存至关重要。这些行为通常……

该实验方法有助于回答空间记忆领域中的关键问题，例如动物如何朝向新近习得的目标位置进行导航。该范式的主要优势在于，它能够诱发具有病因学意义的目标导向导航行为，这种行为由严格控制的感官刺激触发，且无需对小鼠进行预先训练。首先，将视觉线索固定在平台周围，距离边缘至少两厘米，以防止小鼠触及这些线索。将庇护所固定在平台上。然后，在庇护所入口处放置一个发光二极管（LED），以提供局部视觉地标线索。接下来，为了使小鼠隔绝外部远端视觉线索，围绕实验区域组装一个八边形墙壁，该墙壁在平台表面以上延伸40厘米，以下延伸15厘米，距离平台边缘10厘米。将超声波扬声器置于平台中心正上方50厘米处，用于传递厌恶性听觉刺激，并将声卡和放大器连接至扬声器。然后，在实验区域上方64厘米处放置一个半透明屏幕，通过投影仪背投产生头顶方向的厌恶性视觉刺激。校准投影仪光线，使平台表面中心的照度为5至10勒克斯。在平台上方放置红外灯和带有长通滤光片的红外相机，以防止所采集视频中出现保护器闪烁。然后，将行为学装置置于隔音避光箱内，以避免外部线索影响实验。最后，使用 commercially available software 在线追踪小鼠的位置。首先将视觉刺激投射到位于实验区域上方的屏幕上。实时追踪小鼠的位置，并在实验区域内预定义一个与先前设定的视觉刺激位置相对应的兴趣区域，以确保视觉刺激位于动物正上方中心位置。接着，测试听觉刺激，该刺激由三个频率调制的上扫频脉冲组成，频率范围为17至20千赫兹，每次持续3秒，总共持续9秒。首先用70%乙醇仔细清洁平台表面，以去除不需要的嗅觉线索。用水和70%乙醇冲洗躲避处，再用清水清洗一次，以减少乙醇气味。将平台和躲避处彻底晾干，因为如果躲避处潮湿，小鼠可能会避免进入。每次试验时通过在实验前旋转平台来改变平台上庇护所的位置。接着，将小鼠连同其居住笼一起带入实验房间，并将笼子放置在测试平台旁，进行10分钟的适应环境阶段。取两克来自小鼠居住笼的垫料放入庇护所内部，作为局部嗅觉线索。将小鼠从其饲养笼中取出时，避免抓取尾巴。可将其用手掌托起，或让其爬到可提起的 enrichment 物品上。然后，轻轻地将小鼠放置在实验区域的中央，并开始视频采集。给予七分钟的适应期，在此期间不呈现任何厌恶刺激。确保小鼠有足够时间至少一次找到并进入避难所，即四肢全部进入避难所内。随后，当动物到达预定义的兴趣区域时，自动或手动触发位于小鼠正上方的视觉刺激呈现。为了在同一次实验中诱发小鼠多次逃避反应，需让小鼠自愿离开庇护所。实验结束后，将动物放回其饲养笼中。最后，在测试下一只动物之前，清洁平台和庇护所。暴露于听觉或视觉刺激的小鼠表现出快速的逃跑反应，刺激开始与逃跑启动之间的潜伏期较短。听觉刺激下的平均逃跑潜伏期显著长于视觉刺激。此外，小鼠向庇护所的导航准确，且在不同刺激类型下，逃跑轨迹均接近直线。在没有遮蔽物的情况下，小鼠经过七分钟的迷宫适应期后，长时视觉刺激的呈现会引发其冻结行为而非逃跑行为。一旦掌握该技术，若操作得当，整个过程可在90分钟内完成。在实施该操作时，重要的是要记住，视觉刺激应呈现在小鼠头部上方或正上方，而不要在小鼠探查平台边缘时呈现，否则小鼠很可能错过该刺激。该技术问世后，为本能行为研究领域的科研人员探索习得性知识对小鼠本能防御行为的调控机制铺平了道路。观看本视频后，您应能充分掌握如何诱发小鼠的防御行为，以及如何利用这些行为研究逃逸反应过程中的空间导航机制。

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科研

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Behavior

行为

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