Name: 체 관 부 수액 샘플링 브라시카 napus 단백질 및 Ribonucleoprotein 단지의 3D-페이지에서 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 23 s
Description: 배우세요 Brassica napus 체관부 수액에서 단백질 및 리보핵단백질 복합체를 3D-PAGE로 분리하고 질량분석으로 동정하는 방법을. 식물 신호전달 및 장거리 수송 연구에 활용됩니다.

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우리가 그들의 과학적 지원을 위해 제니퍼 딕 및 Urszula Zarzenska 감사합니다. 이 작품 경력 통합 교부 금에 의해 (CIG, PCIG14-가-2013-63 0734) 7 프레임 워크 프로그램, 그랜트 LFF-GK06 'DELIGRAH' (Landesforschungsförderung 함부르크), DFG 그랜트 (DFG 애 856_6-1) 내에서 유럽 위원회에 의해 재정적으로 지원 되었다 JK에 게 수 여.

1. 샘플링 및 B. napus 에서 체 관 부 수액의 준비 식물 4,,820
<ol><li>체 관 부 수액 샘플링, 사용 잘 물을 8 주 된 B. napus 식물 꽃가루 오염을 방지 하기 위해 그 표시만 초기 개화.</li>
	<li>피하 주사를 사용 하 여 (Ø 0.8 m m)는 화 서는 punctate 여러 번 줄기와. 다른 몇 가지 화 서 줄기에 및 충분 한 체 관 부 수액 (그림 2a)를 다른 식물에 반복 합니다. 참고: 복잡 한 분석을 위해이 좋습니다 체 관 부 수액의 적어도 600 µ L로 시작 하. 4 ~ 5 식물의 체 관 부 수액 200, 700 µ L 사이 얻을 것입니다.</li>
	<li>필터 종이 부상된 사이트에서 첫 번째 드롭 다운을 닦아내십시오. 이러한 방울 주로 손상된 조직 주위에서 높은 오염된 물질을 포함 하 고 버려질 필요가 있다.</li>
	<li>Pipetting으로 다음 방울을 수집 하 고 수집된 exudate 얼음 냉각 시스템을 사용 하는-20 ° C에서 미리 냉장된 원뿔 1.5 mL 반응 관에 저장.</li>
	<li>계속 해 서 수집 전혀 더 드롭 형성은 관찰, 하지만 1 시간 보다는 더 이상 때까지. 수집 된 체 관 부 수액의 상당한 손실 없이 2 일 후에이 절차를 반복할 수 있습니다. 주: 수집 된 체 관 부 수액 즉시 사용 하거나 미래의 분석-80 ° C에 저장 될 수 있습니다. -80 ° C 보관, 충격-동결 반응 관에 액체 질소.</li>
	<li>체 관 부 샘플 약 1/6번째 분자량 (MWCO) 10000 Daltons (Da)의 차단으로 원심 집중 장치를 사용 하 여 초기 볼륨을 집중 한다. 4 ° C와 먼지 입자를 제거 하는 적어도 15 분 동안 20000 x g에서 집중된 샘플 원심 참고: 체 관 부 수액 농도 단백질의 상당한 손실에 연결 되지 않습니다.</li>
	<li>이후 복잡 한 분석, 단계 3.1 진행.</li>
</ol>2. 체 관 부 수액 순도 제어 역전사 PCR (RT-PCR) 4,,820 를 사용 하 여
<ol><li>체 관 부 수액 액체 재료에 대 한 표준 RNA 추출 메서드를 사용 하 여에서 총 RNA 격리 (예: TRIzol 또는 페 놀-클로 프롬 적 출 소 프로 파 놀 강수량 수성 단계에 따라 단계를 세척 하는 에탄올에서 뒤는 제조 업체의 프로토콜)입니다. 주의: 페 놀-클로 프롬 독성이 있다. 적절 한 개인 보호 장비와 후드 작동 합니다. 최대 6 개월까지-80 ° C에서의 에탄올에 추출 된 RNA는 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>DNase 소화 하 여 DNA의 오염 제거 나 (1 u / µ g) 37 ° C에서 45 분 동안 5mm의 최종 농도에 EDTA를 추가 하 여 효소를 비활성화 하 고 10 분 동안 75 ° C에 샘플을 품 어.</li>
	<li>순수한 RNA를 정화 하 고 다른 정화 단계 (예: 제조업체의 지침에 따라 RNA 정리 키트를 사용 하 여)에 의해 샘플을 집중 합니다.</li>
	<li>150를 사용 하 여 cDNA 합성 키트 역전사 PCR (RT-PCR) cDNA의 합성에 대 한 수행 ng 순수한 RNA의 제조 업체에 의해 설명 된 대로 프로토콜의. 참고:는 cDNA 저장할 수 있습니다-20 ° C에서 사용까지.</li>
	<li>구획 별 성적표를 증폭 agarose 젤 전기 이동 법에 의해 확인 하는 제조 업체에 의해 지정 된 표준 PCR 반응에 대 한 템플릿으로 cDNA의 5 µ L 사용 합니다. 예를 들어 rubisco 작은 소 단위, thioredoxin h, 그리고 꽃가루 외 투 단백질 (그림 1b, 표 1)에 대 한 프라이 머를 사용 하 여 체 관 부 샘플의 순도 확인 합니다.</li>
</ol>3. 블루 기본 페이지 4,25,,2631
<ol><li>사용 중 자기 부 기본 그라데이션 젤 설명 대로 다른27 또는 상업 두번째-트리 스 그라데이션 젤.</li>
	<li>부하에서 젤으로 잘 당 집중된 단백질 샘플의 20 ~ 30 µ g 이상 triplicates.</li>
	<li>4 ° C에서 150 V 젤 실행 샘플 젤 (ca. 20 ~ 30 분, 그림 3a)의 1/3rd 때까지 어두운 파란색 음극 버퍼 B와 양극 버퍼 (표 2)를 사용 하 여. 참고: 북부 blotting에 대 한 단일 젤 레인은 3D 페이지와 덜 풍부한 단백질을 집중 하 여 최대 10 개 젤 차선에서 같은 밴드를 결합 하는 것이 좋습니다 하는 질량 분석에 의해 단백질 구성의 분석에 대 한 동안, 충분 한.</li>
	<li>실행을 일시 중지 한 exchange 어두운 파란색 음극 버퍼 B 밝은 파란색 음극 B/10 (표 2)를 버퍼링 하 고 실행을 계속. 젤 블루 앞 elute 젤 (ca. 120 ~ 180 분, 그림 3a)를 시작할 때 실행을 마칩니다. 참고: 완료 블루 기본 젤 저장할 수 있습니다 4 ° C에 적어도 1 주일에 대 한. 장기간된 보관 밴드 확산으로 이어질 수 있습니다 하 고 피해 야 한다. 다크 블루 버퍼 B 다시 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>4. 선택 사항: RNA 블루 네이티브 북부 더 럽 히 4 를 사용 하 여 검출
<ol><li>독특한 밴드 밖으로 또는 블루 기본 젤에서 전체 젤 레인을 사용 하 여 및 세미 드라이 60 분 3.5 mA/cm2 blotting에 의해 나일론 막에 그들을 전송 잘라내어 멤브레인 (그림 4a)에 연필로 위와 더 낮은 젤 테두리를 표시.</li>
	<li>럽, 후 DEPC 처리 물 막 세척 하 고 건조 한 두 필터 논문 사이.</li>
	<li>UV-가교 120000 µ / cm2 blotted 막의 수행 (85 s 자료의 테이블에에서는 Crosslinker를 사용 하는 경우).</li>
	<li>사전에 교 잡 오븐 (그림 4a)에서 68 ° C에서 60 분에 대 한 교 잡 버퍼 (상업적 또는 성가)의 6 mL와 함께 막 교배.</li>
	<li>3'-biotinylated 프로브 4 µ L를 포함 하는 교 잡 버퍼의 추가 1 mL을 추가 (100 nM).</li>
	<li>품 어 막의 프로브, 37 ° c 68 ° C에서 오븐을 냉각 하는 동안</li>
	<li>2 x SSC와 0.1 %SDS, 프로브 unspecifically 바인딩 제거를 위해 상 온에서 5 분을 포함 하는 버퍼 막 씻어. 주의: SDS 자극을 일으킬 수 있습니다. SDS와 솔루션을 포함 하는 SDS를 작업할 때 장갑과 실험실 코트를 착용.</li>
	<li>민감한 chemiluminescent 반응 (그림 4a) 인 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP) 기판으로는 막 예 luminol와 Streptavidin HRP 공액에의 3'-biotinylated 프로브 탐지를 수행 합니다.</li>
</ol>5. 두 번째 치수: 트리 스-Tricine-요소 페이지 4,28
<ol><li>단일 밴드 블루 기본 젤에서 삭제하시오 더 복잡 한 단백질 (그림 5)의 농도 달성 하기 위해 병렬 차선에서 실행 하는 샘플에서 밴드를 결합 합니다. 참고: 삭제 밴드에에서 저장할 수 있습니다 단일 반응 튜브 4 ° c.에서 사용까지</li>
	<li>12% 트리 스-Tricine-요소 젤을 붓고 (두께 1 m m, 6.8 c m x 8.6 cm (폭 x 길이)). 분리 젤 (표 2), 젤 솔루션의 10 mL를 준비 두 유리 접시 소 프로 파 놀과 오버레이 간의 부. 중 합 완료 후는 소 프로 파 놀을 제거 하 고 젤 삽입 10 잘 빗에 겹쳐 쌓이는 젤에 대 한 젤 솔루션 B (표 2)의 4 mL를 전송. 주의: Unpolymerized 아크릴 신경 수 이며 TEMED 흡입 하는 경우에 유해한. 항상 개인 보호 장비를 착용 하 고는 후드 작동.</li>
	<li>1.5 mL 반응 관에 삭제 젤 밴드를 전송 하 고 젤 조각 (그림 5, 표 2)의 평형에 대 한 SDS 샘플 버퍼 x 2의 1 mL를 추가 합니다.<ol>
<li>실내 온도에, 또는 전자 레인지에가 열 블록 (95 ° C)에 끓는 전에 10 분 동안 샘플을 품 어 고 추가 15 분 동안 실내 온도에 다시 샘플을 품 어.</li>
		<li>여러 equilibrated 젤 조각 같은 복잡 한을 대표 하는 하나의 단일 젤 주머니에 스택.</li>
		<li>전기 이동 법 양극과 음극 150 V 45 ~ 60 분에 버퍼를 실행을 사용 하 여 수행 하 고 전체 젤 레인을 삭제할.</li>
	</ol>
</li>
	<li>산 성 버퍼 (100 mM Tris, 100 mM 아세트산)에서 20 분 컷된 레인을 품 어 고 125 mM Tris HCl, pH 6.8 또 다른 20 분 (그림 5)에서 equilibrate.</li>
</ol>6. 3 차원: SDS-페이지 4,32
<ol><li>분리 젤 Laemmli32 에 따라 15 %SDS 붓고 (두께: 1.5 m m, 6.8 c m x 8.6 cm (폭 x 길이)) (표 2) 스태킹 젤 위의 4%의 얇은 레이어를 추가 하 고. 주의: SDS, 아크릴 아 미드와 TEMED는 유독 하 고 유해 합니다. 후드 밑 작업과 개인 보호 장비를 착용.</li>
	<li>SDS 젤에 equilibrated 젤 레인 전송 및 버퍼 bromophenol 블루 (그림 5)의 흔적으로 보충을 실행 1 x SDS에 0.5% (w/w) agarose 젤 커버.</li>
	<li>전자 레인지에 agarose 젤에 로드 이전 버퍼 실행 SDS를 끓인 다.</li>
	<li>단일 부품의 분자 무게를 추정 하는 단백질 마커를 실행, 삽입 젤의 한쪽 끝에 필터 종이 agarose 경화 될 때까지 또는 일반적으로 IPG 젤 사용 특별 한 빗을 사용 하 여.</li>
	<li>150 V 60 분 및 얼룩에 젤을 실행 콜 로이드 Coomassie, 실버 얼룩 또는 어떤 다른 젤 얼룩 메서드 이후 대량 spectrometric 분석에 적합.</li>
	<li>매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화 같은 대량 spectrometric 방법을 사용 하 여 보이는 단백질 반점 분석 시간의 비행 (TOF MALDI) 또는 LC-MS/MS 질량 분석. 참고: 우리는 콜 로이드 Coomassie 설명된33이미로 얼룩을 사용 하 여 것이 좋습니다. 우리의 손에 덜 풍부한 단백질 충분히 얼룩이 질 수 있다 고 합리적인 데이터 품질에 대 한 대량 spectrometric 분석을 수 있습니다.</li>
</ol>

<ol><li>Kempers, R., van Bel, A. J. E. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF01007704">Symplasmic connections between sieve element and companion cell in the stem phloem ofVicia faba L. have a molecular exclusion limit of at least 10 kDa.</a> Planta. 201 (2), 195-201 (1997).</li>
<li>Stadler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+GFP-fusions+in+Arabidopsis+companion+cells+reveals+non-specific+protein+trafficking+into+sieve+elements+and+identifies+a+novel+post-phloem+domain+in+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Expression of GFP-fusions in Arabidopsis companion cells reveals non-specific protein trafficking into sieve elements and identifies a novel post-phloem domain in roots.</a> Plant J. 41 (2), 319-331 (2005).</li>
<li>Imlau, A., Truernit, E., Sauer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-to-cell+and+long-distance+trafficking+of+the+green+fluorescent+protein+in+the+phloem+and+symplastic+unloading+of+the+protein+into+sink+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell-to-cell and long-distance trafficking of the green fluorescent protein in the phloem and symplastic unloading of the protein into sink tissues.</a> Plant Cell. 11 (3), 309-322 (1999).</li>
<li>Ostendorp, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+Brassica+napus+phloem+protein+and+ribonucleoprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of Brassica napus phloem protein and ribonucleoprotein complexes.</a> New Phytol. 214 (3), 1188-1197 (2017).</li>
<li>Paultre, D. S. G., Gustin, M. -P., Molnar, A., Oparka, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lost+in+Transit%3A+Long-Distance+Trafficking+and+Phloem+Unloading+of+Protein+Signals+in+Arabidopsis+Homografts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Lost in Transit: Long-Distance Trafficking and Phloem Unloading of Protein Signals in Arabidopsis Homografts.</a> Plant Cell. 28 (9), 2016-2025 (2016).</li>
<li>Sali, A., Glaeser, R., Earnest, T., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+words+to+literature+in+structural+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">From words to literature in structural proteomics.</a> Nature. 422 (6928), 216-225 (2003).</li>
<li>Lin, M. -K., Lee, Y. -J., Lough, T. J., Phinney, B. S., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+Pumpkin+Phloem+Proteome+Provides+Insights+into+Angiosperm+Sieve+Tube+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analysis of the Pumpkin Phloem Proteome Provides Insights into Angiosperm Sieve Tube Function.</a> Mol. Cell. Proteomics. 8 (2), 343-356 (2008).</li>
<li>Giavalisco, P., Kapitza, K., Kolasa, A., Buhtz, A., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+the+proteome+of+Brassica+napus+phloem+sap%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Towards the proteome of Brassica napus phloem sap.</a> Proteomics. 6 (3), 896-909 (2006).</li>
<li>Lucas, W. J., Yoo, B. C., Kragler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+as+a+long-distance+information+macromolecule+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell.+Bio%22%5BJournal%5D)">RNA as a long-distance information macromolecule in plants.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Bio. 2 (11), 849-857 (2001).</li>
<li>Dinant, S., Kehr, J. Sampling and Analysis of Phloem Sap. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDinant%2C+S+%22Plant+Mineral+Nutrients%22">Plant Mineral Nutrients</a>. 953, 185-194 (2013).</li>
<li>Kennedy, J. S., Mittler, T. E. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/nature/journal/v171/n4351/abs/171528a0.html">A Method of obtaining Phloem Sap via the Mouth-parts of Aphids.</a> Nature. 171 (4351), 528(1953).</li>
<li>King, R. W., Zeevaart, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+Phloem+exudation+from+cut+petioles+by+chelating+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Enhancement of Phloem exudation from cut petioles by chelating agents.</a> Plant Physiol. 53 (1), 96-103 (1974).</li>
<li>Alosi, M. C., Melroy, D. L., Park, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+gelation+of+Phloem+exudate+from+cucurbita+fruit+by+dilution%2C+glutathione%2C+and+glutathione+reductase%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The regulation of gelation of Phloem exudate from cucurbita fruit by dilution, glutathione, and glutathione reductase.</a> Plant Physiol. 86 (4), 1089-1094 (1988).</li>
<li>Dinant, S., Bonnemain, J. -L., Girousse, C., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phloem+sap+intricacy+and+interplay+with+aphid+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22Comptes+rendus+biologies%22%5BJournal%5D)">Phloem sap intricacy and interplay with aphid feeding.</a> Comptes rendus biologies. 333 (6-7), 504-515 (2010).</li>
<li>Tetyuk, O., Benning, U. F., Hoffmann-Benning, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collection+and+analysis+of+Arabidopsis+phloem+exudates+using+the+EDTA-facilitated+Method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Collection and analysis of Arabidopsis phloem exudates using the EDTA-facilitated Method.</a> J Vis Exp. (80), e51111(2013).</li>
<li>Kovalskaya, N., Owens, R., Baker, C. J., Deahl, K., Hammond, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+modified+EDTA-mediated+exudation+technique+and+guttation+fluid+analysis+for+Potato+spindle+tuber+viroid+RNA+detection+in+tomato+plants+%28Solanum+lycopersicum%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Application of a modified EDTA-mediated exudation technique and guttation fluid analysis for Potato spindle tuber viroid RNA detection in tomato plants (Solanum lycopersicum).</a> J. Virol. Methods. 198, 75-81 (2014).</li>
<li>Rodriguez-Medina, C., Atkins, C. A., Mann, A. J., Jordan, M. E., Smith, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+composition+of+phloem+exudate+from+white+lupin+%28Lupinus+albus+L%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Macromolecular composition of phloem exudate from white lupin (Lupinus albus L).</a> BMC Plant Biol. 11 (1), 36(2011).</li>
<li>Taylor, J. S., Thompson, B., Pate, J. S., Atkins, C. A., Pharis, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokinins+in+the+Phloem+Sap+of+White+Lupin+%28Lupinus+albus+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cytokinins in the Phloem Sap of White Lupin (Lupinus albus L.).</a> Plant Physiol. 94 (4), 1714-1720 (1990).</li>
<li>Yoo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Systemic+Small+RNA+Signaling+System+in+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A Systemic Small RNA Signaling System in Plants.</a> Plant Cell. 16 (8), 1979-2000 (2004).</li>
<li>Buhtz, A., Springer, F., Chappell, L., Baulcombe, D. C., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+small+RNAs+from+the+phloem+of+Brassica+napus%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of small RNAs from the phloem of Brassica napus.</a> Plant J. 53 (5), 739-749 (2008).</li>
<li>Chalhoub, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+genetics.+Early+allopolyploid+evolution+in+the+post-Neolithic+Brassica+napus+oilseed+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Plant genetics. Early allopolyploid evolution in the post-Neolithic Brassica napus oilseed genome.</a> Science. 345 (6199), 950-953 (2014).</li>
<li>Sasaki, T., Chino, M., Hayashi, H., Fujiwara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+several+mRNA+species+in+rice+phloem+sap%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Phys%22%5BJournal%5D)">Detection of several mRNA species in rice phloem sap.</a> Plant Cell Phys. 39 (8), 895-897 (1998).</li>
<li>Doering-Saad, C., Newbury, H. J., Bale, J. S., Pritchard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+aphid+stylectomy+and+RT-PCR+for+the+detection+of+transporter+mRNAs+in+sieve+elements%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Use of aphid stylectomy and RT-PCR for the detection of transporter mRNAs in sieve elements.</a> J Exp. Bot. 53 (369), 631-637 (2002).</li>
<li>Ruiz-Medrano, R., Xoconostle-Cázares, B., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phloem+long-distance+transport+of+CmNACP+mRNA%3A+implications+for+supracellular+regulation+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%22%5BJournal%5D)">Phloem long-distance transport of CmNACP mRNA: implications for supracellular regulation in plants.</a> Dev. 126 (20), 4405-4419 (1999).</li>
<li>Schägger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal. Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li>
<li>Schägger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Anal. Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).</li>
<li>Fiala, G. J., Schamel, W. W. A., Blumenthal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+%28BN-PAGE%29+for+analysis+of+multiprotein+complexes+from+cellular+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates.</a> J Vis Exp. (48), e2164(2011).</li>
<li>Rais, I., Karas, M., Schägger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+electrophoresis+for+the+isolation+of+integral+membrane+proteins+and+mass+spectrometric+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional electrophoresis for the isolation of integral membrane proteins and mass spectrometric identification.</a> Proteomics. 4 (9), 2567-2571 (2004).</li>
<li>Schägger, H. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/nprot/journal/v1/n1/full/nprot.2006.4.html">Tricine-SDS-PAGE.</a> Nature protocols. 1 (1), 16-22 (2006).</li>
<li>Wittig, I., Braun, H. -P., Schägger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Blue native PAGE.</a> Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).</li>
<li>Eubel, H., Braun, H. -P., Millar, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue-native+PAGE+in+plants%3A+a+tool+in+analysis+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Blue-native PAGE in plants: a tool in analysis of protein-protein interactions.</a> Plant Methods. 1 (1), 11(2005).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Dyballa, N., Metzger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+sensitive+colloidal+coomassie+G-250+staining+for+proteins+in+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Fast and sensitive colloidal coomassie G-250 staining for proteins in polyacrylamide gels.</a> J Vis Exp. (30), (2009).</li>
<li>Turnbull, C. G. N., Lopez-Cobollo, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heavy+traffic+in+the+fast+lane%3A+long-distance+signalling+by+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Heavy traffic in the fast lane: long-distance signalling by macromolecules.</a> New Phytol. 198 (1), 33-51 (2013).</li>
<li>Hall, S. M., Baker, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+composition+of+Ricinus+phloem+exudate%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">The chemical composition of Ricinus phloem exudate.</a> Planta. 106 (2), 131-140 (1972).</li>
<li>Barnes, A., Bale, J., Constantinidou, C., Ashton, P., Jones, A., Pritchard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+protein+identity+from+sieve+element+sap+in+Ricinus+communis+L.+by+quadrupole+time+of+flight+%28Q-TOF%29+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Determining protein identity from sieve element sap in Ricinus communis L. by quadrupole time of flight (Q-TOF) mass spectrometry.</a> J. Exp. Bot. 55 (402), 1473-1481 (2004).</li>
<li>Walz, C., Giavalisco, P., Schad, M., Juenger, M., Klose, J., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+of+curcurbit+phloem+exudate+reveals+a+network+of+defence+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Proteomics of curcurbit phloem exudate reveals a network of defence proteins.</a> Phytochemistry. 65 (12), 1795-1804 (2004).</li>
<li>Walz, C., Juenger, M., Schad, M., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+the+presence+and+activity+of+a+complete+antioxidant+defence+system+in+mature+sieve+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Evidence for the presence and activity of a complete antioxidant defence system in mature sieve tubes.</a> Plant J. 31 (2), 189-197 (2002).</li>
<li>Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phloem+sap+proteins%3A+their+identities+and+potential+roles+in+the+interaction+between+plants+and+phloem-feeding+insects%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Phloem sap proteins: their identities and potential roles in the interaction between plants and phloem-feeding insects.</a> J Exp. Bot. 57 (4), 767-774 (2006).</li>
<li>Ham, B. -K., Brandom, J. L., Xoconostle-Cázares, B., Ringgold, V., Lough, T. J., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polypyrimidine+tract+binding+protein%2C+pumpkin+RBP50%2C+forms+the+basis+of+a+phloem-mobile+ribonucleoprotein+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A polypyrimidine tract binding protein, pumpkin RBP50, forms the basis of a phloem-mobile ribonucleoprotein complex.</a> Plant Cell. 21 (1), 197-215 (2009).</li>
<li>Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotinylation+of+protein+complexes+may+lead+to+aggregation+as+well+as+to+loss+of+subunits+as+revealed+by+Blue+Native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Biotinylation of protein complexes may lead to aggregation as well as to loss of subunits as revealed by Blue Native PAGE.</a> J. Immunol. Methods. 252 (1-2), 171-174 (2001).</li>
<li>Zhang, S., Sun, L., Kragler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phloem-delivered+RNA+pool+contains+small+noncoding+RNAs+and+interferes+with+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The phloem-delivered RNA pool contains small noncoding RNAs and interferes with translation.</a> Plant Physiol. 150 (1), 378-387 (2009).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

체 관 부는 높은 관심의 구획 때문에 photoassimilates에 대 한 주요 수송 경로 구성 하 고 또한 다른 식물 부속9,20,34, 사이 장거리 신호를 위해 근본적 이다 35. 작은 분자 뿐만 아니라 RNAs 단백질 같은 고분자와 체 관 부 유지 보수 신호4,7,8연루 되었습니다. 체 관 부 구성의 분석 대부분의 식물 종에서 체 관 부 샘플에 제한 접근에 의해 제한 됩니다. 곤충 stylet 기술을 광범위 하 게 적용 하지만 실험적 요구 이며 체 관 부 샘플11의 매우 작은 양의 결과. 1 개의 쉬운 기술은 체 관 부 샘플링에 사용 되는 EDTA 촉진 나옴12입니다. EDTA 칼슘 같은 divalent 이온 chelates을 따라서 P 단백질 및 callose로 체 번호판의 폐쇄. 그것은 사용 하기 쉬운, 그러나 손상 된 세포에 의해 오염 하는 경향이 고 샘플 희석. EDTA에 의해 divalent 이온을 없애고 기존 단지의 분석 또한 발생할 수 있습니다. 그러나, 그것은 다양 한 모델 공장 A. thaliana15를 포함 하 여 종에서에서 샘플링이 있습니다. 체 관 부 수액의 자발적인 나옴만 종의 식물의 작은 수에서 발생합니다. 식물 조직10의 중요 한 상해를 포함 하는 침략 적 방법입니다. 우리는 최근 장거리 전송4,8,20공부 모델 종족으로 B. napus 를 설립. 여기, 체 관 부 수액 샘플링할 수 있다 수 작은 절 개에서 부상 효과 오염의 소스를 감소 시키는.
다른 샘플링 기법을 사용 하 여, 다양 한 식물 종에서 체 관 부 샘플의 프로테옴에 최근 몇 년 동안7,8,17,,3637, 조사는 38,39. 이러한 프로테옴 연구에 대 한 단백질 추출 되었고 조건을 변성 시키기에서 시 켰 던 따라서 단백질: 단백질 및 단백질에 대 한 결론을 허용 하지 않습니다: 핵 산 상호 작용 기본 조건 제시. 공동-immunoprecipitation (CoIP) 및 오버레이 분석 표시 주요 ribonucleoprotein 복잡 한 호박40, 체 관 부 수액에 있을 수 있지만 어떤 고분자 복합물 내의 기본 조건에서 존재 증명 되지 이었다는 체 관 부 시스템입니다.
Schägger 그 외 여러분 에 의해 도입 된 블루 기본 페이지 26, 후속 고해상도 젤 전기 이동 법 단계와 함께에서 큰 단백질 복합물의 개별 구성 요소 분리 가능 네이티브 B. napus 의 3D 페이지 분석을 사용 하 여 체 관 부 exudate, 우리 수 최근 보여 여러 높은 분자 무게 단백질: 단백질과 RNP 단지 체 관 부 샘플에 존재 하며 효소 활성화4. 크기 배제 크로마토그래피 같은 단백질 복합물 뿐만 아니라 RNPs를 분리 하는 다른 방법 존재, 하지만 억 페이지에 비해 해상도 관점에서 실패 수 있습니다. 또한, 복잡 한 분리의 합리적인 품질, 크기 배제 열 매트릭스 조사 되 고 전반적으로 복잡 한 분자 무게에 따라 적용할 수 있다. 다른 크기의 단지 분석 따라서 다른 유형의 비용을 집중 하 고 억 페이지로 초점 고성능으로 허용 하지 않는 열을 요구할 것 이다.
B. napus 에서 단지 분석 하 중요 한 단계는 시작 물자로 사용 하는 체 관 부 sap의 총 금액을 포함 합니다. 체 관 부 샘플의 적어도 600 µ L 필요 하 고 5 개의 잘 물결 무늬가 있는 식물에서 얻을 수 있습니다. 3D 페이지 및 BN 북부 blotting에 대 한 체 관 부 샘플의 충분 한 양의 초기 비 엔 젤을 시작할 필요가 있다. 이를 위해, 체 관 부 샘플은 집중 잘하고 적어도 20 ~ 30 µ g 단백질의 각에 로드할 수 있습니다 때까지 동일한 샘플의 triplicates을 동시에 실행 됩니다. 너무 낮거나 너무 높은 농도 단지 (그림 3)의 탐지를 줄일 수 있습니다. 체 관 부 샘플 필요 얼음에 반응 튜브에 수집 되며 단백질 저하와 회전율을 피하기 위해 나중에 사용 하기 위해 냉동 저장 한다. 프로 테아 제 저 해제 분석 하 고, 모든 체 관 부 proteomes에서 발견 되었습니다 하지만 또한 완전히 활성 프로테아좀 B. napus4의 체 관 부에 설명 했다. 또한, 볼륨 및 체 관 부 샘플의 구성 샘플링 시간-포인트와10환경 조건 따라 다릅니다. 따라서 유사한 조건 하에서 하루 중 같은 시간에 수집을 배려를가지고 한다. 스트레스 치료 (예: 가뭄) 수집 수 체 관 부의 양을 줄일 수 있습니다. 식별 하려면 단일 단백질 질량 분석에 의해, 제한 가능한 각 질 오염 입고 장갑 항상 필수입니다. 각 질과 질량 spec 분석 중 추가 신호 리드 저해 단백질 식별. 더 높은 전압 또는 온도에 10 억 페이지를 실행 깨지기 쉬운 단지의 분해 될 수 있는 젤의 열 발생할 수 있습니다.
여기에 제시 된 프로토콜은 단백질: 단백질 복합물의 분석에 적합 합니다. 우리는 또한 동시에 단지에 포함 된 특정 RNAs를 감지 하 사용할 수 있습니다 보여줍니다. 이를 위해, 우리는 최근 북부 blotting410 억에 대 한 프로토콜 도입. RNAs는 RNAse 오염에 의해 저하 하는 경향이 있다. 이러한 성능 저하를 제한 하려면 DEPC 처리, 물 사용 되어야 한다.
제시 방법의 주요 제한 포함 마이그레이션 동작 따라 크기, 모양에 그리고도 단지31의 posttranslational 수정 이후 억 페이지를 구분 하는 단백질 복합물의 분자량의 추정 41. RNP 복합물의 크기 추정은 마이그레이션 동작에 핵 산의 영향으로 훨씬 더 복잡 합니다. 그것은 또한 하지 막을 수 있습니다 단지 같은 크기의 공동 한 하나의 밴드에서 마이그레이션할. 이 복잡 한 구성의 잘못 된 예측 발생할 수 있습니다. 따라서 상호 보완적인 기술로 관찰 된 상호 작용을 확인, 예를 들어 기능 분석 실험4, 필요할 수 있습니다. 또한 단백질만 약하게 또는 뚜렷이 고분자 복합체에 관련 된 사용 BN 버퍼에서 손실 될 수 있습니다. 이 방지 하려면 샘플 가교 화, 부작용으로 이어질 수 있습니다 무엇 또는 단백질 식별을 방지할 수 있습니다 또는 버퍼 상태를 최적화할 수 있습니다.
클래식 2D-페이지, 달리의 요소 및 SDS 페이지 hydrophobicity 및 전자 점 (pI) 및 분자량 28, 대신 분자량에 따라 분리 수 있습니다 조합과 단백질의 분리를 제한 하지 않는 한 특정 pI 범위입니다. 클래식 비슷한 2D 페이지, 분리 단백질 단일 관광 명소를 볼 수 있지만 대각선에 선 4,28 (, 그림 5 그림 6). 반면에 친수성 단백질 더 선28아래 찾을 수 있습니다 더 많은 소수 성 단백질이이 대각선 위의 관광 명소에 나타납니다. 이 프로토콜에 사용 된 polyacrylamide 농도 사이 25 ~ 80 kDa 단백질 잘 별도 것입니다. 작은 또는 큰 단백질의 분리는 polyacrylamide 있도록 농도 변화 될 수 있다 또는 그라데이션 젤 3 차원에서 사용할 수 있습니다. 3D-페이지 (그림 6)으로 구분 된 복잡 한 IV (그림 3)의 구성 요소, 트립 신, 소화 및 질량 분석에 의해 분석 밖으로 절단. 이 결과 여러 tRNA ligases의 식별. 다른 단지의 구성 요소 되었습니다 4최근 출판. 우리의 3D 페이지는 다른 ligases, 즉 aspartate, 아스파라긴, 트레오닌, 라이 신, 글리신 ligases, 유사한 분자 무게 (표 3)와 분리를 사용할 수 있습니다. 우리 복잡 한 4 내에서 잠재적으로 바인딩된 tRNA를 감지할 수 메티오닌 tRNA 전용 프로브를 사용 하 여, 하지만 전체 길이 tRNA 또는 tRNA 조각 복잡 한에 있는 경우 사용 하는 프로브와 차별 수 없습니다. 핵 산 단지 내에 정말 바인딩된와 공동 마이그레이션 있다면, 프로 테아 제 소화 체 관 부 수액 확인을 샘플 수 있습니다 적합 한 마이그레이션 컨트롤 역할을 합니다.
그것은 거의 대부분의 구성 요소는 전체 리보솜으로 신장 요인의 체 관 부 샘플4,7에서 발견 되었습니다 이후 단백질 번역 체 관 부 체 튜브 내에서 발생할 수 있습니다 이전 추측 하고있다. TRNA와 tRNA ligases의 우리의 발견이이 아이디어를 지 원하는 것으로 보인다. 그러나, tRNA 조각 호박에서 체 관 부 샘플에 존재는 번역42 의 강력한 억제제로 표시 되었습니다 그리고 기능적인 리보솜4, 번역 자리를 차지할 수 없는 제안에 결 석 것 같다.
함께 찍은, 여기에 제시 된 프로토콜 기본 단백질: 단백질 및 체 관 부 샘플 및 분리에서 심지어 RNP 복합물의 분리 및 높은 해상도 가진 그들의 개별 부품의 식별 수 있습니다. 이 방법의 응용 프로그램 소설 단백질 및 체 관 부 샘플에서 RNP 단지 검색 하 고 따라서이 고도로 전문화 된 공장에 새로운 기능을 명료 하 게 수 있습니다.

체 관 부의 장거리 도관 더 높은 식물에 있는 유기 양분의 할당에 대 한 필수적입니다만 또한 성장 및 개발, 병원 체 방어 및 불리 한에 적응에 대 한 중요 한 많은 다른 프로세스를 규제에 참여 환경 조건입니다. 이온, phytohormones, 또는 스스로 대사 산물과 같은 작은 이펙터, 게다가 RNAs 단백질 같은 고분자는 잠재적인 신호도 최근 등장 했습니다.
연구는 단백질의 체 관 부 로드 크기 및 동반자 셀 (CC) 연결 기 공 plasmodesmal 단위의 크기 제외 제한 (SEL)에 의해 제어 요소 (SE)에 10의 범위에 일반적으로 있는 체 하 고 > 67 kDa1 , 2 , 그러나 3., 이러한 크기 제한이 더 큰 단백질 및 단백질에도 불구 하 고 단지 크기 제외4의 아이디어에 도전 하는 체 관 부 시스템 내에서 발견 되었습니다 그리고 se CC에서 단백질도 일반적인 손실 되었습니다 제안된5 .
큰 뿐 아니라 multiprotein ribonucleoprotein 단지6셀 구조적 무결성을 유지 하 고 생 합성에 중추적인 역할을 한다. 체 관 부-모바일 단백질-단백질 및 ribonucleoprotein 단지4,7, 존재 증거가 있다 하지만 날짜 그들의 기능에 대 한 약간은 알려진 다. 체 관 부 체 요소에서 단백질: 단백질과 RNP 단지 장거리 전송 및/또는 신호8,9연루 되었습니다. 환경 변화에서 그들의 구성 공부 translocated 단지의 기능을 해명 하거나 스트레스 조건이 필요 합니다. 이 위해 네이티브 단지 고립 되 고 그들의 구성 요소는 충분 한 해상도로 분리 될 필요가.
높은 분자 무게 단지는 체 관 부를 분리, 그것은 충분 한 품질 및 수량에 sap 샘플을 얻기 위해 첫 번째 필요. 체 관 부 샘플링에 사용할 수 있는 기술 관심의 식물 종에 따라 달라 집니다. 체 관 부 수액을 얻기 위해 세 가지 주요 방법 존재 10: 곤충 stylectomy11, EDTA 촉진 나옴12, 그리고 자발적인 있고13.
애기 thaliana (A. thaliana), 실험실, 전세계의 주요 모델 공장에서에서 체 관 부 샘플만 EDTA 용이 있고 또는 진딧물 stylectomy,1415에 의해 얻어질 수 있다. 두 방법 모두 매우 희석된 체 관 부 수액 또는 매우 낮은 샘플 금액으로 이어질. EDTA 용이 있고 또한 오염 하는 경향이 하 고 실제 체 관 부 구성16를 나타내지 않을 수 있습니다. 자연 체 관 부 나옴 어디 공장 부품을 잘라 쉽게 수집된13,,1718수 있는 체 관 부 수액의 자발적 방출에 리드, cucurbits, 르 피나 스 또는 유카, 같은 종 식물로 제한 됩니다. 19. 우리는 최근 체 관 부 분석을 위한 적합 한 모델 시스템으로 oilseed 강간 (브라 시카 napus)를 설립, 이후 A. thaliana 의 가까운 친척 및 체 관 부 수액의 여러 microliters 표시 되어 작은 절 개에서 얻을 수 있습니다. 고 순도4,,820의 수 있습니다. 또한, B. napus 게놈 시퀀스 201421에 릴리스 되었습니다.
진딧물 stylectomy 제외한 모든 체 관 부 수집 방법 설명 샘플링, 사이트에서 조직 주변의 손상 포함 하 고 체 관 부 수액의 구성은 부상에 대 한 응답에서 변경 될 수 있습니다. 따라서 샘플링 방법 적용에 체 관 부 샘플의 품질을 확인 하려면 필수적입니다. 예: RNase 활동22,23, Rubisco8,24에 대 한 뇌관으로 RT-PCR 또는 설탕의 분석의 결정에 의해 수집 된 체 관 부 수액의 품질 관리를 위한 다른 방법이 있다 컴포지션8.
크기 배제 크로마토그래피, 자당 밀도 ultracentrifugation, 또는 명백한 분자량 커트로 세포 막을 통해 여과 샘플을 포함 하 여 격리 하 고 분리 단백질 단지 다른 방법을 적용할 수 있습니다 오프. 그러나, 이러한 접근은 높은 해상도 허용 하지 않습니다. 라는 블루 기본 페이지 (비-), Schägger 외에의해 처음으로 설명 하는 기법. 25, 해상도 측면에서 우량 하다. 그것은 성공적으로 다양 한 세포 또는 세포 lysates 및 그들의 상대 나타났는데26,27큰 네이티브 단백질 복합물의 분자 무게를 결정 하기 위해 사용 되었다.
더 명료 단백질 복합물의 복잡 한 구성, 그것은 복잡 한 부품의 완전 한 해체로 이어지는 조건을 변성 시키기에서 개별 구성 요소를 분리 하는 데 필요한. 이 더 높은 해상도, 전자 초점 (IEF)의 두 번째 차원으로 SDS 페이지30 의 third dimension와의 후속 식별을 달성 하기 위해, 또는 SDS 페이지 28,29 의 두 번째 차원에 의해 달성 될 수 있다 단백질 질량 분석을 사용 하 여입니다.
이 프로토콜에서 순수 체 관 부 수액 B. napus 식물에서의 샘플링 및 트리 스-Tricine-우 레 아-페이지와 SDS 페이지 BN-페이지를 결합 하는 3D 전기 이동 방식을 사용 하 여 이러한 체 관 부 샘플에서 단백질 복합물의 분석을 설명 합니다. 분리 된 단백질 복잡 한 구성 요소는 이후 질량 분석을 사용 하 여 식별 됩니다. 또한, 소개 블루 네이티브 북부 blotting 큰 RNP 단지4, RNAs의 탐지를 허용 하는 방법으로는 접근의 적용을 확장 합니다.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 반응 튜브</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>SDS PAGE용 10 웰 빗, 두께 1 mm</td><td>BioRad</td><td>1653359</td><td></td></tr><tr><td>2-프로판올</td><td>AppliChem</td><td>131090</td><td></td></tr><tr><td>30 % 아크릴아미드-비스아크릴아미드 용액(29:1) 용액</td><td>BioRad</td><td>1610156</td><td></td></tr><tr><td>30 % 아크릴아미드-비스아크릴아미드 용액(37.5:1) 용액</td><td>BioRad</td><td></td><td></td>1610158</tr><tr><td>96 % 에탄올</td><td>Carl Roth</td><td>P075</td><td></td></tr><tr><td>아세트산</td><td>Carl Roth</td><td>6755</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>알루미늄 설페이트 - (14-18) -수화물</td><td>AppliChem</td><td>141101</td><td></td></tr><tr><td>암모늄 퍼 옥소 이황산염 (APS)</td> <td>Carl Roth</td><td>9592.3</td><td></td></tr><tr><td>Bis-Tris</td><td>AppliChem</td><td>A3992</td><td></td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>AppliChem</td><td>A2940</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol blue</td><td>AppliChem</td><td>A2331</td><td></td></tr><tr><td>원심 농축기 예: Vivaspin 500 (Mwco 10 kDa)</td><td>Sartorius</td><td>VS0102</td><td></td></tr><tr><td>화학발광 핵산 검출 모듈 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89880</td><td></td></tr><tr><td>크로마토그래피 논문 예: 3mm CHR</td><td>Whatman</td><td>3030-153</td><td></td></tr><tr><td>CoolBox M30 System</td><td>Biocision</td><td>BCS-133</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie brilliant Blue G-250</td><td>AppliChem</td><td>A3480</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td><td>AppliChem</td><td>A0881</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>AppliChem</td><td>A1101</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>AppliChem</td><td>A3778</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 abs.</td><td>AppliChem</td><td>A3693</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)</td><td>AppliChem</td><td>A1103</td><td></td></tr><tr><td>겔 이미징 시스템예: Chemidoc Touch</td><td>BioRad</td><td>1708370</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1kb plus</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SM1331</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>AppliChem</td><td>141339</td><td></td></tr><tr><td>글리신</td><td>AppliChem</td><td>131340</td><td></td></tr><tr><td>가열 블록 TS1</td><td>Biometra</td><td>846-051-500</td><td></td></tr><tr><td>혼성화 오븐 eg. GFL 혼성화 인큐베이터 7601</td><td>GFL</td><td>7601</td><td></td></tr><tr><td>피하 주사 바늘 (0.8 mm)</td><td>B Braun</td><td>4658309</td><td></td></tr><tr><td>IPG 젤 빗, 두께 1 mm</td><td>BioRad</td><td>1653367</td><td></td></tr><tr><td>RNA 라벨링 예: Biotin 3'최종 DNA 라벨링 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89818</td><td></td></tr><tr><td>네이티브 그래디언트 젤 e.g. Novex NativePAGE 4&ndash; 16% Bis-Tris 단백질 겔</td><td>Invitrogen</td><td>BN1002BOX</td><td></td></tr><tr><td>나일론 멤브레인 예: Hybond-N+</td><td>Amersham Pharmacia</td><td>RPN203B</td><td></td></tr><tr><td>Ortho-phosphoric acid</td><td>Carl Roth</td><td>6366.1</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler prestained protein ladder</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>겔 전기영동용 전원 공급 장치 EPS</td><td>Amersham Pharmacia</td><td>18-1130-01</td><td>GE Healthcare</td></tr><tr><td>RNA Cleanup Kit</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>Semi dry blot e.g에서 구할 수 있습니다. Fastblot 43B semi dry Blot</td><td>Biometra</td><td>846-015-100</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨 (NaCl)</td><td>AppliChem</td><td>A1149</td><td></td></tr><tr><td>도데실황산나트륨 (SDS)</td><td>AppliChem</td><td>142363</td><td></td></tr><tr><td>cDNA 합성 예: RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K1621</td><td></td></tr><tr><td>테트라메틸에틸렌디아민(TEMED)</td><td>AppliChem</td><td>A1148</td><td></td></tr><tr><td>트리신</td><td>AppliChem</td><td>A3954</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>AppliChem</td><td>A1086</td><td></td></tr><tr><td>트라이소듐시트레이트 이수화물</td><td>AppliChem</td><td>A3901</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol 시약</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>ULTRAhyb 초고감도 혼성화 버퍼</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM8670</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>AppliChem</td><td>A1360</td><td></td></tr><tr><td>UV Crosslinker 예: Stratalinker 2400</td><td>Agilent</td><td>NC0477671</td><td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>수직 전기영동 장치 예: XCell SureLock 미니 셀 또는 미니 Protean III 시스템</td><td>Thermo Fisher Scientific 또는 BioRad</td><td>EI0001 또는 1658004</td><td></td></tr><tr><td>와이퍼예: KIMWIPES Delicate 작업용 와이퍼</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td></td></tr></tbody></table>

체 관 부 수액 샘플링 브라시카 napus 단백질 및 ribonucleoprotein 단지의 3d-페이지에서

Phloem Sap Sampling from Brassica napus for 3D-PAGE of Protein and Ribonucleoprotein Complexes

더 높은 식물의 체 관 부를 샘플링은 종종 힘들고 식물 종에 크게 의존입니다. 그러나, 변성 시키기 조건에서 프로테옴 연구 다른 식물 종에 달성 될 수 있었다. 네이티브 단백질: 단백질과 단백질: 체 관 부 샘플에서 핵 산 단지 아직 부족 하 게 분석 된, 하지만 그들은 수도 있습니다 중요 한 역할을이 전문된 구획의 유지 보수 또는 장거리 신호. 큰 분자 어셈블리 블루 기본 젤 전기 이동 법 (BN-페이지)를 사용 하 여 격리 된 수 있습니다. 후속 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS-페이지)에 의해 그들의 단백질 구성 요소를 분리할 수 있습니다. 그러나, 유사한 분자 무게 단백질 공동 마이그레이션, 무슨 질량 분석에 의해 단백질 식별을 방해 수 있습니다. 두 개의 다른 변성 젤 전기 이동 법 단계, 즉 트리 스-Tricine-요소 및 SDS 페이지 BN-페이지 조합 그들의 화란/hydrophobicity에 따라 단백질의 추가 분리를 가능 하 게 하 고 따라서 해상도 성공 증가 단백질 식별. 그것은 심지어 posttranslational 수정만 다른 단백질을 구별 수 있습니다. 또한, 블루 네이티브 북부 blotting 고분자 복합물의 RNA 구성 요소를 식별 하기 위해 적용할 수 있습니다. 우리는 우리의 프로토콜 단백질 및 RNA 구성 요소 네이티브 단백질: 단백질 및 체 관 부 샘플에서 발생 하는 ribonucleoprotein (RNP) 단지의 해명 하기 적합 하다는 것을 보여줍니다. 파란색을 결합 하 여 두 개의 다른 변성 페이지 단계 기본 페이지 큰 단백질 복합물의 다른 종류를 구분 하는 데 도움이 수 있습니다 그리고 또한 질량 분석에 의해 그들의 구성 요소 식별 증가 속도 수 있습니다. 또한, 프로토콜은 동시에 단일 단백질 복합물 내의 잠재적으로 바인딩된 핵 산을 검출 하기 위하여 충분히 강력한입니다.

여기에 우리가 큰 네이티브 단백질: 단백질 및 단백질의 단백질 구성을 분석 하는 프로토콜을 제시: oilseed 강간에서 핵 산 복합물 (B. napus) 체 관 부 exudate 블루 결합 3D polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (페이지) 방식을 사용 하 여 네이티브 대량 spectrometric 식별 뒤의 변성 페이지 두 개 (10 억).

체 관 부 수액 샘플링 브라시카 napus 단백질 및 Ribonucleoprotein 단지의 3D-페이지에서

Sampling the phloem of higher plants is often laborious and significantly dependent on the plant species. However, proteome studies under denaturing ...

이 3D-PAGE 절차의 전반적인 목표는 각각의 핵산 및 단백질 성분의 식별과 함께 Brassica napus ploem 수액에서 단백질 및 리보핵단백질 복합체를 분리하는 것입니다. 이 방법은 생화학 및 식물 생리학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 응력을 받는 체관부 복합체의 조성을 분석할 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 순수한 체관부 수액을 수집하고 핵산과 단백질 성분을 동시에 분석할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 지방종자 유채의 체관부 시스템 내에서 단백질 단백질 및 단백질 핵산 상호 작용에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 박과, 루핀 및 유카와 같은 다른 식물의 체관부 분석에도 적용할 수 있습니다. 이 방법에 대한 아이디어는 특정 체관부 단백질에 대한 단백질과 RNA 상호 작용 파트너를 식별하려고 했을 때 처음 떠올랐습니다.먼저 8주 된 B.napus 식물의 꽃차례 줄기에 0.8mm 피하 주사 바늘을 사용하여 여러 번 구멍을 뚫습니다. 충분한 체관부 수액을 얻기 위해 같은 식물과 다른 식물에 여러 개의 다른 꽃차례 줄기에 구멍을 뚫습니다. 각 부상 부위의 첫 번째 방울을 여과지로 닦아냅니다.첫 번째 방울을 제거한 후 피펫을 사용하여 나머지 방울을 수집합니다. 그리고 미리 냉각된 원뿔형 1.5ml 반응 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 수집된 삼출물은 얼음이 없는 냉각 시스템을 사용하여 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오.더 이상 방울 형성이 관찰되지 않을 때까지 방울을 계속 수집하되 1시간을 넘지 마십시오. 다음으로, 분자량이 10, 000 달톤으로 절단된 원심 농축기에 체관부 샘플을 추가하고 초기 부피의 약 1/6로 농축합니다. 다음, 4 섭씨 온도 및 20에 집중한 표본을 분리기, 먼지 입자를 제거하기 위하여 적어도 15 분 동안 000 g.블루 네이티브 PAGE를 수행하려면 겔 챔버를 조립합니다. 그리고 진한 파란색 음극 완충액 B를 절반에 추가하고 음극 완충액으로 우물을 세척합니다. 웰당 20-30마이크로그램의 농축된 단백질 샘플을 상업용 Bis-Tris 복사 겔에 최소 3회 이상 로드합니다.챔버를 음극 및 양극 버퍼로 채우고 샘플이 겔의 1/3을 통과할 때까지 섭씨 4도 및 150볼트에서 겔을 실행하며 20-30분이 소요됩니다. 짙은 파란색 음극 버퍼 B를 연한 파란색 음극 버퍼 B 1/10으로 교환하는 실행을 일시 중지합니다. 실행을 다시 시작하고 파란색 전선이 젤에서 용리되기 시작할 때까지 계속하면 120-180분이 걸립니다.천연 블루 겔에서 전체 겔 레인을 잘라낸 다음 반 건조 블로팅으로 나일론 멤브레인으로 옮기고 멤브레인의 위쪽 및 아래쪽 젤 테두리를 연필로 표시합니다. 블로팅 후 DEPC 처리된 물로 멤브레인을 세척하고 두 장의 여과지 사이에 끼워 건조시킵니다. 그 후, 120, 000 마이크로 줄의 적용 에너지로 얼룩진 멤브레인의 UV 교차 연결을 수행합니다.이제 혼성화 오븐에서 섭씨 68도에서 60분 동안 6밀리리터의 혼성화 완충액으로 UV 가교 결합막을 사전 혼성화합니다. 4마이크로리터의 3-프라임 비오틴화 프로브를 함유한 1ml의 혼성화 완충액을 멤브레인에 추가로 추가합니다. 그런 다음 하룻밤 동안 프로브로 멤브레인을 배양하면서 혼성화 오븐을 섭씨 68도에서 37도로 냉각합니다.다음 날에는 실온에서 5분 동안 2x SSC 및 0.1% SDS가 포함된 버퍼로 멤브레인을 세척하여 불특이적으로 결합된 프로브를 제거합니다. streptavidin HRP conjugate 및 luminol을 horseradish peroxidase 기질로 사용하여 멤브레인에서 3-prime biotinylated probe를 검출하여 민감한 화학발광 반응을 일으킵니다. 파란색 네이티브 젤에서 단일 밴드를 잘라냅니다.1.5 밀리리터 원뿔형 반응 튜브에서 평행 레인으로 실행되는 샘플의 밴드를 결합하여 복잡한 단백질의 추가 농도를 달성합니다. 12% Tris-Tricine 요소 젤을 준비하려면 두 개의 유리판 사이에 10ml의 젤 용액 A를 붓고 이소프로판올로 오버레이합니다. 중합 후에, 이소프로판올을 제거하고, 젤에 젤 해결책 B의 2개에서 3 밀리리터를 추가하고, 10 우물 빗을 삽입하십시오.절제된 겔 조각의 평형을 위해 1ml의 2x SDS 샘플 버퍼를 반응 튜브에 추가합니다. 실온에서 10분 동안 샘플을 배양한 후 섭씨 95도의 가열 블록에서 약 1분 동안 가열합니다. 그런 다음 샘플을 실온에서 15분 동안 배양합니다.그런 다음 동일한 복합체를 나타내는 여러 개의 평형 겔 조각을 하나의 단일 겔 포켓에 쌓습니다. 겔 챔버를 조립한 후 150볼트에서 45-60분 동안 양극 및 음극 주행 버퍼를 사용하여 전기영동을 수행합니다. 완료되면 전체 젤 레인을 절제합니다.절단된 젤 레인을 산성 완충액에서 20분 동안 배양합니다. 그런 다음 pH 6.8에서 125 밀리 몰 Tris-HCL에서 다시 20 분 동안 평형을 이룹니다. lanely에 따라 15%SDS 분리 젤 해결책을 따르십시오.겔이 응고되면 이소프로판올을 제거하고 4% 스태킹 겔 용액 3밀리리터를 첨가한 다음 IPG 겔용 특수 빗을 삽입합니다. 응고 후에, 평형 겔 선을 SDS 젤로 옮기고, bromophenol 파랑의 자취로 보충된 1x SDS 운영하는 완충액에 있는 0.5%agarose를 가진 젤을 덮으십시오. 겔 챔버를 조립한 후 150볼트에서 60분 동안 겔을 작동시킵니다.완료되면 후속 질량 분석 분석을 위해 콜로이드 Kumasi 용액으로 겔을 염색합니다. 마지막으로, 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 비행 시간 분광법을 사용하여 보이는 단백질 반점을 분석합니다. 순수 체관부 샘플에서 얻은 대표적인 결과가 여기에 묘사되어 있습니다.오염되지 않은 체관부 샘플은 티오레독신 나이에 대한 가시적인 띠를 보여주는 반면, RuBisCO와 꽃가루 코트 단백질에 대한 신호는 관찰되지 않습니다. 적어도 4개의 주요 단백질 복합 띠는 B.napus phloem sap의 BN PAGE 이후에 보이게 됩니다. 체관부 수액의 농도가 너무 낮거나 너무 높으면 복합체를 명확하게 분리 할 수 없습니다.3D PAGE에서는 요소 및 SDS-PAGE 겔의 단백질 이동 거동이 다르기 때문에 고분해능 분리가 관찰됩니다. 일반적으로 단일 복합체에 속하는 단백질은 겔을 가로질러 대각선으로 볼 수 있습니다. 이 선 위의 단백질은 소수성이 증가하는 반면 선 아래의 단백질은 친수성이 더 높습니다.BN 노던 블로팅(northern blotting)은 특정 tRNA가 하나의 특정 복합체에만 존재한다는 것을 보여줍니다. 질량 분석 결과, 이 복합체는 주로 BN 노던 블로팅(northern blotting)에 의해 발견된 tRNA 결합 활성을 확인하는 tRNA 리가아제를 포함하고 있는 것으로 나타났습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 3일 안에 완료할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 질량 분석 분석을 방해할 수 있는 카로틴 오염을 최소화하기 위해 장갑과 실험실 가운을 착용하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 수집된 체관부 수액을 사용한 자이모그램 및 효소 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 복잡한 활성 및 억제 연구와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 식물 과학 분야의 연구자들이 다양한 식물 종의 체관부 샘플에서 다중 소단위 복합체를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.이 비디오를 시청한 후에는 Brassica napus 식물에서 체관부 수액을 분리하는 방법과 단백질 단백질 및 단백질 핵산 복합체를 분리하고 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. SDS, 아크릴아마이드 및 TMET로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 장갑과 실험실 가운을 착용하고 후드 아래에서 작업하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

공간적 특정 phytochrome 반응의 분자 기초는 조직과 기관이 특정 phytochrome 결함을 전시 유전자 변형 식물을 사용하여 조사 중입니다. 특정 세포의 분리는 microarray 분석에 의해 다음 정렬 것은 공간적 특정 phytochrome 응답에 관련된 유전자를 확인하기 위해 활용되고있는 형광 활성화된 세포로 유도 phytochrome 발색단 고갈을 전시.

에서 외과를 이용한 셀 타입 특정 표현식 프로파일을 사용하여 조직 및 장기 특정 Phytochrome 응답 조사 Arabidopsis thaliana</em

우리는 공장에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 테스트하는 기술을 개발했습니다. 노란색 형광 단백질 (YFP은) 2 비 중복 조각으로 분할합니다. 각 조각은 융합 단백질의 표현을 활성화, 게이트웨이 시스템을 통해 관심의 유전자에 프레임에 복제됩니다. 심리 단백질이 상호 작용을 때 YFP 신호의 Reconstitution에만 발생합니다.

게이트웨이 가능 Bimolecular의 형광 Complementation (BiFC) 시스템을 사용하여 공장에서 단백질 상호 작용의 검출

우리는 여기에서 식물 단백질 복합체의 정제 및 특성에 대한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 단지 내에 하나의 단백질을 immunoprecipitating에 의해, 그래서 우리는 그것의 번역 후 변형과 상호 작용하는 파트너를 식별 할 수있는 것을 보여줍니다.

식물 단백질 복합체의 번역 후 변형의 확인

기술 비교, 정량 프로테오믹스 방법은 서로 다른 조건에서 multiprotein의 단지의 조성에 대한 통찰력을 얻는 것을 목표로하고 유 전적으로 서로 다른 변종을 비교하여 보여줍니다. 정량 분석​​을 위해 자당 밀도 구배 상이한 분획 같은 부피는 질량 분석법에 의해 혼합되고 분석된다.

multiprotein의 단지의 비교 분석을위한 새로운 접근 방식을 기반으로<sup&gt; 15</sup&gt; N 대사 라벨링 및 정량 질량 분석

체관부 수액의 조성뿐만 아니라 로딩 및 장거리 전송 메커니즘의 지식은 식물의 개발과 스트레스 / 병원균 응답 및 전송 동화의 장거리 신호의 이해를 위해 필수적이다. 이 원고는 EDTA-촉진 방법을 사용하여 체관의 삼출물의 컬렉션을 설명합니다.

의 수집과 분석<em&gt; 애기 장대</em&gt; 사부는 EDTA-촉진 방법을 사용하여 삼출물

표적 단백질 분해는 세포 기능의 주요 조절기구를 나타낸다. 그런 다음 26S 프로 테아 좀에 대해 같은 분자 "태그"봉사하는 표적 단백질에 polyubiquitin 체인을 부착 보존 유비퀴틴 - 프로 테아 좀 경로를 통해 발생합니다. 여기, 우리는 단백질의 프로 테오 저하에 대한 간단하고 신뢰할 수있는 세포가없는 분석을 설명합니다.

식물의 셀없는 시스템에서 프로 테오 저하 시금

이 프로토콜은 프랑스 콩 식물(Phaseolus vulgaris)을 모델 예로 사용하여 식물 잎에서 아포플라스트 세척액을 최적화하여 추출하는 방법을 자세히 설명합니다.

공장에서 유체 Apoplastic의 추출을위한 침투-원심 분리 기술을 사용하여 잎 위 Phaseolus 심상 예를 들어

여기, 우리는 Arabidopsis thaliana 엽초 엽 원형체에 적용된 상호 작용 캡처 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 생체 내 UV 가교 결합에 비판적으로 의존하며 생리 환경으로부터 식물 mRNA 결합 단백질의 분리 및 동정을 허용합니다.

식물 원형질에서 mRNA Interactome 캡처

단백질 대사 산물 및 단백질-단백질 상호 작용은 모든 세포 기능에 중요 한. 여기, 우리는 선택의 이러한 상호 작용 단백질으로의 병렬 분석을 허용 하는 프로토콜을 설명 합니다. 우리의 프로토콜 식물 세포 배양에 대 한 최적화 되었습니다 및 질량 분석 기반 단백질 및 대사 산물 검출 친 화력 정화를 결합 했다.

2 1: 원스텝 단백질 단백질과 단백질 대사 산물 단지의 병렬 분석에 대 한 친 화력 정화

여기에 제시된 인포프로테오믹 접근법, 즉 아라비도시스 인포프로테오움의 높은 처리량과 깊은 커버리지를 제공하는 추출 팁 기반인 인포프로테오믹을 이동합니다. 이 접근은 아라비도시스에서 삼투압 신호의 개요를 설명합니다.

애기독증에서 삼투압 신호 프로파일링을 위한 인포프로테오믹 전략

본 프로토콜은 플라스모디오포라 브라시카에 의해 유도된 담즙의 조직학적 관찰을 위한 최적화된 방법을 기술한다. 배축의 Vibratome 섹션은 질병 진행 동안 전사 인자와 식물 호르몬의 관여를 연구하기 위해 형광 이미징 전에 제거됩니다. 이 프로토콜은 수지 임베딩 한계를 극복하여 형광 단백질의 플란타 시각화를 가능하게 합니다.

Plasmodiophora brassicae에 대한 유전자 발현 및 생리적 반응의 변화를 시각화하기 위해 투명화와 형광 현미경을 결합

배우세요 Brassica napus 체관부 수액에서 단백질 및 리보핵단백질 복합체를 3D-PAGE로 분리하고 질량분석으로 동정하는 방법을. 식물 신호전달 및 장거리 수송 연구에 활용됩니다.

체 관 부 수액 샘플링 브라시카 napus 단백질 및 Ribonucleoprotein 단지의 3D-페이지에서

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