פרופיל תזמון שכפול ה-DNA באמצעות דג זברה כמערכת מודל In Vivo

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור מפות תזמון שכפול DNA של גנום שלם מעוברי דג זברה בשלבי התפתחות שונים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי מחזור התא וביולוגיה של כרומטין, כגון כיצד שינויים בכרומטין המתרחשים במהלך ההתפתחות העוברית יכולים להשפיע על התחלת מזלגות שכפול DNA. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא ממפה שינויי שכפול המתרחשים in vivo בשלבים מוגדרים של התפתחות עוברית.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי האופן שבו שכפול ה-DNA משתנה במהלך התפתחות דג הזברה, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות או אורגניזמים מודלים, כגון טוניקטים, צפרדעים וזבובים. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו עשויים להיאבק מכיוון שנדרש תרגול מסוים כדי ליצור תרחיפים חד-תאיים מעוברי דג הזברה. בלילה שלפני איסוף העוברים, הכניסו עשרות בוגרים מתרבים למכלי רבייה, תוך שימוש במספר שווה של זכרים ונקבות.

בהתאם לניסוי, השתמש באחת מאסטרטגיות הגידול הבאות. עבור אסטרטגיית הרבייה הראשונה, הניחו כמה זכרים ונקבות דגי זברה במיכלי רבייה בודדים, והשתמשו במפריד כדי להפריד בין הזכרים לנקבות. אם משתמשים בגישה זו, הקימו מיכלי רבייה רבים ושונים ואגד את העוברים מכל אחד מהם כדי להבטיח שהשונות הביולוגית מייצגת את האוכלוסייה.

לאסטרטגיית רבייה מספר שתיים, שלבו עשרות דגי זברה זכרים ונקבות במיכל רבייה גדול. השתמש באסטרטגיה זו כל עוד יש מספר גדול מספיק של עוברים. סביר להניח שהם הגיעו ממגוון מייסדים ולכן הם מייצגים גנטית את האוכלוסייה.

כדי לבצע הזדווגות מתוזמנת, התחל ברגע שמחזורי האור מתחילים בבוקר. אפשר לדגים להתרבות במים רדודים לתקופה של 10 דקות, עם תחתית מזויפת לעוברים לברוח דרכה. לאחר 10 דקות, אספו עוברים על ידי שפיכתם דרך מסננת ושימוש בבקבוק כביסה כדי לשטוף אותם לצלחת של 10 סנטימטרים.

אסוף את כל העוברים שנאספו באותה נקודת זמן, סמן אותם עם זמן האיסוף והניח אותם מיד באינקובטור בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס. כדי להבטיח איסוף עוברים המתפתחים באופן סינכרוני, חיוני לאסוף קבוצות של עוברים כל 10 דקות. זה חשוב במיוחד בשלבים המוקדמים ביותר של התפתחות עוברית.

ניתן לצפות למאות עוברים מזוג מזדווג יחיד ביום. אפשר לבוגרים להתרבות במחזורים של 10 דקות עד שמספר העוברים המתקבלים יהיה פחות מ-20. כשעה עד שעה וחצי לאחר האיסוף, כדי למיין עוברים, להוציא אותם מהאינקובטור, להתבונן בהם במיקרוסקופ מנתח ולמיין אותם כדי להסיר ביציות מתות ולא מופרות.

ספרו את העוברים, והניחו אותם בצפיפות של 100 עוברים לצלחת של 10 סנטימטרים. הוסף מדיום E3 טרי, והחזיר את העוברים לחממה של 28.5 מעלות צלזיוס. כאשר העוברים מגיעים לשלב ההתפתחות הרצוי, יש לוודא את השלב מורפולוגית תחת מיקרוסקופ אור לפי שלבי ההתפתחות העוברית של דג הזברה.

אם העוברים הם 48 hpf או פחות, העבירו עד 1500 עוברים מבוימים לצינור חרוטי של 15 מיליליטר והשתמשו ב-E3 כדי לשטוף אותם מספר פעמים. על כל 100 עוברים, הוסיפו מיליליטר אחד של E3 ו -20 מיקרוליטר של תמיסת פרונאז וערבבו בעדינות. ניתן לפרק עד 1500 עוברים בצינור יחיד עם 15 מיליליטר E3. הניחו את הצינור על צידו, וסדרו את העוברים בשכבה אחידה כדי להבטיח יחס משטח לנפח מקסימלי.

ערבבו בעדינות את הצינור כל שתיים-שלוש דקות עד שכל הכוריונים נושרים מהעוברים. זמן הדכוריון הכולל ישתנה בהתאם לפעילות הפרונאז. הסר את הסופרנטנט, ועם 10 מיליליטר E3, שטוף בעדינות את העוברים שלוש פעמים.

לאחר הנחת העוברים על קרח והסרת ה-E3 הנותר, השתמש במיליליטר אחד של מאגר חלמון טרי וקר כקרח לכל 500 עוברים כדי לשטוף את הדגימה. לאחר מכן, בעזרת P1000, פיפטה בעדינות את העוברים למעלה ולמטה חמש עד 10 פעמים כדי לשבש את שק החלמון. לאחר מכן, העבירו מיליליטר אחד לצינור מיקרופוגה של 1.5 מיליליטר, וצנטריפוגה את הדגימה בארבע מעלות צלזיוס ופי 500 מכוח הכבידה למשך חמש דקות.

יש לזרוק את הדגימות בצורה נמרצת מספיק כדי ליצור תרחיף של תא בודד מבלי לליזק את התאים. צעד זה ידרוש קצת תרגול. הסר את ה-supernatant, והשתמש במיליליטר אחד של 1x PBS קר כקרח כדי לשטוף את הגלולה כדי להסיר את תמיסת הצלצול

לאחר מכן, צנטריפוגה שוב את הדגימה. הסר בזהירות את הסופרנטנט, והשהה מחדש את התאים במיליליטר אחד של 1x PBS. לאחר מכן, הניחו את השפופרת על הקרח.

הוסף שלושה מיליליטר אתנול קר כקרח לצינור חרוטי של 15 מיליליטר, וסובב בעדינות את צינור ה-EtOH במצב נמוך. באמצעות P1000, טפטפו לאט תרחיף תאי עובר של דג הזברה לתוך ה-EtOH תוך כדי המשך מערבולת. הוסף בסך הכל מיליליטר אחד של תרחיף תאי העובר, לתמיסת קיבוע סופית של 75% EtOH.

לאחר הוספת מיליליטר אחד של תרחיף תאים, סובבו בעדינות את הצינור כדי לערבב והניחו אותו על צדו בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס למשך שעה לפחות, או אחסן את התרחיף במקפיא למשך שבועיים-שלושה. כדי לצבוע DNA עוברי, לאחר הסרת תאי עובר קבועים ב-EtOH מ-20 מעלות צלזיוס שליליות, יש לצנטריפוגה את הצינור בכוח הכבידה פי 1500 וארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. הניחו את הצינור על קרח, והסירו בזהירות את הסופרנטנט.

לאחר מכן, באמצעות P1000, השהה בעדינות תאים במיליליטר אחד של PBS-BSA טרי וקר. צנטריפוגה של התאים בכוח הכבידה פי 1500 וארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות, והניחו את הדגימה על קרח. לאחר מכן, הסר את הסופרנטנט, ועל כל 1,000 עוברים, הוסף 200 מיקרוליטר של תמיסת צביעת פרופידיום יודיד והשהה מחדש את התאים.

אפשר לתאים לדגור בתמיסת PI למשך 30 דקות על קרח, תוך ערבוב עדין כל חמש דקות. הניחו מסננת תאי ניילון בגודל 40 מיקרומטר על צינור חרוטי של 50 מיליליטר על קרח. לאחר מכן, פיפטה בעדינות את התאים כדי לערבב ולסנן את תמיסת התא דרך הרשת.

בעזרת הקצה הפנימי השטוח של בוכנת המזרק, שבש בעדינות את כל גושי התאים שנותרו על הרשת. על כל 1,000 עוברים, השתמש ב-500 מיקרוליטר PBS-BSA קר כדי לשטוף את התאים דרך המסנן. הניחו רשת של 40 מיקרומטר על צינור חרוטי של 15 מיליליטר על קרח, וסננו את מתלה התא מהצינור החרוטי של 50 מיליליטר פעם שנייה לתוך צינור ה-15 מיליליטר.

לבסוף, באמצעות מכשיר מיון תאים מתאים, הגדר את עירור הלייזר ל-561 ננומטר ואת זיהוי הפליטה ל-610 על פני 20 כדי לזהות פרופידיום יודיד. מיון התאים, וביצוע ניתוחים נוספים בהתאם לפרוטוקול הטקסט. כדי לקבוע את איכות מיפוי הקריאה, תחילה יש ליישר את נתוני הריצוף לגנום, תוך שימוש בסטטיסטיקה של ערכי mapQ.

בנוסף, סטטיסטיקת אורך הקריאה המחושבת משורטטת כהיסטוגרמה של התפלגות גדלי התוספות עבור כל קריאות הרצף. הניסוי הספציפי הזה הביא לחציון של 170 bp. גרף עמודות זה ממחיש את סטטיסטיקת הקריאה עבור סך הקריאות הממופות, הקריאות המכילות דגל באיכות נמוכה, קורא עם זוגות הממופים לכרומוזום אחר, קורא עם זוג מעבר לסף המרחק וכפולות PCR.

מספרים מייצגים של סך הקריאות, הכיסוי ורזולוציית הקריאה הממופים, הלא ממופים והלא מזווגים, עבור ריצת ריצוף טיפוסית של דגימת דג זברה מפורטים כאן. לאחר הסינון, ספירת הקריאה נקבעת בחלונות בגודל משתנה והנתונים מוחלקים ומנורמלים. פרופילי תזמון שכפול מוחלקים ומנורמלים אופייניים של כרומוזום דג זברה מייצג לשכפולים ביולוגיים מוצגים כאן.

הפרופילים לשכפולים ביולוגיים וניסויים צריכים להיות דומים מאוד וגם להציג מתאם גבוה לאורך הכרומוזום. הפרופילים צריכים גם להציג מתאם גבוה בין ערכי תזמון בכל הגנום. מפת הצבעים מייצגת את מקדם המתאם של פירסון.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב ביותר לזכור לוודא איסוף עוברים המתפתחים באופן סינכרוני. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כמו הזרקות מורפולינו או מוטגנזה של CRISPR-Cas9, על מנת לענות על שאלות נוספות, כמו מהם המנגנונים שבאמצעותם שכפול הדנ"א מתואם עם תהליכי התפתחות אחרים? לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לאסוף תאים בשלבים ספציפיים של מחזור התא מעוברי דג זברה המתפתחים באופן סינכרוני.

איסוף דגימות אלו הוא קריטי ליצירת מפות תזמון שכפול DNA של גנום שלם.