Formação de biofilmes induzida por sais biliares em patógenos entéricos: técnicas para identificação e quantificação

O objetivo geral deste protocolo de formação e avaliação de biofilme é determinar a capacidade dos patógenos bacterianos entéricos de formar um biofilme, especialmente em condições que imitam o trânsito gastrointestinal e a exposição a sais biliares. Os métodos podem ajudar a responder a questões-chave no campo da patogênese bacteriana, como a capacidade dos patógenos entéricos de sobreviver às duras condições de sais biliares do trato gastrointestinal. A principal vantagem das técnicas é que os resultados combinados dos três ensaios suportam a caracterização aprofundada da formação de biofilme em resposta à exposição a sais biliares para cada patógeno.

Primeiro tivemos a ideia dos métodos combinados, dada a necessidade de quantificar totalmente a formação de biofilme induzida por sais biliares em Shigella flexneri. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque aspectos do ensaio podem limitar a reprodutibilidade. Portanto, preste atenção às etapas críticas, para garantir a reprodutibilidade.

Demonstrando os procedimentos estarão membros do meu laboratório, Kourtney Nicherson, pós-doutorando, e Alejandro Llanos, pesquisador clínico. Primeiro, rotule dois tubos de 1,5 mililitro como TSB e TSB mais BS. Em seguida, adicione um mililitro de TSB ou TSB mais BS aos respectivos tubos. Em seguida, inocule os tubos com 20 microlitros de cultura noturna em uma diluição de um a 50.

Em seguida, adicione 130 microlitros de meio de controle não inoculado a cada um dos três poços em uma placa estéril, transparente, de fundo plano e tratada com cultura de tecidos, de 96 poços. Este será o controle em branco. Adicione 130 microlitros de cultura inoculada em cada um dos três poços.

Após adicionar o controle e a cultura inoculada nos respectivos poços, incubar a placa de 96 poços por quatro a 24 horas a 37 graus Celsius, estaticamente. Quando a incubação terminar, coloque o controle em branco no leitor de placas. Em seguida, aspire o meio de cultura de cada poço.

Em seguida, lave suavemente os poços uma vez com 200 microlitros de PBS estéril. Após a lavagem, aspire o PBS e inverta a placa para secar por cerca de 20 minutos. É muito importante garantir a remoção suave da mídia e a lavagem suave, para garantir que a matriz EPS não seja perturbada.

Em seguida, adicione 150 microlitros de violeta cristal a 0,5% a cada um dos poços experimentais e de controle. Em seguida, incube a placa por cinco minutos em temperatura ambiente. Após cinco minutos, lave os poços uma vez com 400 microlitros de água destilada.

Adicione 200 microlitros de água destilada para lavar os poços cinco vezes. Após todas as cinco lavagens, inverta a placa e deixe secar completamente, protegida da luz. Para obter resultados consistentes, é importante que as amostras sejam bem secas antes de prosseguir.

Depois que a placa estiver completamente seca, use 200 microlitros de etanol a 95% para desmanchar os poços. Em seguida, deixe a placa no shaker por 30 minutos a quatro graus Celsius, para evitar a evaporação. Após 30 minutos, registre o OD 540 no leitor de placas.

Para detecção semiquantitativa de EPS, use uma pipeta multicanal para transferir o meio de cultura para uma placa transparente de 96 poços. Em seguida, use 200 microlitros de reagente de fixação para fixar a placa preta por 15 minutos em temperatura ambiente. Agora registre a leitura do OD 600 definindo o controle bem como o espaço em branco para padronização.

Em seguida, registre a leitura do meio de cultura enquanto a população aderente está fixando. Quando a fixação estiver concluída, remova o reagente e descarte os resíduos perigosos. Em seguida, use 200 microlitros de PBS estéril para lavar suavemente os poços duas vezes.

Após a lavagem, aspire o PBS. Em seguida, adicione 150 microlitros de 25 microgramas por mililitro de-FITC. Incube a placa em temperatura ambiente por 15 minutos.

Após a incubação, lave suavemente os poços com 200 microlitros de PBS. Em seguida, adicione 150 microlitros de PBS a cada poço e registre a fluorescência em 488 nanômetros. Depois de preparar reagentes frescos, aqueça o PBS, PBS com glicose, PBS com sais biliares e PBS com glicose e sais biliares a 27 graus Celsius.

Em seguida, registre os valores OD 600 da placa de biofilme durante a noite no leitor de placas, colocando o controle em branco. Em seguida, aspirar o meio de cultura usando uma linha de vácuo, sem perturbar a população aderente na superfície do plástico. Lave suavemente os poços duas vezes com 200 microlitros de PBS estéril.

Após a lavagem com PBS, adicione 130 microlitros de PBS pré-aquecido, PBS com glicose, PBS com sais biliares e PBS com sais biliares e glicose em cada um dos três poços e, em seguida, incube a placa a 37 graus Celsius por 30 minutos. Após 30 minutos, retire a placa da incubadora. Pipetar o sobrenadante para uma placa estéril de 96 poços.

Finalmente, prepare de uma a 10 diluições seriadas do sobrenadante com PBS na placa de 96 poços ou em um bloco de diluição. Em seguida, use uma pipeta multicanal para transferir cinco microlitros de cada diluição em placas de ágar LB. Incube as placas a 37 graus Celsius durante a noite.

No dia seguinte, conte o número de colônias. O gráfico de barras é obtido para quantificar a formação de biofilme dependente de sais biliares em patógenos entéricos. Isso é feito plotando os valores OD 540 das cepas individuais na presença e ausência de sais biliares no meio.

O gráfico mostra aumento significativo na formação de biofilme para a maioria das cepas de patógenos, exceto E.Coli enteroaggrativa. Em seguida, o EPS produzido durante a formação do biofilme é detectado determinando a quantidade de-FITC retida pelo EPS. O gráfico de barras mostra uma leitura de fluorescência significativamente aumentada na presença de sais biliares.

Isso confirma a produção de EPS para o patógeno Shigella flexneri. Aqui, a coloração dependente de-FITC da matriz EPS é significativamente alta quando exposta aos sais biliares. Isso indica a formação de biofilme bacteriano, caracterizado pela matriz EPS rica em polissacarídeos.

One X PBS e DAPI são usados para mostrar a especificidade dependente de FITC e a presença do DNA bacteriano, respectivamente. Finalmente, o número de unidades formadoras de colônias é contado para analisar a dispersão dependente de sais biliares de bactérias do biofilme. O gráfico mostra que as bactérias se dispersam prontamente dos biofilmes em PBS e PBS com glicose.

No entanto, a exposição da bactéria aos sais biliares inibe drasticamente sua dispersão dos biofilmes. Esses ensaios foram desenvolvidos para capturar e quantificar os biofilmes virulentos transitórios formados por patógenos entéricos, particularmente Shigella flexneri, em resposta à exposição ao sal biliar no intestino delgado antes da infecção no cólon. Modificações nos ensaios, como os tipos de meios de base, a composição dos sais biliares usados e as condições de crescimento bacteriano, podem precisar ser ajustadas para diferentes patógenos, dependendo do local da infecção no trato gastrointestinal.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar cada um dos ensaios para avaliar minuciosamente a formação de biofilme em sua cepa bacteriana ou mutante de interesse. Lembre-se de que trabalhar com os patógenos e algumas das soluções pode ser extremamente perigoso. Precauções como métodos apropriados de manuseio e descarte devem sempre ser consideradas ao realizar esses ensaios.

Além disso, a preparação de meios de sais biliares frescos, controles adequados e garantia de reprodutibilidade experimental são vitais para a análise de dados e confirmação do fenótipo de biofilme induzido por sais biliares. As técnicas, que são aplicações únicas e criativas de alto rendimento de métodos tradicionais, permitirão a quantificação apropriada do processo multifacetado e dinâmico de formação de biofilme induzido por sais biliares em patógenos entéricos.