Name: A11-positiver β-Amyloid Oligomer Vorbereitung und Bewertung mit Dot-Blot-Analyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-22T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Erfahren Sie die einfache und zuverlässige Präparation von Aβ-Oligomeren aus synthetischen Peptiden in vitro. Diese Methode nutzt Dot-Blot-Analyse zur Quantifizierung und ist essenziell für neuropharmakologische Forschung.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Natural Science Foundation of China (U1503223, 81673407, 21475131), das angewandte Forschungsprojekt auf Non-Profit-Technologie der Provinz Zhejiang (2016 C 37110), die Ningbo International Science and Technology Kooperationsprojekt (2014D 10019), Ningbo Municipal Innovationsteams der Life Science und Gesundheit (2015C 110026), Ningbo Sci & Tech-Projekt für Common Wealth (2017C 50042), die Li Dak Summe Yip Yio Kinn Kenneth Li Marine biopharmazeutische Entwicklungsfonds, und K. C. Wong Magna Fonds an Ningbo University.

1. Vorbereitung der Lösung
Hinweis: Siehe Tabelle der Materialien für Reagenz Quellen.
<ol><li>Bereiten Sie eine 5 % Rinderserumalbumin (BSA) Lösung durch Zugabe von 5 g BSA zu 100 mL bidestilliertem Wasser. Mischen Sie sie vollständig durch Vortexen sie. Speichern Sie die Lösung bei 4 ° C für bis zu 1 Monat.</li>
	<li>Bereiten Sie eine Anti-Oligomer Antikörperlösung A11 (1:1 000) durch Zugabe von 10 µL der Stammlösung Antikörper zu 10 mL der Lösung 5 % BSA. Mischen Sie sie vollständig durch Vortexen sie. Speichern Sie die Lösung bei 4 ° C für bis zu 1 Monat.</li>
	<li>Bereiten Sie eine Anti-Aβ Antikörper 6E10 Lösung (1:1 000) durch Zugabe von 10 µL der Stammlösung Antikörper bis 10 mL einer 5 % BSA Lösung. Mischen Sie sie vollständig durch aufschütteln. Speichern Sie die Lösung bei 4 ° C für bis zu 1 Monat.</li>
	<li>Bereiten Sie eine Anti-Fibrillären Oligomer Antikörperlösung OC (1:1 000) durch Zugabe von 10 µL der Stammlösung Antikörper bis 10 mL einer 5 % BSA Lösung. Mischen Sie sie vollständig durch aufschütteln. Speichern Sie die Lösung bei 4 ° C für bis zu 1 Monat.</li>
	<li>Bereiten Sie eine Tris gepufferte Kochsalzlösung (TBS) Stammlösung 1.000 mL bidestilliertem Wasser 24 g Tris-Base und 88 g NaCl hinzu. Den pH-Wert 7,4 einstellen. Speichern Sie die Lösung bei 4 ° C für bis zu 3 Monaten.</li>
	<li>Bereiten Sie ein Tris gepufferte Kochsalzlösung und Tween-20 (TBST) Lösung durch Zugabe von 1 mL Tween-20 bis 100 mL von TBS Lager Lösung und 900 mL bidestilliertem Wasser.</li>
	<li>Bereiten Sie eine sekundäre Antikörper-Lösung durch Hinzufügen von 10 µL Meerrettich Peroxidase (HRP) Ziege Anti-Kaninchen IgG (H + L) auf 10 mL TBST Lösung. Mischen Sie sie vollständig durch Vortexen sie. Speichern Sie die Lösung bei 4 ° C für bis zu 1 Monat.</li>
	<li>Lösen Sie 3,68 g von Curcumin in 1 mL Dimethyl Sulfoxid (DMSO), eine 10-mM-Curcumin-Stammlösung zu bilden.</li>
	<li>5 mg von synthetischen Aβ-1-42 in 2 mL 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-Propanol (HFIP) zu einer 2,5-mg/mL Aβ Monomer Lösung zu lösen. Legen Sie sie bei Raumtemperatur (25 ° C) für 20 min. machen 100 µL Aliquots und bei-20 ° C für bis zu 6 Monate aufbewahren. Hinweis: Dieses Verfahren sollte so schnell wie möglich ausgeführt werden. Die Pipettenspitzen sollten abgeschnitten werden, um genaues pipettieren zu gewährleisten.</li>
	<li>Bereiten Sie Electrochemiluminescence (ECL) Flüssigkeit durch ECL Flüssigkeit A und B mit einem Volumenverhältnis von 1:1 mischen. Diese Lösung sollte kurz vor dem Einsatz vorbereitet werden.</li>
</ol>2. die Probenvorbereitung
Hinweis: Führen Sie die Probenvorbereitung 2 Tage vor dem Dot-Blot-Analyse.
<ol><li>Ein Rohr von Aβ-1-42 -Monomer-Lösung 900 µL bidestilliertem Wasser hinzufügen; die Konzentration von Aβ-1-42 werden 0,25 mg/mL. Legen Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 20 min.</li>
	<li>Verdampfen Sie die Lösung mit hochreinen Stickstoffgas, bis sein Volumen ungefähr 850 µL ist. Die Konzentration der Aβ-1-42 -Lösung werden 0,29 mg/mL. Hinweis: Die Lösung muss von Zeit zu Zeit geschüttelt werden, um sicherzustellen, dass die HFIP vollständig verdunstet ist. Normalerweise ist das Volumen der verbleibende Lösung nach 30 min der Verdunstung, ca. 850 µL.</li>
	<li>Verdünnen Sie Curcumin-Stammlösung zu einer Curcumin Lösung (0,2 und 2 µM) mit bidestilliertem Wasser. Mischen Sie die Aβ-1-42-Lösung und Curcumin arbeiten Lösung mit einem Volumenverhältnis von 1:1. Die Endkonzentrationen von Curcumin werden 0,1 bis 1 µM. Hinweis: Mögliche Oligomer-Hemmer können mit der Aβ-1-42 -Lösung in jedem Verhältnis bei Bedarf gemischt werden.</li>
	<li>Schütteln Sie die Lösung kontinuierlich in einen magnetischen Quirl (siehe Tabelle der Materialien).<ol>
<li>Eine Kunststoff-Teiler-Feld, um die magnetischen Rührer zu beheben. Platz 2 magnetische verrühren Bars an 2 Ecken der Box und die Probenröhrchen in der Mitte des Feldes.</li>
		<li>Schütteln Sie die Box bei Raumtemperatur (25 ° C) für 48 h. Hinweis: Die Geschwindigkeit des magnetischen Rührwerks ist rund 60 Umdrehungen pro Minute.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die Rohre für 15 min bei 4 ° C zentrifugiert und 18.000 x g. sammeln überstand.</li>
</ol>(3) Dot Blot Analyse
Hinweis: Auf einem horizontalen Shaker sind alle Inkubationen durchgeführt.
<ol><li>Schneiden Sie Nitrozellulose-Membran in 1 cm breite Streifen. Hinweis: Die Breite der Nitrozellulose-Membran kann experimentelle Bedürfnissen angepasst werden.</li>
	<li>Legen Sie 2 µL Proben gleichmäßig auf 2 Streifen (Band 1 und 2) mit jedem punktintervall 0,5 cm.</li>
	<li>Legen Sie die Streifen bei Raumtemperatur für 5 min, bis die Tropfen auf dem Band trocken ist.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Streifen mit 5 % BSA-Lösung für 30 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Spülen Sie die Streifen mit einer TBST Lösung für 5 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Aspirieren Sie TBST Lösung. Inkubieren Sie für 1 h bei Raumtemperatur Streifen 1 mit einem Anti-Oligomer Antikörper A11 Lösung und Streifen Sie 2 mit einer Anti-Aβ-Antikörper-6E10-Lösung.</li>
	<li>Spülen Sie die Streifen mit einer TBST Lösung drei Mal, jedes Mal für 5 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Aspirieren Sie TBST Lösung. Inkubieren Sie die Streifen mit einer sekundären Antikörperlösung für 40 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Spülen Sie die Streifen mit einer TBST Lösung drei Mal, jedes Mal für 5 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Gleichmäßig auftragen der gemischten ECL Flüssigkeit an der Oberfläche der Streifen. Setzen Sie die Streifen in eine automatische Chemilumineszenz imaging-System (siehe Tabelle der Materialien). Hinweis: Im Normalfall reicht 300 µL der ECL Flüssigkeit einer Membran. Die Membran muss während der Belichtung feucht gehalten werden. Die Belichtungszeit wird automatisch durch das Abbildungssystem berechnet.</li>
	<li>Machen Sie eine Graustufen-Analyse mit ImageJ (National Institutes of Health) oder einer anderen Bildverarbeitungs-Software, um semi-quantitativen Ergebnisse zu erzielen.</li>
</ol>

<ol><li>Lauren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+prion+protein+as+a+therapeutic+target+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Cellular prion protein as a therapeutic target in Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 38 (2), 227-244 (2014).</li>
<li>De Maio, A., Rivera, I., Cauvi, D. M., Arispe, N. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/biophysj/comments/S0006-3495(16)33411-7">Modulation of amyloid peptide oligomerization and toxicity by extracellular Hsp70.</a> Biophysical Journal. 112 (3), 444(2017).</li>
<li>Di Scala, C., Chahinian, H., Yahi, N., Garmy, N., Fantini, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+Alzheimer%27s+beta-amyloid+peptides+with+cholesterol%3A+mechanistic+insights+into+amyloid+pore+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Interaction of Alzheimer's beta-amyloid peptides with cholesterol: mechanistic insights into amyloid pore formation.</a> Biochemistry. 53 (28), 4489-4502 (2014).</li>
<li>Xiang, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fucoxanthin+inhibits+beta-amyloid+assembly+and+attenuates+beta-amyloid+oligomer-induced+cognitive+impairments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Fucoxanthin inhibits beta-amyloid assembly and attenuates beta-amyloid oligomer-induced cognitive impairments.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (20), 4092-4102 (2017).</li>
<li>Chang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+against+beta-amyloid-induced+synaptic+and+memory+impairments+via+altering+beta-amyloid+assembly+by+bis%28heptyl%29-cognitin%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Protection against beta-amyloid-induced synaptic and memory impairments via altering beta-amyloid assembly by bis(heptyl)-cognitin.</a> Scientific Reports. 5, 10256(2015).</li>
<li>Yam, G. H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+amyloid+aggregate+forming+ability+of+TGFBI+mutants+that+cause+corneal+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">In vitro amyloid aggregate forming ability of TGFBI mutants that cause corneal dystrophies.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (9), 5890-5898 (2012).</li>
<li>Tomaselli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+alpha-to-beta+conformational+transition+of+Alzheimer%27s+A+beta-%281-42%29+peptide+in+aqueous+media+is+reversible%3A+A+step+by+step+conformational+analysis+suggests+the+location+of+beta+conformation+seeding%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">The alpha-to-beta conformational transition of Alzheimer's A beta-(1-42) peptide in aqueous media is reversible: A step by step conformational analysis suggests the location of beta conformation seeding.</a> ChemBioChem. 7 (2), 257-267 (2006).</li>
<li>Shigemitsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+magnetic+resonance+evidence+for+the+dimer+formation+of+beta+amyloid+peptide+1-42+in+1%2C1%2C1%2C3%2C3%2C3-hexafluoro-2-propanol%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Nuclear magnetic resonance evidence for the dimer formation of beta amyloid peptide 1-42 in 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol.</a> Analytical Biochemistry. 498, 59-67 (2016).</li>
<li>Khan, M. V., Rabbani, G., Ahmad, E., Khan, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluoroalcohols-induced+modulation+and+amyloid+formation+in+conalbumin%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Fluoroalcohols-induced modulation and amyloid formation in conalbumin.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 70, 606-614 (2014).</li>
<li>Fang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-hydroxycyclopenicillone%2C+a+new+beta-amyloid+fibrillization+inhibitor+from+a+sponge-derived+fungus+trichoderma+sp+HPQJ-34%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Drugs%22%5BJournal%5D)">5-hydroxycyclopenicillone, a new beta-amyloid fibrillization inhibitor from a sponge-derived fungus trichoderma sp HPQJ-34.</a> Marine Drugs. 15 (8), 260(2017).</li>
<li>Shiao, Y. J., Su, M. H., Lin, H. C., Wu, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Echinacoside+ameliorates+the+memory+impairment+and+cholinergic+deficit+induced+by+amyloid+beta+peptides+via+the+inhibition+of+amyloid+deposition+and+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Food+%26+Function%22%5BJournal%5D)">Echinacoside ameliorates the memory impairment and cholinergic deficit induced by amyloid beta peptides via the inhibition of amyloid deposition and toxicology.</a> Food & Function. 8 (6), 2283-2294 (2017).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

In diesem Protokoll haben wir eine Methode zur Vorbereitung von Proben mit Aβ1-42 Oligomer und die Beträge der A11-positiven Aβ1-42 Oligomer durch einen Punkt Blot Analyse analysieren berichtet. Obwohl unsere Methoden für die Erstellung von Aβ1-42 Oligomer-reiche Proben ganz einfach, zuverlässig und reproduzierbar sind, gibt es noch einige Punkte zu beachten. Erstens wird HFIP verwendet, um synthetische Aβ-1-42 -Peptid auflösen. Eine aggregierte Aβ-1-42 -Peptid kann ...

Alzheimer-Krankheit (AD) ist eine der wichtigsten neurodegenerativen Erkrankungen bei älteren Menschen weltweit1. Es ist weithin anerkannt, dass die abnorme Ansammlung von β-Amyloid (Aβ) möglicherweise der führenden pathologischen Faktor von AD. Aβ-Aggregate sind die Hauptbestandteile der senilen Plaques, eines biologischen Markern in den Gehirnen von Alzheimer-Patienten. Darüber hinaus produzieren Aβ-Aggregate, insbesondere Oligomere potente Neurotoxizität, die möglicherweise die Ursache des neuronalen Tod AD Fortschreiten. Daher könnte die Hemmung der Aβ Oligomer Bildung Neurodegeneration verhindern und Aβ-Oligomer-Inhibitoren entwickelt werden könnte, als krankheitsmodifizierende Therapien von AD. Viele Studien haben eine synthetische Aβ-Peptid bilden Oligomere in Vitro, Morphologien und Strukturen der künstlichen Aβ Oligomere erkunden und untersuchen die Inhibitoren von Aβ-Oligomer mit in-vitro- Modelle2,3 verwendet , 4. jedoch verschiedene in-vitro- Bildung-Protokolle von Aβ Oligomer könnte zu Oligomer mit unterschiedlichen morphologischen Eigenschaften, die die unvergleichliche Ergebnisse unter verschiedenen Forschungsgruppen verursachen könnten. Ein standard-Formation-Protokoll für Aβ Oligomer ist daher dringend erforderlich.
Bis jetzt wurden nicht viele Methoden berichtet, Aβ Oligomere direkt zu erkennen. Übertragung elektronischer Mikroskopie (TEM), nicht Denaturierung Gelelektrophorese, Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA) und Dot-Blot-Analyse lässt sich die Menge und/oder die Morphologie von Aβ Oligomer in-vitro-5, prüfen 6. Z. B. die Morphologie und Struktur der Aβ Oligomer in TEM beobachtet werden. Die relativen Mengen und Molekülgröße Aβ Aggregationen konnte nicht Denaturierung Gelelektrophorese gemessen werden. ELISA konnte zur Aβ Oligomer in Serum, Plasma und Auszüge aus Hirngewebe herangezogen werden. Zu guter Letzt Dot-Blot-Analyse, eine Technik zur Erfassung, Analyse und Identifizierung von Proteinen, ließe sich die relative Konzentration der Aβ Oligomer in verschiedenen Proben mit Hilfe von Oligomer-spezifische und Aβ-spezifische Antikörper zu bewerten. Darüber hinaus bietet ein Dot Blot Assay deutliche Zeitersparnis, wie Gelelektrophorese und den befleckenden Verfahren für Gele nicht erforderlich sind. Daher wird dieser Test normalerweise Bildschirm potenzielle Aβ Oligomer-Inhibitoren. Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, eine relativ einfache, zuverlässige und reproduzierbare Methode zur Vorbereitung einer Aβ1-42 Oligomer-reiche Probe, die Mengen von Aβ-1-42 -Oligomer von Dot-Blot-Analyse und Bildschirm Aβ Oligomer analysieren zu beschreiben Inhibitoren mit semi-quantitativen experimentellen Ergebnissen.

<table><tbody><tr><td>A11 (ab126892 Rb pAb zu Amyloid-Oligomeren)</td><td>Abcam</td><td>GR91739-58</td><td></td></tr><tr><td>6E10 (Beta-Amyloid-Kaninchen-Ab)</td><td>Zelle&nbsp; Signaltechnologie</td><td>2454S</td><td></td></tr><tr><td>OC (Anti-Amyloidfibrillen OC Antikörper)</td><td>Millipore</td><td>AB2286</td><td></td></tr><tr><td>Meerrettichperoxidase (HRP) Marker Ziege Anti Kaninchen IgG (H+L)&nbsp;</td><td>Beyotime</td><td>A0208</td><td></td></tr><tr><td>A&beta; 1-42</td><td>GL Biochem</td><td>52487</td><td></td></tr><tr><td>1,1,1,3,3,3-Hexafiuoro-2-propanol</td><td>Aladdin</td><td>I1523078</td><td></td></tr><tr><td>Curcumin</td><td>Sigma</td><td>C1386</td><td></td></tr><tr><td>Albumin Rind V</td><td>Solarbio</td><td>A8020</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sangon Biotech</td><td>D920BA0003</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat</td><td>SCR</td><td>30166428</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Solarbio</td><td>T8060</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Solarbio</td><td>G8200</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Dimethylsulfoxid</td><td>Solarbio</td><td>D8370</td><td></td></tr><tr><td>5&fach; nicht-denaturierendes Gel PAGE Protein Marker</td><td>Beyotime</td><td>P0016</td><td></td></tr><tr><td>Genshare CFAS anyKD PAGE</td><td>Genshare</td><td>JC-PE022</td><td></td></tr><tr><td>Reine Nitrocellulose Blotting Membrane</td><td>Pall Corporation</td><td>T50189</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>SCR</td><td>10014118</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>SCR</td><td>10009218</td><td></td></tr><tr><td>Super niedriger Bereich&nbsp; Protein Marker</td><td>Solarbio</td><td>PR1300</td><td></td></tr><tr><td>Transfer Membranes</td><td>Immobilon-PSQ</td><td>ISEQ00010</td><td></td></tr><tr><td>BeyoECL Star</td><td>Beyotime</td><td>P0018A</td><td></td></tr><tr><td>Commassie Blue Schnelle Färbelösung</td><td>Beyotime</td><td>P0017</td><td></td></tr><tr><td>All - automatisches Chemilumineszenz-Bildgebungssystem</td><td>Tanon</td><td>Tanon 5200</td><td></td></tr><tr><td>Image J</td><td>National Institute of Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bildverarbeitungssoftware</td><td>Adobe</td><td>Photoshop CS6</td><td></td></tr><tr><td>Magnetrührwerk</td><td>Shanghai Huxi</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a11-positiver β-amyloid oligomer vorbereitung und bewertung mit dot-blot-analyse

A11-positive &#946;-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

Β-Amyloid (Aβ) ist eine hydrophobe Peptid mit innewohnende Tendenz zu Aggregaten selbst zusammenstellen. Unter den verschiedenen Aggregaten Aβ Oligomer ist weithin anerkannt als der führende Nervengift in der Entwicklung der Alzheimer-Krankheit (AD) und gilt als das entscheidende Ereignis in der Pathogenese der AD. Daher könnte Aβ-Oligomer-Inhibitoren verhindern Neurodegeneration und haben das Potenzial, als Disease modifying entwickelt werden Behandlungen von AD. Jedoch führen verschiedene Bildung Protokolle von Aβ Oligomer Oligomere mit unterschiedlichen Eigenschaften. Darüber hinaus gibt es nicht viele Methoden, um effektiv Bildschirm Aβ1-42 Oligomer-Inhibitoren. Ein A11 Antikörper reagieren mit einer Teilmenge der giftige Aβ-1-42 -Oligomer mit antiparallele β-Sheet-Strukturen. In diesem Protokoll beschreiben wir, wie zur Vorbereitung einer A11-positiven Aβ1-42 Oligomer-reiche Probe aus einem synthetischen Aβ1-42 Peptid in Vitro und relative Mengen der A11-positiven Aβ1-42 Oligomer in Proben von einem Dot-Blot auswerten Analyse mit A11 und Aβ1-42-spezifischen 6E10 Antikörper. Unter Verwendung dieses Protokolls, können Inhibitoren der A11-positiven Aβ1-42 Oligomer auch von semi-quantitativen experimentellen Ergebnisse gezeigt.

Um zu untersuchen, ob eine Aβ-1-42 -Monomer eine Aβ-1-42 -Oligomer nach der Zubereitung bilden kann, wurde TEM Analyse verwendet. Keine sichtbaren Aggregate wurden in der HFIP aufgelöst Aβ1-42 Monomer Probe (Abb. 1A) beobachtet. Darüber hinaus vor allem kugelige Aggregate mit einem Durchmesser von rund 10-80 nm beobachtet in der Aβ-1-42 -Probe nach 48 h schütteln, was darauf hindeutet, dass Aβ1...

Dieses Protokoll beschreibt, wie Aβ Oligomere aus einem synthetischen Peptid in Vitro vorzubereiten und relative Mengen der Aβ Oligomer durch eine Dot-Blot-Analyse zu bewerten.

A11-positiver β-Amyloid Oligomer Vorbereitung und Bewertung mit Dot-Blot-Analyse

&#946;-amyloid (A&#946;) is a hydrophobic peptide with an intrinsic tendency to self-assemble into aggregates. Among various aggregates, A&#946; oligomer ...

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im neuropharmakologischen Bereich zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass es einfach, zuverlässig und reproduzierbar ist, Beta-Amyloid-Oligomere zu bilden. Wir zeigen, dass die Demonstration dieser Methode von entscheidender Bedeutung ist, da die Schritte zur Herstellung von Beta-Oligomeren schwer zu erlernen sind.Stellen Sie zunächst die Konzentration der A-beta-Monomerlösung auf 0,25 Milligramm pro Milliliter ein, indem Sie 900 Mikroliter doppelt destilliertes Wasser in das Röhrchen geben. Verdampfen Sie dann die Monomerlösung mit hochreinem Stickstoffgas weiter, bis das Volumen etwa 850 Mikroliter mit einer Konzentration von etwa 0,29 Milligramm pro Milliliter erreicht. Das Vorhandensein von HR5P beeinflusst die Bildung von A-beta-Oligomeren.Daher ist das Verdampfen von so viel wie möglich ein kritischer Schritt dieses Verfahrens. Verwenden Sie anschließend doppelt destilliertes Wasser, um die Curcumin-Stammlösung zu verdünnen, um eine Arbeitslösung von 0,2 und zwei Mikromolaren herzustellen. Halten Sie ein Verhältnis von eins zu eins aufrecht und mischen Sie die A-beta-Lösung mit Curcumin, um die Endkonzentration von Curcumin bei 0,1 und einem Mikromolar zu erreichen.Lassen Sie dann die Lösung auf einem magnetischen Rührwerk. Befestigen Sie einen Trennkasten aus Kunststoff am Magnetrührwerk. Positionieren Sie zwei magnetische Rührstäbchen an den beiden Ecken der Box und platzieren Sie dann die Röhrchen mit den Proben in der Mitte der Box.Schütteln Sie die Box 48 Stunden lang bei Raumtemperatur bei 60 Umdrehungen pro Minute weiter und zentrifugieren Sie das Röhrchen dann 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 18.000 mal G. Nach der Zentrifugation den Überstand auffangen. Für die Dot-Blotting-Analyse nehmen Sie eine Nitrozellulosemembran und schneiden sie in einen Zentimeter breiten Streifen, dann legen Sie zwei Mikroliter der Probe gleichmäßig auf die Streifen eins und zwei mit jedem Punktabstand bei 0,5 Zentimetern.Beim Spritzen der Probe auf die Membran ist es notwendig, sich gleichmäßig zu verteilen und die verschiedenen Tröpfchen so zu kontrollieren, dass die verschiedenen Proben nicht miteinander verbunden werden. Inkubieren Sie die Streifen anschließend fünf Minuten lang bei Raumtemperatur, damit die Tröpfchen austrocknen können. Nach fünf Minuten werden die Streifen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 5 %igem Rinderserumalbumin inkubiert.Sobald die Inkubation beendet ist, waschen Sie die Streifen fünf Minuten lang mit TBST-Puffer. Aspirieren Sie den Puffer nach dem Waschen und inkubieren Sie dann den ersten Streifen mit dem Anti-Oligomer-Antikörper A11 und den zweiten Streifen mit der Anti-A-Beta-Antikörper-6E10-Lösung für eine Stunde. Waschen Sie die Streifen nach einer Stunde dreimal fünf Minuten lang mit TBST, aspirieren Sie dann den Puffer und inkubieren Sie die Streifen 40 Minuten lang mit sekundärer Antikörperlösung.Waschen Sie die Streifen nach der sekundären Antikörperinkubation erneut dreimal fünf Minuten lang mit TBST. Geben Sie dann etwa 300 Mikroliter gemischte ECL-Flüssigkeit auf die Oberfläche der feuchten Streifen und belichten Sie die Streifen in einem automatischen Chemilumineszenz-Bildgebungssystem. TEM-Studien zeigen das Fehlen sichtbarer Aggregate in der HFIP-gelösten A-beta-Monomerlösung, jedoch bilden dieselben Monomer nach 48 Stunden Inkubation Oligomere, bei denen es sich hauptsächlich um kugelförmige Aggregate mit einem Durchmesser von 10 bis 80 Nanometern handelt.Bei der Dot-Blot-Analyse der A-beta-Monomer und oligomerreichen Proben zeigt sich das Vorhandensein von A11-positiven A-beta-Oligomeren in A-beta-Oligomer-reichen Proben. Interessanterweise sind A-beta 6E10-positive A-beta-Peptide sowohl in den A-beta-Monomer- als auch in den oligomerreichen Proben vorhanden. Als nächstes wird auch eine semiquantitative Analyse durchgeführt, um die spezifischen Antikörper-positiven A-beta-Monomer und oligomerreichen Proben als Prozentsatz der Kontrolle zu exprimieren.A11-positive A-beta-Peptide sind in A-beta-Oligomer-reichen Proben im Vergleich zu den Monomeren signifikant höher. Im Gegensatz dazu ist das A-beta 6E10-positive A-beta-Peptid sowohl in den monomeren als auch in den oligomerreichen Proben vorhanden. Tatsächlich werden A-beta-Oligomere auch mit Curcumin und A-Beta-Oligomer-Inhibitoren co-inkubiert.Curcumin führt zu einer signifikanten Verringerung der relativen Menge an A11-positiven A-beta-Oligomeren mit verminderter A11-Färbung in den Curcumin-co-inkubierten A-beta-Oligomerproben. Unterschiedliche Konzentrationen von Curcumin haben jedoch keinen Einfluss auf die Anzahl der A-beta-Peptide in den 6E10-positiven Monomer- und oligomerreichen Proben im Vergleich zu A11-positiven Proben. Einmal gemeistert, kann diese Technik in mehreren Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher, Medikamentenkandidaten für neurodegenerative Erkrankungen wie die Alzheimer-Krankheit zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man A-beta-Oligomer herstellt und seine Menge bewertet.

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Forschung

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Biochemie

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SDS-PAGE/Immunoblot Detektion von Aß Multimere in Human Kortikale Gewebehomogenaten mit Antigen-Epitope Retrieval

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Novel Rasterkraftmikroskopie.Wie Biopanning für Isolierung von Morphologie Spezifische Reagenzien gegen TDP-43 Varianten in Amyotrophe Lateralsklerose

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Chemo-enzymatische Synthese von N- Glykanen für Array-Entwicklung und HIV-Antikörper-Profiling

Dieser Artikel liefert ein detailliertes Verfahren zur Festphasensynthese, -reinigung und -charakterisierung von an der C2'- O- Position modifizierten Dodecamern von RNA. UV-vis- und zirkuläre Dichroismus-photometrische Analysen dienen zur Quantifizierung und Charakterisierung von Strukturaspekten, dh Einzelsträngen oder Doppelsträngen.

Protokoll für die Festphasensynthese von Oligomeren der RNA mit einem 2&#39;-<em&gt; O</em&gt; -thiophenylmethyl-Modifikation und Charakterisierung über Kreisdichroismus

Einfache Methoden sind für den Nachweis der Produktion von zytotoxischen amyloide nach Infektion der Lunge Endothel von Pseudomonas Aeruginosabeschrieben.

Methoden zur Erkennung von zytotoxischen amyloiden folgende Infektion der pulmonalen Endothelzellen durch Pseudomonas aeruginosa

Ein detailliertes Protokoll zur Reinigung und anschließenden Analyse eines monoklonalen Antikörpers aus geernteter Zellkulturflüssigkeit (HCCF) automatisierter Mikrobioreaktoren wurde beschrieben. Die Verwendung von Analysen zur Bestimmung kritischer Qualitätsattribute (CQAs) und zur Maximierung des begrenzten Stichprobenvolumens zum Extrahieren wichtiger Informationen wird ebenfalls vorgestellt.

Reinigung und Analyse eines monoklonalen Antikörpers aus chinesischen Hamster-Ovarialzellen mit einem automatisierten Mikrobioreaktorsystem

Diese biochemische Reinigungsmethode mit massenspektrometriebasierter Proteomanalyse erleichtert die robuste Charakterisierung von Amyloidfibrillenkernen, was die Identifizierung von Zielen zur Vorbeugung der Alzheimer-Krankheit beschleunigen kann.

Biochemische Reinigung und proteomische Charakterisierung von Amyloid-Fibrillenkernen aus dem Gehirn

Erfahren Sie die einfache und zuverlässige Präparation von Aβ-Oligomeren aus synthetischen Peptiden in vitro. Diese Methode nutzt Dot-Blot-Analyse zur Quantifizierung und ist essenziell für neuropharmakologische Forschung.

A11-positiver β-Amyloid Oligomer Vorbereitung und Bewertung mit Dot-Blot-Analyse

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