Name: İlk kalp alan benzeri kardiyak ataları ve ventrikül benzeri Cardiomyocytes insan Pluripotent kök hücrelerden nesil (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Keşfedin, insan pluripotent kök hücrelerinden Activin A ve Id1 aşırı ekspresyonu kullanarak kalp progenitörleri ve ventrikül benzeri kardiyomiyositler üretmek için ölçeklenebilir bir yöntem. Bu teknik, gelişim biyolojisi ve kalp hastalığı modelleme çalışmaları için tanımlanmış kalp alanı kökenli hücreler sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz yararlı tartışmalar Colas laboratuvar üyeleri ve kritik değerlendirme şekilde alt alta yazılmalıdır teşekkür ederim. Bu çalışmada NIH/NIEHS R44ES023521-02 tarafından desteklenen ve Dr Colas CIRM DISC2-10110 verir.

1. ID1 virüs hazırlık ve enfeksiyon
<ol><li>ID1 overexpressing lentivirus birlikte transfecting pCMVDR8.74, pMD2.G ve pCDH-EF1-ID1-PGK-PuroR oluşturmak (Addgene: plazmid #107735) HEK293T hücreye. Viral parçacıkların toplamak, filtrate, süpernatant arındırmak ve olduğu gibi Kitamura vd. -80 ° C'de depolayın (2003) 19. alternatif olarak, ID1 lentivirus ticari olarak pCDH-EF1-ID1-PGK-PuroR lentivirus üreten bir satıcıya göndererek üretmek. Uyarı: Lütfen lentiviral güvenlik düzenlemeleri ve standart operasyon iletişim kuralları izleyin. Not: Önemli: en iyi virüs titresi-meli var olmak hiç olmazsa 108 -109 Transducing adet/mL (TU/mL).</li>
	<li>Enfeksiyon önce 96 iyi plaka bir şey 50 µl kaplama reaktif, genellikle ( Tablo malzemelerigörmek) Engelbreth-Holm-Swarm fare sarkomu hücreleri tarafından salgılanan bir jelatinimsi protein karışımı ile kat.</li>
	<li>Pluripotent kök hücre PBS Ca2 + ve Mg2 + olmadan ve 0,5 mM EDTA ile 1 mL ekleyerek bir 6 iyi tabak içinde yetiştirilen bir şey ayırmak. Not: 3 – 10 dk ayrılma süresi değişir. Ne zaman hücreleri % 80'den fazla plaka alttan ayrılır, sonraki adıma geçin.</li>
	<li>Hücre süspansiyon ile steril damlalıklı 15 mL plastik santrifüj tüpüne toplamak.</li>
	<li>Ayrılma reaktif PBS içeren Ca2 + ve Mg2 +5 mL ile etkisiz hale getirin.</li>
	<li>Pelet hücreleri tarafından Santrifüjü (200 x g 3 dakika).</li>
	<li>Süpernatant kaldır ve yavaşça tüp Pelet çıkarmak için hafifçe vur.</li>
	<li>Hücrelere kök hücre medya 1 mL yeniden askıya alma.</li>
	<li>Satıcı yönergeleri izleyerek bir otomatik hücre sayaç kullanarak hücreleri saymak.</li>
	<li>Plaka 20.000 hücrelerin başına 50 µL 2 µM RHO/ROCK yolu inhibitörü ile desteklenmiş kök hücre medya iyi (96-şey plaka) kaplı (bkz. Tablo 1 ve 2).</li>
	<li>24 saat sonra hücre eki için izlemek ve 2 µM RHO/ROCK yolu inhibitörü ve 6 ng/mL hexadimethrine bromür ile 100 µl kök hücre medya medya yerine (bkz. Tablo 1 ve 2), bir h lentiviral enfeksiyonu önce. Not: Hücreleri sıkıca plaka altına yapıştırılmış.</li>
	<li>ID1-lentivirus buz çözme.</li>
	<li>Saf lentivirus iyi başına 3 µL eklemek (virüs titresi 10 arasında olması gerektiğini8 -109 TU/mL) ve ardından plaka geri hücre kültür kuluçka için (37 ° C, % 5 CO2, %20 O2) aktarın.</li>
	<li>24 saat sonrası viral enfeksiyon, 100 µL taze kök hücre medya için enfekte hücreleri ekleyin.</li>
	<li>48 saat sonrası lentiviral enfeksiyon, taze kök hücre medya ile 1 µg/mL puromisindir takıma 200 µL ile ortamı içeren Değiştir virüs.</li>
	<li>Her gün 200 µL 1 µg/mL puromisindir ile desteklenmiş kök hücre medya ile medya yenileyin.</li>
	<li>Kültürler % 80 confluency ulaştığınızda, (96-şey plaka bir de) için PBS 200 µL Ca2 + ve Mg2 + + 0,5 mM EDTA olmadan kullanarak hücreleri ayırmak.</li>
	<li>Hücre süspansiyon bir santrifüj tüpüne toplamak.</li>
	<li>Ayrılma reaktif PBS içeren Ca2 + ve Mg2 +5 mL ile etkisiz hale getirin.</li>
	<li>Pelet hücreleri tarafından Santrifüjü (200 x g 3 dakika).</li>
	<li>Süpernatant kaldır ve yavaşça tüp Pelet çıkarmak için hafifçe vur.</li>
	<li>1 mL 2 µM RHO/ROCK yolu inhibitörü ile desteklenmiş kök hücre medya hücrelerde yeniden askıya alma.</li>
	<li>Tüm hücreleri (1 mL) için kaplanmış bir de, bir 12-şey plaka aktarın.</li>
	<li>24 saat sonra 2 µM RHO/ROCK yolu inhibitörü ve 6 ng/mL hexadimethrine bromür, iletim önce bir h ile 1 mL ile iyi ve eski yerine koymak medya hücre ekin kök hücre medya monitör takıma.</li>
	<li>ID1-lentivirus buz çözme.</li>
	<li>Arıtılmış virüs iyi (12-şey plaka) başına 5 µL ekleyin.</li>
	<li>24 saat sonrası lentiviral enfeksiyon, 1 mL taze kök hücre medya 3 µg/mL puromisindir ile takviye ile ortamı içeren Değiştir virüs.</li>
	<li>48 h lentiviral enfeksiyon sonrası, virüs ile 1 mL 6 µg/mL puromisindir ile takıma taze kök hücre medya ortamı içeren değiştirin.</li>
	<li>Kültürler % 80 confluency ulaştığınızda, (bir 12-şey plaka bir de) için PBS Ca2 + ve Mg2 + olmadan ve 0,5 mM EDTA ile 500 µL kullanarak hücreleri ayırmak.</li>
	<li>Yarısı transfer (250 µL) 6-şey plaka 2 mL 2 µM RHO/ROCK yolu inhibitörü ile desteklenmiş kök hücre medya içeren bir kaplama reaktif bir de hücre süspansiyon kaplı.</li>
	<li>Diğer yarısı kullanın (250 µL) RNA çıkarma ve lentiviral-aracılı ID1 ifade düzeyleri, kola vd gibi belirlemede qRT-PCR için örnek (2012) 4. Not: Önemli: ID1 mRNA ifade düzeyleri (bkz. Tablo 3 qRT-PCR astar için) GAPDH ifade düzeylerinin 0.005 kat daha düşük ise, enfeksiyon ID1 ifade düzeyleri aşan kadar yukarıda açıklanan adımları tekrarlayın eşik.</li>
</ol>2. hPSCsID1 bakım
<ol><li>HPSCsID1 kaplı 6 iyi-tabaklar içinde kültür ve kök hücre medya 6 µg/mL puromisindir ile desteklenmiş kuyu başına 3 mL büyümek.</li>
	<li>Ne zaman hPSCsID1% 80 confluency, satıcı yönergeleri izleyerek enzim-Alerjik ayrılma reaktif kullanarak geçiş hücreleri toplamları (1:6 split oranı) olarak ulaşmak ve kök hücre medya 6 µg/mL puromisindir ile desteklenmiş kuyu başına 3 mL büyümek.</li>
</ol>3. farklılaşma için hPSCsID1 hazırlanması
<ol><li>12-şey plaka ile kaplama reaktif kuyu başına 500 µL kat.</li>
	<li>Ne zaman PBS Ca2 + ve Mg2 + olmadan ve iyi ücret 0,5 mM EDTA ile 1 mL ekleyerek hücreleriID1 ulaşmak % 90 confluency hPSCs ayırmak için 5-10 dk. ayrılma işlemi her dakika denetleyebilir, ve bir kez hücreleri % 80'i plaka ayrışmış , sonraki adıma geçin.</li>
	<li>Hücre süspansiyon bir santrifüj tüpüne toplamak.</li>
	<li>Ayrılma reaktif PBS içeren Ca2 + ve Mg2 +5 mL ile etkisiz hale getirin.</li>
	<li>Pelet hücreleri tarafından Santrifüjü (200 x g 3 dakika).</li>
	<li>Süpernatant kaldır ve yavaşça tüp Pelet çıkarmak için hafifçe vur.</li>
	<li>2 mL 2 µM RHO/ROCK yolu inhibitörü ile desteklenmiş kök hücre medya hücrelerde yeniden askıya alma.</li>
	<li>Bir otomatik hücre sayaç kullanarak hücreleri saymak.</li>
	<li>Plaka 300.000 hücre, doku kültürü kuluçka 2 µM RHO/ROCK yolu inhibitörü ve 6 µg/mL puromisindir ve transfer plaka ile desteklenmiş kök hücre medya 1 mL kuyuda başına.</li>
	<li>Her gün 2 mL % 90 confluency kültürler ulaşana kadar 6 µg/mL puromisindir ile desteklenmiş kök hücre medya ile medya yenileyin. Bu noktada, kardiyak farklılaşma başlatmak (sonraki adım).</li>
</ol>4. ilk kalp alan benzeri kardiyak ataları (FHF-L CPs) içine hPSCsID1 farklılaşma
<ol><li>12-şey plaka biçimi için indüksiyon medya (Tablo 1) 1,5 mL ile kök hücre medya değiştirerek başlatmak farklılaşma (0 gün) aktivin ile desteklenmiş bir (100 ng/mL) ( Tablo 2 için önerilen birim ve aktivin A konsantrasyonları için bkz. farklı plaka oluşum).</li>
	<li>Gün 1 (24 saat) farklılaşma başlatıldıktan sonra aktivin A olmadan indüksiyon medya (ücret de 12-şey plaka) 2 mL ile ortamı değiştirin.</li>
	<li>3 günde 2 mL (ücret de 12-şey plaka) aktivin A olmadan indüksiyon medya medya yerine.</li>
	<li>5 günde FHF-L CPs dondurma için toplamak (sonraki adım). Not: Önemli: dondurma tercih edilen bu noktada, bu sonraki cardiomyocyte üretim ve biobank büyük toplu işlemleri hücre kardiyak yaratıcı nesil çözmek için kullanmasına olanak tanır. Bu alternatif olarak, Not 5 gün FHF-L CPs farklılaşma devam etmek, passFHF-L CPs 5.1-5,5 adımlarına bakın ve farklılaşma için adım 6.5'devam etmek için taze kaplı bir tabak için geçirilebilir.</li>
</ol>5. FHF-L CPs dondurma
<ol><li>Kuyulardan 5 gün içeren tüm medya Aspire FHF-L CPs ve hızlı bir şekilde eklemek sıcak (37 ° C) 1 x ayrılma reaktif enzim içeren 1 mL ( Tablo malzemelerigörmek). Plaka da doku kültürü kuluçka makinesine koyun.</li>
	<li>1 dakika sonra plaka yan yana kuluçka sallamak.</li>
	<li>2 dakika (Toplam süre) sonra plaka kuluçka makinesi kaldırın ve 1 mL % 10 FBS medya ekleyin.</li>
	<li>Yavaşça yukarı ve aşağı damlalıklı hücreleri hücre dekolmanı plaka kolaylaştırmak için 5 mL damlalıklı ile.</li>
	<li>Santrifüjü 200 x g 3 dk de tarafından bir santrifüj tüpü ve Pelet hücrelere hücre süspansiyon toplamak</li>
	<li>Hücre Pelet 2 mL dondurma reaktif yeniden askıya alma.</li>
	<li>Bir otomatik hücre sayaç kullanarak hücreleri saymak.</li>
	<li>Dondurma reaktif ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek) hücreleri istenilen konsantrasyonu (genellikle 5-10 x 106 hücre/mL), cryopreserve için yeterli bir ses seviyesinde.</li>
	<li>Hücreleri dondurma şişeleri için transfer ve şişeleri soğutma aygıtının (1 ° C/dak) yerleştirin ve soğutma cihazı gecede-80 ° C dondurucuya yerleştirin.</li>
	<li>24 saat sonra dondurulmuş şişeleri uzun süreli depolama için sıvı azot aktarın. Not: Protokol burada duraklatılmış.</li>
</ol>6. FHF-L CP farklılaşma gibi ventriküler Cardiomyocytes içine
<ol><li>5. gün FHF-L donmuş CPs şişeleri sıvı azot depodan Kuru buz kap içine aktarın.</li>
	<li>Hücre süspansiyon tamamen çözdürülen kadar 2-3 dk, 37 ° C su banyosunda şişeleri koyun. Not: Önemli: zamana duyarlı çözülme sürecidir. Dondurma medya hücrelere bir zaman aşırı miktarda açığa (Yani, 10 dk) hücre canlılığı azalacak.</li>
	<li>15-50 mL santrifüj tüpü, çözdürülen şişeleri sayısına bağlı olarak hücre aktarın.</li>
	<li>Dropwise (5 damla 30 saniyede) önceden ısıtılmış (37 ° C) kardiyojenik medyaya (Tablo 1) hücre çözümü dağıtmak. 1:3 dondurma medya kadar bu işleme devam edin: kardiyojenik medya oranı ulaşıldığında. Bu noktada, artış kardiyojenik medya ek oranı 1:10 kadar dondurma medya: kardiyojenik medya oranı ulaşıldığında. Not: Önemli: hızlı Osmolarite değişiklikler hücre ölümü Çözdürme işlemi sırasında; artacak Bu nedenle, Kardiyojenik medya dropwise yanı sıra yukarıda açıklandığı gibi önerilir.</li>
	<li>Hücre süspansiyon ve Pelet hücreleri tarafından aralıklarla (3 dk 200 x g) santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Süpernatant kaldır ve yavaşça hücre Pelet çıkarmak için santrifüj tüpü hafifçe vur.</li>
	<li>Hücreler 2 µM RHO/ROCK yolu inhibitörü ile desteklenmiş kardiyojenik medya ile yeniden askıya alma. Not: Hücre canlılığı tezcan tezcan ve, genel olarak değişebilir, > %65 canlılık iyi kaplama verimliliği öngörür.</li>
	<li>Seyreltik yoğunlaşmış hücre süspansiyon ile kaplama için istenen hücre konsantrasyonu elde etmek için 2 µM RHO/ROCK yolu inhibitörü ile takıma kardiyojenik kitle iletişim araçları (bkz. Tablo 2 farklı plaka biçimleri için). Not: Önemli: Eğer hücreler çok seyrek numaralı seribaşı kardiyak farklılaşma verimlilik düşebilir unutmayın.</li>
	<li>Plaka üzerinde tohum hücreleri.</li>
	<li>Plaka doku kültürü mahalle 20 dk için doku kültürü kuluçka aktarmadan önce tutmak.</li>
	<li>Gün 6 farklılaşma, hücre eki izlemek. Not: Kalp ataları farklılaşma 5 gün cryopreserved. hücreleri çözdürme sonra 24 h farklılaşma gün 6 olur. Not: Kayan (ölü) hücreleri varlığı yaygındır.</li>
	<li>Gün 7, medya % 50'si Aspire edin ve eşit miktarda taze kardiyojenik medya ile değiştirin. Not: RHO/ROCK yolu inhibitörü kardiyojenik basına ilavesi bu noktadan sonra gerekli değildir.</li>
	<li>Medya % 50'si ile kardiyojenik ortamı her gün değiştirin.</li>
	<li>Not kendiliğinden dayak gün 11 ve 13 gün arasında görünür.</li>
	<li>15 günde, DAPI (çekirdek leke) ve ACTC1 kullanarak ayirt tarafından kalp farklılaşma verimliliği ölçmek (pan-kardiyak marker).</li>
</ol>7. geçen ve bakım gibi ventriküler Cardiomyocytes
Not: gün 14-16 tarafından kendiliğinden ventrikül benzeri cardiomyocytes yakalanma monolayer alınmalıdır. Bu noktada, bu ayırmak ve kültür homojenize ve plaka ayırma hücreleri önlemek için cardiomyocytes yeniden plakası için önerilmektedir.
<ol><li>Tüm medya kuyulardan Aspire edin ve hızlı bir şekilde önceden ısıtılmış (37 ° C) 1 x ayrılma reaktif enzim içeren 1 mL ekleyin. Not: 1 x enzim içeren ayrılma reaktif birimler plaka biçimine bağlı olarak değişir ama tamamen iyi yüzey alt karşılar.</li>
	<li>Plaka bir doku kültürü kuluçka makinesi aktarın.</li>
	<li>Yavaşça plaka her 2 dk dekolmanı sürecini hızlandırmak için kuluçka makinesi içinde yan yana sallayın.</li>
	<li>5-15 dakika sonra hücrelerin % %80 100 plaka alttan ayrılır, plaka kuluçka makinesi kaldır ve % 10 FBS medya eşit bir hacmi ekleyerek 1 x enzim içeren ayrılma reaktif etkinliği inhibe. Not: Toplu iş toplu kuluçka süresinin 1 x enzim içeren ayrılma ile bu işlem için değişir.</li>
	<li>Hücre süspansiyon bir santrifüj tüpü toplamak.</li>
	<li>Hücre süspansiyon bir otomatik hücre sayaç damlalıklı ve sayısı hücreleri ile karıştırın.</li>
	<li>İstenen hücre konsantrasyonu hücre süspansiyon seyreltik (bkz. Tablo 2 farklı plaka biçimleri için) 2 µM RHO/ROCK yolu inhibitörü ile desteklenmiş bakım medya ile.</li>
	<li>Cardiomyocytes plaka üzerine tohum sonra hücrelerin eşit dağıtmak ve hücre doku kültürü kuluçka için plaka aktarmadan önce 10-20 dk için eklemek izin.</li>
	<li>24 yeniden kaplama sonra s monitör hücre eki ve kurtarma. Not: Kayan (ölü) hücreleri varlığı yaygındır. 48-72 saat sonra yeniden kaplama, cardiomyocyte kendiliğinden kasılma devam.</li>
	<li>Cardiomyocyte kültürü korumak için medya % 50'si gibi ventriküler cardiomyocytes kullanımı kadar geçen her gün sonraki deneyler için bakım ortamı ile değiştirin.</li>
</ol>

<ol><li>Chong, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic-stem-cell-derived+cardiomyocytes+regenerate+non-human+primate+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts.</a> Nature. 510, 273-277 (2014).</li>
<li>Kodo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPSC-derived+cardiomyocytes+reveal+abnormal+TGF-beta+signalling+in+left+ventricular+non-compaction+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+cell+biology%22%5BJournal%5D)">iPSC-derived cardiomyocytes reveal abnormal TGF-beta signalling in left ventricular non-compaction cardiomyopathy.</a> Nature cell biology. 18, 1031-1042 (2016).</li>
<li>Kim, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+arrhythmogenic+right+ventricular+dysplasia+with+patient-specific+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs.</a> Nature. 494, 105-110 (2013).</li>
<li>Colas, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+microRNA+screening+identifies+let-7+and+mir-18+as+regulators+of+germ+layer+formation+during+early+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Whole-genome microRNA screening identifies let-7 and mir-18 as regulators of germ layer formation during early embryogenesis.</a> Genes & development. 26, 2567-2579 (2012).</li>
<li>Cunningham, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Id+genes+are+essential+for+early+heart+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Id genes are essential for early heart formation.</a> Genes & development. , (2017).</li>
<li>McKeithan, W. L., Colas, A. R., Bushway, P. J., Ray, S., Mercola, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-free+generation+of+multipotent+mesoderm+%28Kdr%2B%29+progenitor+cells+in+mouse+embryonic+stem+cells+for+functional+genomics+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+stem+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Serum-free generation of multipotent mesoderm (Kdr+) progenitor cells in mouse embryonic stem cells for functional genomics screening.</a> Current protocols in stem cell biology. , Chapter 1, Unit 1F 13(2012).</li>
<li>McKeithan, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+platform+for+assessment+of+congenital+and+drug-induced+arrhythmia+with+hipsc-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+physiology%22%5BJournal%5D)">An automated platform for assessment of congenital and drug-induced arrhythmia with hipsc-derived cardiomyocytes.</a> Frontiers in physiology. 8, 766(2017).</li>
<li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+of+tyrosine+kinase+inhibitor+cardiotoxicity+with+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+translational+medicine%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening of tyrosine kinase inhibitor cardiotoxicity with human induced pluripotent stem cells.</a> Science translational medicine. 9, (2017).</li>
<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24930130">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature methods. 11, 855-860 (2014).</li>
<li>Kattman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+optimization+of+activin%2Fnodal+and+BMP+signaling+promotes+cardiac+differentiation+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines.</a> Cell stem cell. 8, 228-240 (2011).</li>
<li>Laflamme, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocytes+derived+from+human+embryonic+stem+cells+in+pro-survival+factors+enhance+function+of+infarcted+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts.</a> Nature biotechnology. 25, 1015-1024 (2007).</li>
<li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 1848-1857 (2012).</li>
<li>Willems, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule-mediated+TGF-beta+type+II+receptor+degradation+promotes+cardiomyogenesis+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Small molecule-mediated TGF-beta type II receptor degradation promotes cardiomyogenesis in embryonic stem cells.</a> Cell stem cell. 11, 242-252 (2012).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cardiovascular+progenitor+cells+develop+from+a+KDR%2B+embryonic-stem-cell-derived+population%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population.</a> Nature. 453, 524-528 (2008).</li>
<li>Palpant, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+high-purity+cardiac+and+endothelial+derivatives+from+patterned+mesoderm+using+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Generating high-purity cardiac and endothelial derivatives from patterned mesoderm using human pluripotent stem cells.</a> Nature protocols. 12, 15-31 (2017).</li>
<li>DeLaughter, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+resolution+of+temporal+gene+expression+during+heart+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell resolution of temporal gene expression during heart development.</a> Developmental cell. 39, 480-490 (2016).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+genetics+of+hypoplastic+left+heart+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+genetics%22%5BJournal%5D)">The complex genetics of hypoplastic left heart syndrome.</a> Nature genetics. 49, 1152-1159 (2017).</li>
<li>Corrado, D., Link, M. S., Calkins, H. <a target="_blank" href="http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMra1509267">Arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy.</a> New England journal of medicine. 376, 1489-1490 (2017).</li>
<li>Kitamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrovirus-mediated+gene+transfer+and+expression+cloning%3A+powerful+tools+in+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+hematology%22%5BJournal%5D)">Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics.</a> Experimental hematology. 31, 1007-1014 (2003).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Başarılı saptamaları için yakından yukarıda listelenen yönergeleri izleyin emin olun. Ayrıca, burada biz güçlü etkisi farklılaşma sonuçlar anahtar parametreleri vurgulayın. Bir farklılaşma başlamadan önce aşağıdaki üç morfolojik parametreleri dikkat edilmelidir: hPSCsID1, yüksek hücresel sıkıştırma ve yüksek bir izdiham bir kök morfolojisi (> % 90) gün 0 kültürünün. Bu konuda en iyi farklılaşma koşulları en iyi ayrışmış kaplama hPSCsID1 tek hücreler olarak oluşturulur ve onları sıkıca forma izin büy...

Büyük ölçekli üretim insan pluripotent kök hücre (hPSCs)-türetilmiş kardiyak ataları ve cardiomyocytes olan kök hücre tabanlı terapiler1,2,3 ve hızlı karakterizasyonu modelleme hastalığı için önceden gerekli Kardiyak farklılaşma4,5,6 ve Fizyoloji7,8düzenleyen yeni yollar. Her ne kadar bir dizi çalışmalar9,10,11,12,13,14,15 daha önce açıklanan yüksek verimli hPSCs kardiyak farklılaşma kurallarından, hiçbiri sol arasında önemli moleküler farklılıklar tanımlaması rağmen elde edilen cardiomyocytes kalp alan kökeni açıklama (ilk kalp alanı) ve değil (İkinci kalp alanı) ventrikül cardiomyocytes16 ve kalp özel alan konjenital kalp hastalıkları varlığı; Yani, hipoplastik sol kalp sendromu17 veya Aritmojenik Sağ ventrikül displazi18. Böylece, kardiyak ataları nesil ve hPSCs üzerinden tanımlanmış kalp alan kökenli cardiomyocytes tedavi edici olarak kendi alaka artırmak için bir zorunluluk haline gelmektedir ve modelleme araçları hastalığı.
Bu iletişim kuralı ID1, bu aktivin A, birlikte gerekli ve yeterli cardiogenesis hPSCs içinde başlatmak yakın zamanda belirlenen5 ilk kalp alanı belirtmek isteka bünye overexpression kullanır. Özellikle, Cunningham vd. (2017) 5 göstermek onlar kalp farklılaşma geçmesi gibi ID1 kaynaklı ataları özellikle ilk kalp alanı (HCN4, TBX5) ama değil ikinci kalp alan işaretleri (SIX2, ISL1) ifade. Buna ek olarak, yazarlar da genler (ID1-4), tüm kimliği ailesi eksik transgenik fare embriyo geliştirmek ilk kalp alan kardiyak ataları, orta ve posterior kardiyak ataları () daha fazla süre kurma olmadan göster İkinci kalp) hala, böylece kimliği proteinler ilk kalp alan cardiogenesis vivo içindebaşlatmak için gerekli olan düşündüren form alanı. Elverişli bir konuma sahip, ID1 kaynaklı ataları cryopreserved ve kendiliğinden ventrikül benzeri özellikleri ventrikül özgü işaretleri (IRX4, MYL2) ifadesi de dahil olmak üzere, görüntüleme cardiomyocytes ayırt etmek ve ventrikül benzeri Aksiyon potansiyelleri.
Burada ilk kalp alan benzeri (FHF-L) kardiyak ataları ve ventrikül benzeri cardiomyocytes ID1 overexpressing hPSCs oluşturmak için basit ve ölçeklenebilir bir yöntemi açıklanmaktadır. Bu protokol önemli bir özelliği uygun dondurma adım kullanarak sonraki cardiomyocyte üretim kardiyak yaratıcı nesil çözmek için olasılık var. Özetle, bu iletişim kuralını (1) oluşturmak ID1-overexpressing hPSCs, oluşturmak (2) FHF-L kardiyak ataları hPSCs, (3) cryopreserve elde edilen ataları ve (4) FHF-L kardiyak progenitör farklılaşma sürdürmek için gerekli adımları detayları ve oluşturmak yüksek oranda zenginleştirilmiş (> % 70-90) ventrikül benzeri cardiomyocytes yenerek.

<table><tbody><tr><td>ACTC1 antikoru</td><td>Sigma</td><td>A7811</td><td></td></tr><tr><td>Activin A</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>Hu Recom Activin A</td><td></td></tr><tr><td>Antibiyotik Antimikotik (Anti-Anti)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>B27 takviyesi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>B27 takviyesi insülini olmadan Thermo</td><td>Fisher Scientific A1895601</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27 takviyesi - A vitamini Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>12587001</td><td></td></tr><tr><td>CDH5 antikoru</td><td>R& D Sistemleri</td><td>AF938</td><td></td></tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>7930</td><td>Kriyoprezervasyon reaktifi</td></tr><tr><td>DMEM yüksek Glikoz Mediatech</td><td></td><td>10-013-CV&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, Ca & ile Mg</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>VWR</td><td>89510-186</td><td></td></tr><tr><td>FluoVolt membran potansiyel kiti ve nbsp; &nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F10488</td><td>Optik aksiyon potansiyeli elde etmek için lütfen McKeithan ve ark. 2017</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replasmanı</td><td>Gibco</td><td>10828010</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel, Büyüme Faktörü Azaltılmış</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>Kaplama reaktifi</td></tr><tr><td>mTeSR1 medya kiti</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>PBS, Ca & Mg</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Puromisin &</td><td>Acros</td><td>227422500</td><td></td></tr><tr><td>ReLeSR</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>5872</td><td>Enzim içermeyen ayrışma reaktifi</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>TAGLN antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab14106</td><td></td></tr><tr><td>Tiazovivin</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>72254</td><td>RHO / ROCK yolu inhibitörü</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12605 -010</td><td>1X enzim içeren ayrışma reaktifi</td></tr><tr><td>Tyrodes çözelti karışım paketleri&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T2145-10X1L</td><td>(Optik aksiyon potansiyeli elde etmek için lütfen McKeithan et al. 2017'ye bakın)</td></tr></tbody></table>

İlk kalp alan benzeri kardiyak ataları ve ventrikül benzeri cardiomyocytes insan pluripotent kök hücrelerden nesil

Generation of First Heart Field-like Cardiac Progenitors and Ventricular-like Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Üretimi cardiomyocytes tanımlanmış kalp alan kökenli ve fonksiyonel insan pluripotent kök hücreler elde edilen kalp ataları büyük miktarda hücre tabanlı kardiyak terapiler ve hastalık modelleme için önceden gerekli olduğunu. Son zamanlarda kimliği genler gerekli ve omurgalı geliştirme sırasında ilk kalp alan ataları belirtmek yeterli olduğunu göstermiştir. Bu farklılaşma protokolü bu bulgular güçlendirir ve ID1 overexpression beraber aktivin A güçlü belirten cues olarak ilk kalp alan benzeri (FHF-L) ataları üretmek için kullanır. Önemlisi, ortaya çıkan ataları verimli (~ 70-%90) ventrikül benzeri cardiomyocytes ayırt etmek. Burada ayrıntılı bir yöntem 1) oluşturmak ID1-overexpressing hPSCs ve 2) ayırt ölçeklenebilir miktarda cryopreservable FHF-L ataları ve ventrikül benzeri cardiomyocytes açıklayın.

HPSCs nesil ID1 satırları hPSCs ID1 overexpression (Şekil 1A) arabuluculuk bir lentivirus bulaşmış. Bir kez hPSCID1 oluşturulur, transgene ifade qRT-PCR (Şekil 1B) sayılabilir. Yalnızca hPSCID1 satırları ID1 mRNA GAPDH of 0.005 kat büyük seviyelerde ifade farklılaşma için kullanılmalıdır.
...

Burada ilk kalp alan benzeri kardiyak ataları ve ventrikül benzeri cardiomyocytes insan pluripotent kök hücre üretmek için aktivin A ve lentivirus-aracılı ID1-overexpression, basit bir birleşimini kullanarak ölçeklenebilir bir yöntem açıklanmaktadır.

İlk kalp alan benzeri kardiyak ataları ve ventrikül benzeri Cardiomyocytes insan Pluripotent kök hücrelerden nesil

The generation of large amounts of functional human pluripotent stem cells-derived cardiac progenitors and cardiomyocytes of defined heart field origin is ...

Bu basit tekniğin temel avantajı, tanımlanmış kalp alanı orijinli ve alt tipli kardiyak progenitörler ve kardiyomiyositler oluşturmaktır. Buna karşılık, ortaya çıkan hücreler, temel gelişimsel biyoloji, kavram kanıtı hücre temelli tedavi ve kalp hastalığı modelleme çalışmaları dahil olmak üzere çok çeşitli araştırma uygulamaları için kullanılabilir. Prosedürü göstermek laboratuvarımdan Sean Spiering ve Michael Yu olacak.Başlamak için, sonraki hücre tohumlama ve viral enfeksiyon adımlarına uyum sağlamak için 96 oyuklu bir plakanın yeterli sayıda kuyusunu 50 mikrolitre kaplama reaktifi ile kaplayın, ardından tohumlanan pluripotent kök hücreleri ayırmak için altı oyuklu plakadaki bir oyuğa bir mililitre ayrışma reaktifi ekleyin. Ardından, hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir plastik santrifüj tüpüne aktarmak için steril bir pipet kullanın. Tüpe, ayrışma reaktifini nötralize etmek için kalsiyum ve magnezyum içeren beş mililitre PBS ekleyin.Daha sonra hücreleri üç dakika boyunca 200 kez g'de santrifüjleyin. Santrifüjleme sonrası, süpernatanı atın ve ardından peletin yerinden çıkması için tüpü hafifçe vurun. Daha sonra hücre peletini bir mililitre kök hücre ortamında çözün.Ardından,

generation-first-heart-field-like-cardiac-progenitors-ventricular

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Biz büyük bir tedarik kardiyovasküler onarım için insan kalp atalarıdır ve fonksiyonel kardiyomiyositlerde türetilmesi sağlayan küçük moleküller ile tanımlanmış koşullar altında tutulan pluripotent insan embriyonik kök hücreleri doğrudan cardioblasts indüksiyonu için bir protokol kurduk.

Küçük Molekül İndüksiyon Pluripotent İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İnsan Kardiyak Öncüleri ve kardiyomiyositlerde Verimli türetilmesi

Pluripotent kök hücreler, embriyonik veya uyarılmış pluripotent kök (iPS) hücreleri ya, kardiyomiyositler dahil olmak üzere insan farklılaşmış hücrelerin, değerli bir kaynak oluşturmaktadır. Burada, bir embriyoid organları tabanlı protokol ile fonksiyonel insan kardiyomiyositlerin elde etmek için bunları nasıl kullanacağınızı gösteren, iPS hücrelerin kalp indüksiyon üzerinde durulacak.

İnsan kardiyomiyositleri Üretimi: Besleyici-ücretsiz İnsan Bağlı Pluripotent Kök Hücre A Farklılaşma Protokolü

Makale verimli seçici referans belirteçlerinin analizi nüfusun homojenliği ve kimliğini değerlendirmek için flow sitometri ile takip Wnt yolu, modüle göre kardiyomiyositlere insan pluripotent kök hücreleri ayırt etmek için ayrıntılı yöntem anlatılmaktadır.

Sitometrisi ile Yüksek Verim kardiyomiyositlerde İnsan pluripotent kök hücrelerin Farklılaşma ve Karakterizasyonu

Bu protokolde, hem fare hem de insan embriyonik kök hücrelerinden kardiyak progenitör hücrelerin türetilmesi gösterilecektir. Bu protokoldeki ana strateji, embriyonik kök hücre hatlarına tasarlanmış floresan raportörler kullanarak kardiyak progenitör hücreleri akış sitometrisi ile zenginleştirmektir.

Embriyonik Kök Hücreleri Kardiyak Progenitör Hücrelerinin türetilmesi

Biz kardiyomiyositlerde, endotel hücreleri ve düz kas hücreleri ve yama-aracılı sitokin teslimat hücre enjeksiyon birleştirerek nakledilen hücrelerin bütünleşmesini geliştiren bir dağıtım yöntemi, insan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin ayırt etmek için, üç yeni ve daha etkin protokollere sunuyoruz.

Pluripotent Kök Hücre Miyokard Onarım Kardiyak Hücreleri Türetilmiş

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden (hPSC-CM) türeyen kardiyomiyositlerin elektrofizyolojik karakterizasyonu, kardiyak hastalık modellemesi ve ilaç yanıtlarının belirlenmesi için çok önemlidir. Bu protokol, hPSC-CM'lerin çok elektrotlu diziler üzerinde ayrılması ve plakalanması, alan potansiyelinin ölçülmesi ve QT ve RR aralıklarının analiz edilmesi için gerekli olan bilgileri sağlar.

Çok Elektrodlu Diziler (ÇÇA&#39;lar) Kullanan İnsan Pluripotent Kök Hücresinden Türetilmiş Kardiyomiyositlerin (hPSC-CM&#39;ler) Elektrofizyolojik Analizi

Bu yöntemin amacı, progenitör hücre spesifikasyonu ve fonksiyonel özelliklerini incelemek ve kalp hastalığı modelleme için oda spesifik kardiyak hücreler oluşturmak için, in vitro kalp alanına özgü kardiyak progenitör hücreleri oluşturmadır.

In vitro Generation fare kalp alanı-spesifik kardiyak progenitor hücreler

Burada, hasta periferik kan mononükleer hücrelerinden insan kardiyomiyositlerini sağlam bir şekilde üretmek ve genişletmek için bir protokol sunuyoruz.

Hasta Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinden İnsan Kardiyomiyositlerinin Üretimi ve Genişlemesi

Burada, insan pluripotent kök hücrelerini kendi kendine örgütlenerek verimli bir şekilde kullanarak gelişimsel olarak ilgili insan kalbi organoidleri (hSO'lar) oluşturmak için bir protokol açıklıyoruz. Protokol, gelişimsel ipuçlarının sıralı aktivasyonuna dayanır ve son derece karmaşık, işlevsel olarak ilgili insan kalp dokuları üretir.

Pluripotent Kök Hücrelerden Elde Edilen Kendi Kendine Monte Edilen İnsan Kalbi Organoidlerinin Üretilmesi

Burada, yüksek verimli, çok boyutlu bir formatta kültürlenmiş, insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositlerden kardiyak sferoidlerin (CSs) üretilmesi ve kriyoprezervasyonu için bir dizi protokol sunulmaktadır. Bu üç boyutlu model, hastalık modellemesi, yüksek verimli taramalar için sağlam bir platform olarak işlev görür ve kriyoprezervasyondan sonra işlevselliğini korur.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Kardiyak Sferoidlerin Üretimi, Yüksek Verimli Taraması ve Biyobankacılığı

Keşfedin, insan pluripotent kök hücrelerinden Activin A ve Id1 aşırı ekspresyonu kullanarak kalp progenitörleri ve ventrikül benzeri kardiyomiyositler üretmek için ölçeklenebilir bir yöntem. Bu teknik, gelişim biyolojisi ve kalp hastalığı modelleme çalışmaları için tanımlanmış kalp alanı kökenli hücreler sağlar.

İlk kalp alan benzeri kardiyak ataları ve ventrikül benzeri Cardiomyocytes insan Pluripotent kök hücrelerden nesil

Daha fazla video keşfet