Taze ve donmuş Gastrointestinal örnekleri üzerinden hücre altı ayırma

Aşağıdaki protokolün amacı, donmuş veya taze gastrointestinal örneklerden hücre altı fraksiyonlar oluşturmaktır. Proteinler, bir hücre içindeki hemen hemen tüm biyolojik işlevlerinizde yer alır. Herhangi bir varyasyonda, bir konum arasında çıkarıldıkları patojenik bir senaryoya yol açabilir.

Bazı çalışmalar, protein lokalizasyonunun değerlendirilmesinden yararlanacak veya belirli bir hücresel bölmeden bir proteini istila etmesi gerekecektir. Bu nedenle, bozulmamış proteinlerin tekrarlanabilir fraksiyonasyonu bu açıdan önemlidir. Bağırsak biyopsi örnekleri son zamanlarda endoskopi prosedürleri sırasında elde edilebilir ve protein miktar tayini veya immünoçökeltme çalışmaları için etkili bir şekilde kullanılabilir.

Klinik bağırsak örnekleri, doku ve hastalığa özgü proteinlerin etkili bir şekilde tanımlanması için önemli bir kaynaktır. Bu yöntemin adı, endoskopi ile elde edilen insan bağırsak dokusunu, belirli bir protein veya protein komplekslerinin lokalizasyon analizi için nükleer ve sitoplazmik bölmelere ayırmaktır. Bu yöntem, her ikisinin de fraksiyonlanmasına hizmet eder.

İlk olarak, donmuş bağırsak biyozumuz gerçekleşir. Dondurulmuş doku prosedürü için, numuneleri ekstraksiyondan hemen sonra dondurun ve kullanılana kadar sıvı nitrojen içinde saklayın. Soğuk homojenizasyon tamponu eklenene kadar numunenin donmuş halde tutulması önemlidir.

Taze numuneler için biyopsiyi 1,5 mL'lik bir mikrotüpe aktarın ve prosedür başlayana kadar buz üzerinde tutun. Donmuş doku örnekleri genellikle kriyotüpün duvarına tutturulur, doku konik 1.5 mL'lik bir mikrotüpe aktarılmadan önce steril bir pipet ucu kullanılarak serbest bırakılabilir. Numuneyi içeren mikrotüpe DDT ve fosfataz ve proteaz inhibitörleri ile desteklenmiş 200 mL tampon ekleyin.

Doku tamamen bozulana kadar numuneyi bir kap ile homojenize edin ve buz üzerinde tutun. Numuneyi buz üzerinde 10 dakika inkübe edin. Hücre zarını bozmak için her numuneye 10 mL yüzde 1 deterjan ekleyin, yüzde 0.05'lik bir nihai konsantrasyona getirin.

Beş dakika buz üzerinde kuluçkaya yatırın. Kısa bir süre vorteks yapın ve iki dakika boyunca 4 derecede 400 g'da santrifüjleyin. Sitoplazmik protein fraksiyonunu içeren süpernatanı çıkarın ve temiz bir tüpe aktarın.

Peleti atmayın. Pelet, DDT ve fosfataz ve proteaz inhibitörleri ile desteklenmiş 200 mL tampon ikide yeniden süspansiyon haline getirin. 400 g'da 2 dakika santrifüjleyin.

Süpernatanı atın ve yıkama işlemini iki kez daha tekrarlayın. Üçüncü yıkamadan sonra, peleti 100 mL tampon ikide tekrar süspanse edin. 30 dakika boyunca 4 derecede kuvvetlice çalkalayın.

10 dakika boyunca en yüksek hızda 4 derecede santrifüjleyin. Nükleer protein fraksiyonunu içeren süpernatanı temiz bir tüpe aktarın. Sitoplazmik ve nükleer fraksiyonlar artık miktar tayini ve aşağı akış deneyleri için hazırdır.

Bağırsak mukozası çeşitli proteazlar açısından zengindir ve bu nedenle protein yıkımını en aza indirmek için ekstraksiyon sırasında protein yıkımının kontrol edilmesi gerekir, protein ekstraksiyon tamponlarına çoklu proteaz inhibitörleri dahil edilmelidir. Ek olarak, ekstraktlar ek tahliller için kullanılacaktır. Protein denatürasyonundan veya proteolizden kaçınmak önemlidir.

Bu da protein aktivitesi kaybına neden olur. Dokularda bulunan hücre-hücre ve hücre-matriks temaslarının bir sonucu olarak, hücre kültürlerinde rutin olarak kullanılan protein ekstraksiyon protokollerinde bazı modifikasyonların uygulanması gerekmektedir. Protein kalitesini etkilemeden hücrelerin transsellüler matriksten ayrılması, bağırsak dokusu proteinlerinin verimli izolasyonu için kritik bir faktördür.

Soldaki tablo, taze ve dondurulmuş 2 mL biyopsi örneklerinden elde edilen fraksiyonların her birinin protein konsantrasyonlarını göstermektedir. Konsantrasyonlar mikrolitre başına mikrogram cinsinden gösterilir. Bu deneyde, taze ve donmuş bir numune, protokol izlenerek aynı anda fraksiyonlandı.

Ve her numuneden 20 mg kullanılarak bir Western blot gerçekleştirildi. Fraksiyonların saflığını kontrol etmek için, sitoplazmik kontroller olarak HSP90 ve Tubulin ve nükleer kontroller olarak HDAC1 ve H3 kullanıldı. Görülebileceği gibi, HSP90 ve Tubulin esas olarak sitoplazmada ve HDAC1 ve H3 çekirdekte bulunur ve iki fraksiyon arasında çok kalıntı karışımı vardır.

Protokolün hücre ölümünü etkileyip etkilemediğini görmek için CASP3'ü de tespit ettik. Her iki numune de CASP3 için çok minimal bir boyama sunar ve biyopsilerin hızlı dondurulmasından sonra bile prosedürün hücre ölüm yolunu etkilemediğini doğrular. Bu deneyde kullanılan donmuş numuneler, bağırsak enflamatuar durumu olan bir kişiden geldi ve beklendiği gibi, pSTAT1 bu numunenin sitoplazmasında belirir, bu da protein modifikasyonlarının fraksiyonlamadan sonra korunduğunu doğrular ve bu nedenle aşağı akış fonksiyonel analizi için kullanılabilir.

Frozen biyopsilerde sonuçların tekrarlanabilirliği bu şekilde gösterilmiştir. Fraksiyonlar, minimum bölme protein karışımı ile temizdir. Taze ve donmuş biyopsiler bu protokollerde eşit olarak kullanılabilir, donmuş biyopsiler Şekil 1 ve 2'de görüldüğü gibi temiz ve tekrarlanabilir sonuçlar verir.

Burada açıklanan protokol, olası protein fraksiyonlarını oluşturmak için tasarlanmıştır. Bununla birlikte, dokunun boyutu ve durumu da dahil olmak üzere numune içindeki bazı içsel değişkenlikler, protein miktarlarında ve fraksiyonlardaki dağılım miktarlarında sapmalara yol açabilir.