Name: Iniciação de geração e demanda de atividade estável aguda em roedores e tecido humano (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Aprenda a induzir crises epilépticas agudas em fatias corticais de roedores e tecido humano usando 4-aminopiridina. Este método permite estudar mecanismos neurais de início e terminação de crises com registros eletrofisiológicos.

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Este trabalho foi apoiado pela institutos canadenses de pesquisa em saúde (MOP 119603 para Peter L. Carlen e Taufik A. Valiante), o Instituto do cérebro de Ontário (a Taufik A. Valiante) e a bolsa de pesquisa do estudante de Mightex (para Michael Chang). Gostaríamos de agradecer o Liam Long por sua assistência em filmar o vídeo manuscrito. Gostaríamos de agradecer a Paria Baharikhoob, Abeeshan Selvabaskaran e Shadini Dematagoda, por sua assistência na elaboração de figuras e tabelas neste manuscrito. Figura 1A, 3A, 4Ae 6A são todas as figuras originais, feitas a partir de dados publicados em Chang et al . 16.

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Os autores não têm nada para divulgar.

As fatias do cérebro são tratadas com uma droga proconvulsant ou um perfusato ACSF alterado para aumentar a excitabilidade da rede neural e promover uma precipitação de estável eventos (electrographic apreensão-como). Para os ratos, as fatias coronais preferenciais da área somatossensorial-motor devem conter o córtex cingulado, área 2 (CG), mas não a área de retrosplenial (RS); estes marcadores anatômicos ajudam a identificar a gama de fatias coronais que são melhores para induzir eventos estável. Uma modificação opciona...

Modelos de convulsão aguda com êxito podem reproduzir electrographic assinaturas reminiscentes de eventos estável observados no eletroencefalograma (EEG) de indivíduos tendo uma convulsão. Os pesquisadores utilizam esses eventos como estável (aqui referidos como 'eventos estável') como substitutos para a apreensão de evento1. Clinicamente, estável eventos servem como um proxy confiável para eventos de apreensão desde convulsões são um transtorno neurológico que se origina no cérebro. Na unidade de monitorização de epilepsia, neurologistas dependem a detecção de eventos estável para confirmar eletrofisiolÃ região do cérebro e isolá-lo para ressecção2. Em unidade de terapia intensiva, os médicos monitoram atividade estável para avaliar se alguma atividade de apreensão persiste em pacientes sedado3. Controlar convulsões continua a ser uma questão desafiadora para a comunidade médica, como 30% dos pacientes de epilepsia são resistentes aos medicamentos, a medicação disponível4,5, e 10% dos casos médicos envolvendo convulsões induzidas por drogas são Não responde ao tratamento padrão3. Isto apresenta uma preocupação séria para a sociedade, como 10% da população americana é prospectado para experimentar um evento de apreensão em sua vida e 3% são esperados para desenvolver epilepsia6.
Estudando as apreensões em modelos de epilepsia crônica é caro, trabalhoso e muitas vezes levar meses para preparar a7. É também difícil de executar gravações eletrofisiológicas em animais movimentando-se livremente. Ensaios clínicos humanos enfrentam problemas semelhantes, bem como as complexidades adicionais relacionadas com o consentimento do paciente, variabilidade nas origens dos participantes e as considerações morais e éticas envolvidas8. Modelos de convulsão aguda, por outro lado, são favoráveis, porque eles são relativamente conveniente para preparar, custo-eficiente e capaz de gerar grandes volumes de eventos estável para estudo9. Além disso, o tecido é fixo em uma posição estável, assim que as condições são ideais para a realização das gravações eletrofisiológicas necessárias para estudar a dinâmica de apreensão e a fisiopatologia subjacente relacionada. Modelos de convulsão aguda permanecem favoráveis sobre modelos em silico (computador), porque eles são baseados no material biológico composto de rede neuronal constituintes do cérebro com todos os seus factores inerentes e conectividade sináptica, que não pode ser capturada por computador até os mais detalhado modelos10. Estas características fazem modelos de convulsão aguda preparados para ser eficiente na triagem para potenciais anti-apreensão terapias e fazer conclusões preliminares antes de avançá-los para maiores investigações em modelos de epilepsia crônica e ensaios clínicos.
Normalmente, modelos de convulsão aguda são derivados do tecido cerebral normal que tenha sido submetido a condições hiperexcitável. Para induzir eventos estável clinicamente relevantes no tecido cerebral saudável, é importante compreender que o cérebro funciona otimamente em um estado crítico11 onde (E) de excitação e inibição (I) são equilibradas12. Uma interrupção do E-eu balanço pode levar ao estado de hiperexcitável apreensão em que precipitam eventos estável. Da mesma forma, dentro deste quadro conceptual, há duas estratégias principais para gerar eventos estável em fatias de cérebro (em vitro) ou em preparações todo-cérebro (na vivo): diminuição da inibição ("desinibição") ou aumentada excitação ("não-desinibição"). No entanto, eventos estável são altamente ordenados e sincronizado eventos que exigem a influência dos interneurônios gabaérgica para orquestrar a rede neural atividade13,14. Por esta razão, não-desinibição modelos são os mais eficazes para gerar eventos estável em redes neurais isolados, como em um em vitro cérebro fatia15, Considerando que em vitro modelos desinibição comumente levam a picos de atividade reminiscência de interictais como cravação. Além disso, dentro deste quadro conceptual, um evento de sincronização momentâneo confiável também pode desencadear um evento estável16. Na verdade, um evento estável pode ser desencadeado por qualquer pequena perturbação aplicada ao sistema neural17 quando está em um estado crítico de transição ("bifurcação") ponto18. Tradicionalmente, estas perturbações foram induzidas por estimulação elétrica. No entanto, o recente desenvolvimento de optogenetics em neurociência, oferece agora uma estratégia mais elegante para induzir transições de estado crítico16.
Os métodos descritos neste artigo demonstram como gerar eventos estável sob demanda em modelos de convulsão aguda para tanto in vitro (etapa 1 do protocolo) e na vivo estudos (etapa 2 do protocolo). Eles envolvem a escolha da região do cérebro, método de indução de convulsões, tipo de estudo e espécie; no entanto, o foco será sobre a escolha recomendada de um modelo de apreensão de cortical aguda 4-AP devido à sua versatilidade em uma grande variedade de tipos de estudo. O modelo 4-AP convulsão aguda em vitro é baseado no protocolo padrão para preparar fatias de cérebro de alta qualidade para gravações eletrofisiológicas e19estudos de imagiologia. Esses protocolos já tem sido usados para fazer em vitro coronal do cérebro fatias de córtex somatossensorial-motor de ratos16,20 e humanos21. Modificações para gerar eventos estável nestes tipos de fatias do cérebro tenham sido demonstradas anteriormente16 e os detalhes são descritos no protocolo abaixo. O modelo 4-AP cortical convulsão aguda na vivo é baseado no protocolo padrão para preparar uma craniotomia para estudos22de imagem. A modificação é que nenhuma janela (lâmina de vidro) é instalada após a craniotomia. Em vez disso, agentes proconvulsant (4-AP) são topicamente aplicados ao córtex exposto para induzir eventos estável, enquanto o animal está sob anestesia geral. A nosso conhecimento, nosso grupo foi o primeiro a desenvolver este modelo de apreensão cortical aguda na vivo em camundongos16,23. O modelo 4-AP cortical convulsão aguda na vivo preparado a partir de ratos adultos foi desenvolvido para complementar o modelo in vitro fatia do tecido juvenil. A replicação das conclusões no modelo de apreensão adulto na vivo contribui para generalizar os resultados de modelos de fatia, abordando as preocupações inerentes sobre as condições de não-fisiológica de uma fatia do cérebro 2D (contra um 3D todo-cérebro estrutura) e as diferenças fisiológicas entre jovens e adulto de tecido.
O método de início de evento estável sob demanda é demonstrado usando ou sopros de neurotransmissores com uma estratégias de picospritzer ou optogenetic. O melhor de nosso conhecimento, nosso grupo é a primeira a iniciar eventos estável em tecido humano usando neurotransmissores através de um picospritzer16. Estratégias de optogenetic, a cepa de camundongos C57BL/6 é a tensão convencional usada para expressar transgenes. A expressão de channelrhodopsin-2 (ChR2) em interneurônios gabaérgica ou células piramidais glutamatérgico irá fornecer a capacidade opcional para gerar eventos estável on-demand com breves pulsos de luz. Cepas de ratos optogenetic adequado incluem a variante C57BL/6 comercialmente disponível que expressa ChR2 em qualquer interneurônios, usando o rato vesicular GABA transportador promotor (VGAT)24, ou células piramidais, usando o antígeno da pilha do mouse Timo 1 promotor (Thy1)25. Estes ratos VGAT-ChR2 e Thy1-ChR2 comercialmente disponíveis oferecem a oportunidade de ativar os neurônios gabaérgica ou neurônios glutamatérgico, respectivamente, no neocórtex com azul (470 nm) luz. A capacidade de gerar eventos estável sob demanda em modelos de convulsão aguda pode oferecer novas oportunidades para estudar a dinâmica de iniciação de apreensão e eficientemente avaliar potenciais terapias anti-apreensão.

<table><tbody><tr><td>Pentobarbital de sódio</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Comprado através dos fornecedores do Toronto Western Hospital</td></tr><tr><td>Seringa de 1 mm</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Comprado através da UT Med Store</td></tr><tr><td>25G Agulha estéril de 5/8"</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Comprado através da UT Med Store</td></tr><tr><td>Lâmina de barbear de borda única (2x)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Comprado através da UT Med Store</td></tr><tr><td>Cola adesiva instantânea</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Comprado através da UT Med Store</td></tr><tr><td>Papel para lentes</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Comprado através da UT Med Store</td></tr><tr><td>Placa de Petri de vidro (2x)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Comprado através da UT Med</td></tr><tr><td>Store Pinça de lascas (2x)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Comprado através da UT Med Store</td></tr><tr><td>Micro espátula com cabo de PVC</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Comprado através da UT Med </td></tr><tr><td>Loja Micro colher com extremidade plana</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Comprado através da UT Med</td></tr><tr><td>Loja Escova de detalhamento 5/0</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Comprado em uma loja de arte boutique</td></tr><tr><td>Pipeta de transferência de furo largo</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Comprado através da UT Med Store</td></tr><tr><td>Pinça Dental</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Comprado através da UT Med</td></tr><tr><td>Loja Termômetro (digital)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Comprado no tanque de</td></tr><tr><td>carbogênio de Amazon.ca Check (95%O2/5%CO2)&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Comprado através dos Fornecedores do Toronto Western Hospital</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td>Comprado através da</td></tr><tr><td>câmara de incubação de fatias de cérebro dos Fornecedores do Toronto Western Hospital (também conhecido como guardião de fatias de cérebro)&nbsp;</td><td>Scientific Systems Design Inc</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Sódio (NaCl)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Comprado através da UT Med Store</td></tr><tr><td>Bicarbonato de Sódio</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Comprado através da UT Med Store</td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>N/</td><td>A N/A</td><td>Comprado através da UT Med Store</td></tr><tr><td>Cloreto de Potássio (KCl)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Comprado através da UT Med Store</td></tr><tr><td>Sulfato de Magnésio (MgSO4 H2O)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Comprado através da UT Med Store</td></tr><tr><td>Fosfato de sódio monobásico monohidratado (HNaPO4&middot; H2O)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Comprado através da UT Med Store</td></tr><tr><td>Cloreto de Cálcio (CaCl2&middot; 2H2O)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Comprado através da UT Med Store</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Comprado através da UT Med Store</td></tr></tbody></table>

iniciação de geração e demanda de atividade estável aguda em roedores e tecido humano

Generation and On-Demand Initiation of Acute Ictal Activity in Rodent and Human Tissue

Controlar convulsões permanece uma questão desafiadora para a comunidade médica. Para progredir, pesquisadores precisam de uma maneira extensivamente estudar a dinâmica de apreensão e investigar seus mecanismos subjacentes. Modelos de convulsão aguda são convenientes, oferecem a capacidade de realizar gravações eletrofisiológicas e podem gerar um grande volume de electrographic apreensão, como de eventos (estável). Os resultados promissores de modelos de convulsão aguda então podem ser avançados para modelos de epilepsia crônica e ensaios clínicos. Assim, estudar convulsões em modelos agudas que reproduzem fielmente as assinaturas electrographic e dinâmicas de uma convulsão clínica será essencial para fazer achados clinicamente relevantes. Estudar eventos estável em convulsão aguda modelos preparados a partir de tecido humano também é importante para fazer descobertas que são clinicamente relevantes. O foco principal deste artigo é sobre o modelo 4-AP cortical devido a sua versatilidade em gerar eventos estável em estudos tanto in vivo e in vitro , bem como em rato e tecido humano. Os métodos neste artigo também irão descrever um método alternativo de indução de convulsões, usando o modelo2 + Zero-Mg e fornecer uma visão geral detalhada das vantagens e limitações da atividade epileptiforme semelhantes gerados em diferentes aguda modelos de apreensão. Além disso, aproveitando comercialmente disponível optogenetic cepas de rato, um pulso de luz breve (30 ms) pode ser usado para acionar um evento estável idêntico àqueles que ocorrem espontaneamente. Da mesma forma, 30-100 ms sopros de neurotransmissores (ácido gama-Amino butírico ou glutamato) podem ser aplicados para o tecido humano para acionar eventos estável que são idênticos aos que ocorrem espontaneamente. A capacidade de desencadear eventos estável sob demanda em modelos de convulsão aguda oferece a recém-descoberta capacidade de observar a sequência exata dos eventos que dão suporte à dinâmica de iniciação de apreensão e com eficiência, avaliar potenciais terapias anti-apreensão.

A aplicação de 100 µM 4-AP para (sem danos) 450 fatias de cérebro cortical µm de tamanho boa qualidade de um juvenil VGAT-ChR2 rato induzido confiável estável eventos recorrentes (&gt; 5 s) dentro de 15 min (Figura 1Ai). A aplicação de 100 µM 4-AP para fatias de má qualidade resultou na ruptura eventos ou spiking atividade (Figura 1Aii). Em média, 40% das fatias de cada cérebro de rato dissecado gerado com êxito eventos estável. ...

Modelos de convulsão aguda são importantes para estudar os mecanismos subjacentes epileptiforme eventos. Além disso, a capacidade de gerar eventos epileptiforme sob demanda fornece um método altamente eficiente para estudar a sequência exata de eventos subjacentes a sua iniciação. Aqui, descrevemos os modelos de apreensão cortical aguda 4-aminopiridina estabelecidos em mouse e tecido humano.

Iniciação de geração e demanda de atividade estável aguda em roedores e tecido humano

Controlling seizures remains a challenging issue for the medical community. To make progress, researchers need a way to extensively study seizure dynamics ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no estudo de mecanismos de apreensão, como, como, quais subpopulações neurais são responsáveis pelo início e término da convulsão eletrográfica. A principal vantagem dessa técnica, é que ela pode reproduzir eventos de convulsão eletrográfica, sob demanda, e modelos in vivo e in vitro que lembram os observados clinicamente. Esta técnica também pode ser usada para procurar potenciais terapias anticonvulsivas, tentando desencadear eventos de convulsão eletrográfica durante a aplicação de diferentes candidatos a medicamentos anticonvulsivos.Para preparar as fatias corticais, cole o tecido cerebral pré-clínico no estágio Vibratome, usando cola adesiva instantânea. Coloque suavemente o suporte de especimin na bandeja de buffer. Assegure-se de que a parte dorsal do cérebro está virada para a lâmina do Vibratome.Corte o cérebro em seções de 450 micrômetros de espessura, na direção dorsal para ventral. Faça o primeiro corte no cérebro animal pré-clínico para remover a lâmpada olfativa. Em seguida, faça cortes subsequentes até que a área motora somatosensorial seja observada.Use uma pipeta larga. Transfira as fatias coronais direcionadas

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este vídeo demonstra a indução de eventos ictais em fatias corticais coronais de um camundongo transgênico expressando canais catiônicos ativados por luz em neurônios piramidais excitatórios corticais. A fatia é colocada em uma câmara de registro e um eletrodo de registro é inserido na camada cortical superficial. Após a perfusão com uma droga indutora de convulsões que bloqueia os canais de potássio, os neurônios tornam-se hiperexcitáveis e geram eventos ictais espontâneos. Para gerar eventos...

Geração de eventos ictais espontâneos e sob demanda em fatias corticais de cérebro de camundongo

Fonte: Jang, S., et al, Convulsões eletroconvulsivas em ratos e fracionamento de seus hipocampos para examinar alterações induzidas por convulsões em proteínas de densidade pós-sinápticas. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demonstra a indução de uma convulsão eletroconvulsiva aguda (ECS) em um modelo de rato para estudar a neuroplasticidade induzida por convulsões. Os pesquisadores aplicam estimulação elétrica por meio de eletrodos de clipe de ouvido, desencadeando hiperexcitabilidade neuronal e...

Induzindo uma convulsão eletroconvulsiva aguda em um modelo de rato

Genes podem ser manipulados durante o desenvolvimento do córtex ou do hipocampo do rato via in utero eletroporação (IUE) em E16, para permitir modificações rápidas e direcionadas na conectividade neuronal para estudos posteriores do comportamento ou neuropatologia em animais adultos. Pós-natal em imagem in vivo para o controle do sucesso IUE é realizada por bioluminescência de ativar luciferase cotransfectados.

Geração de topicamente transgênicas Rats por<em&gt; In utero</em&gt; Eletroporação e<em&gt; In vivo</em&gt; Triagem Bioluminescência

Aqui demonstramos o uso de uma tecnologia de habilitação sem fio para eletroencefalograma (EEG) em modelos de roedores neonatais de doenças humanas. Com a telemetria, não há conexões onerosas, permitindo assim comportamentos naturais.

Monitorização EEG contínuo a longo prazo no pequeno roedor modelos de doença humana, utilizando o Sistema Epoch transmissor sem fio

Oscilações são propriedades fundamentais da rede e são modulados pela doença e drogas. Estudar oscilações cérebro-slice permite a caracterização das redes isoladas em condições controladas. Protocolos são fornecidos para a preparação de fatias cerebrais agudos para evocar CA1 oscilações γ.

Geração de locais Oscilações CA1 γ por Tetânica Estimulação

Este protocolo detalhado descreve a colocação de eletrodos de estimulação transcraniana no osso temporal a fim de investigar os efeitos a curto e longo prazo da estimulação elétrica transcraniana em ratos movimentando-se livremente.

Estimulação elétrica transcraniana crônica e gravação Intracortical em ratos

Ilustramos como executar gravação e elétrica de modulação da atividade epileptiforme 4-aminopiridina-induzida em fatias de cérebro de roedor usando matrizes de microeletrodos. Uma câmara de gravação personalizada mantém a viabilidade do tecido durante prolongadas sessões experimentais. Viver o mapeamento de eletrodo e seleção de pares estimulantes são executadas por uma interface de usuário gráfica personalizada.

Gravação e modulação da atividade epileptiforme em fatias de cérebro de roedor acoplado para matrizes de microeletrodos

O protocolo apresentado descreve o transporte e a preparação de tecido hipocampal humano ressecado com o objetivo final de usar fatias cerebrais vitais como uma ferramenta de avaliação pré-clínico para potenciais substâncias antiepilépticas.

Preparação de fatias hipocampais humanas agudas para gravações eletrofisiológicas

Aqui, descrevemos a preparação de fatias organotipicas do córtex-hipocampo rhinal. Sob uma privação gradual e controlada de soro, essas fatias retratam eventos epilépticos em evolução e podem ser consideradas um modelo ex vivo de episetogênese. Este sistema representa uma excelente ferramenta para monitorar a dinâmica da atividade espontânea, bem como para avaliar a progressão das características neuroinflamatórias ao longo do curso da epipesogênese.

Um Modelo de Epipetogênese em Culturas de Fatia Organotipica Do Cortex-Hipocampo Rhinal

Este relato descreve os métodos para gerar um modelo de epilepsia do lobo temporal baseado no kindling elétrico de camundongos VGAT-Cre transgênicos. Camundongos VGAT-Cre acesos podem ser úteis para determinar o que causa epilepsia e para rastrear novas terapias.

Preparação e implantação de eletrodos para kindling elétrico de camundongos VGAT-CRE para gerar um modelo para epilepsia do lobo temporal

Aqui, apresentamos dois protocolos para registro de microeletrocorticografia de alta densidade (μEcoG) em ratos e camundongos, incluindo métodos cirúrgicos, de implantação e de registro. As gravações de μECoG são realizadas em combinação com a gravação de politrodo laminar no córtex auditivo de ratos ou com a manipulação optogenética da atividade neural no córtex somatossensorial de camundongos.

Investigações Multiescala de Processamento Cortical Integrando Politrodos Laminares e Optogenética com Microeletrocorticografia em Roedores

Aprenda a induzir crises epilépticas agudas em fatias corticais de roedores e tecido humano usando 4-aminopiridina. Este método permite estudar mecanismos neurais de início e terminação de crises com registros eletrofisiológicos.

Iniciação de geração e demanda de atividade estável aguda em roedores e tecido humano

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