מבוסס על צלחת Large-scale טיפוח Caenorhabditis elegans: הכנת הדוגמא על המחקר של שינויים מטבוליים בחולי סוכרת

בתחום C.elegans, שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח הדורשות ייצור של אוכלוסיות נמטודות גדולות ודגימות באמצעות תרבית צלחות. היתרונות העיקריים של פרוטוקול זה הם הקמתו הקלה, וקלות התיאור שלו, כולל מלכודות ויישומים. לאחר השגת אוכלוסייה מסונכרנת של נמטודות, הוסף כמיליליטר אחד של מאגר M 9 לצלחות, וחלק בזהירות את המאגר על ידי הנפת הצלחות.

לאחר מכן, אספו את הנמטודות בצינור של 15 מיליליטר. כעת, הפוך את הצינור והשתמש במיקרוסקופ כדי להעריך את צפיפות הנמטודות. התאם את צפיפות המתלה לפי הצורך, והמשך להעריך אותו במיקרוסקופ.

מרחו 150 מיקרוליטר מהמתלה ישירות על הצלחות בעזרת קצות פיפט ששונו. כדי להבטיח חלוקה שווה של נמטודות בין הלוחות, הפוך את צינור המתלה במרווחי זמן קבועים. ראשית, שטפו את הנמטודות באמצעות קצה פיפט שונה עם כ-500 מיקרוליטר של מאגר M nine.

בעזרת אותו חיץ, המשיכו לנתק את הנמטודות עד שרוב החיות נאספות בתרחיף. לאחר מכן, קח את הנמטודות עם קצה פיפט שונה, והעביר אותן לצלחת עם OP50. קצות הפיפט ששונו מפחיתים את מתח הגזירה והנזק לנמטודות בגלל קוטר גדול יותר.

לאחר מכן, הניחו לצלחת להתייבש. לפני איסוף הדגימות, הכינו חנקן נוזלי כדי להקפיא את הנמטודות שנאספו. לאחר מכן, הניחו את M 9 buffer על הקרח.

מרחו מיליליטר אחד של מאגר M nine על כל צלחת, וסובבו בעדינות כדי לשטוף כל צלחת. לאחר מכן, קח את הנפח של מאגר M nine, והעביר אותו לצינורות חדשים של 15 מיליליטר. צנטריפוגה את הצינור לזמן קצר ב-800 פעמים גרם, לפני הסרת רוב המאגר M nine.

לאחר מכן, שטפו את הדגימות שלוש פעמים עם 10 מיליליטר של מאגר M nine כדי להסיר חיידקים. בעזרת פיפטת זכוכית מעבירים כל כדור לצינור ריק של 1.5 מיליליטר. השתמש בפיפטת הזכוכית כדי לקחת מיליליטר אחד של מאגר M 9 מהצינור השני של 1.5 מיליליטר, כדי לשטוף את הנמטודות מדופן הפיפטה.

לאחר מכן, שטפו את הנמטודות הנותרות מצינורות 15 מיליליטר, והעבירו אותן לצינורות הדגימה. לאחר מכן, צנטריפוגה את צינורות הדגימה ב-19,000 פעמים גרם למשך דקה אחת, והסר כמה שיותר סופרנטנט. לאחר מכן, אטמו כל צינור בסרט פרפין, והקפיאו אותם מיד בחנקן נוזלי.

אחסן את הצינורות במינוס 80 מעלות צלזיוס עד להכנת ליזאט. הוסף את אותם נפחים של חרוזי תחמוצת זירקוניום 0.5 מילימטר, וכפול מנפח מאגר הליזאט עם קוקטייל מעכב פרוטאינאז לכל דגימה קפואה. לאחר מכן, הניחו את הצינורות בהומוגנייזר למשך דקה אחת במהירות תשע.

צנטריפוגה של הדגימות למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס, ו-19,000 פעמים גרם. לבסוף, העבירו את הסופרנטנט לצינור חדש על קרח, ואחסנו אותו במינוס 80 מעלות צלזיוס לניסויים עתידיים. בפרוטוקול זה, כמויות גדולות של C.elegans תורבבו ליישומים בחקר הסוכרת.

מספר הנמטודות שנאספו נמצא בקורלציה לתפוקת החלבון של הליזאט, מה שמדגים שניתן להשיג בידוד חלבון כמותי הניתן לשחזור באמצעות פרוטוקול זה. ניתוחים ספקטרומטריים של המטבוליט התגובתי מתילגליוקסל, ותוצרי קצה גליקציה מתקדמים שנוצרו על ידי חשיפה למתילגליוקסל מוצגים כאן. נמטודות ובקרות שטופלו בגלוקוז הושוו.

העברת נמטודות באמצעות פיפטה עלולה ליצור מתח גזירה, מה שעלול לפגוע בנמטודות. רמות העקה החמצונית בנמטודות ובנמטודות שהועברו באמצעות חוט מתכת לא היו שונות באמצעות פרוטוקול זה. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו כתם מערבי, על מנת לענות על שאלות נוספות בפרוטאומיקה.

פרוטוקול זה גם מקל על ניסויים המקשרים פרמטרים מרובים לאותה אוכלוסייה.