Очистка внеклеточного трипаносом, в том числе африканских, от крови на Аниониты (Diethylaminoethyl целлюлоза столбцы)

Африканские трипаносомы несут ответственность за человека африканского трипаносомоза, или сонной болезни и животных африканского трипаносомоза. Трипаносомы, которые вызывают сонной болезни цеце летать передаются протистских паразитов, присутствующих во многих географических очагов в странах Африки к югу от Сахары. Обнаружение паразита имеет важное значение для диагностики, лечения и последующей деятельности.

Серология может дать ложноположимые и, к сожалению, ложные отрицательные результаты. Чтобы помочь обнаружению в крови, трипаносомы должны быть сконцентрированы. Были использованы различные методы концентрации паразитов.

Наиболее чувствительным методом является отделение паразитов от крови колонкой аниообматора, целлюлозы DEAE с последующим центрифугой и микроскопическим наблюдением. Следовательно, метод целлюлозы DEAE является лучшим и остается на сегодняшний день, эталонный метод для визуализации и изоляции паразитов из крови для человеческой африканской диагностики трипаносомоза, особенно в полевых условиях. Этот метод, наиболее подходящий диагностический для африканского трипаносомоза также обеспечивает очищенных паразитов для иммунологических, биологических, биохимических, фармацевтических и молекулярных биологических исследований.

Все исследования соответствовали руководству по уходу и использованию лабораторных животных, и было получено согласие от французских властей, и все используемые протоколы были одобрены нашим местным комитетом по этике. Взвешивание каждого вещества в соответствии с письменным протоколом. Добавить дистиллированную воду и настроить точно рН 8 с фосфатом дигидрогена калия, чтобы сделать следующие буферные растворы, концентрированный фосфатный буфер солевой 2X.

Добавьте дистиллированную воду и глюкозу для фосфатной буферной солевой глюкозы. Для 100 миллилитров элюционного буфера добавьте 100 единиц на миллилитр пенициллина, 100 микрограммов на миллилитр стрептомицина и пять микрограммов миллилитра фенола красного до фосфатной буферной солевой глюкозы. 100 граммов целлюлозы DEAE сначала промывают тремя литрами дистиллированной воды, а затем слева, чтобы поселиться.

Мелкие частицы отбрасываются. Моет повторяются до тех пор, пока супернатант не будет ясен. Добавляется концентрированный фосфат буферный солевой раствор 2X и перемешивается целлюлоза DEAE.

РН регулируется до восьми с одним молярным фосфатом калия. Затем целлюлозу дважды промывают дистиллированной водой и дважды с фосфатной буферной солевой глюкозой. Целлюлоза DEAE и фосфат буферизированная солевая глюкоза смешиваются в равных объемах.

Сплав четверть и хранится при комнатной температуре или четыре градуса по Цельсию или при минус 20 градусах по Цельсию для длительного хранения. Трипаносомная зараженная кровь хранится в жидком азоте. Кварта сплава в один миллилитр размороживается при комнатной температуре.

Паразиты тщательно собираются из криотрубы с помощью иглы и одного миллилитрового шприца. Жизнеспособность таящих паразитов оценивается по подвижности, как визуализированы наблюдения световой микроскопии перед инфекцией. Паразиты вводятся в брюшной полости двух мышей, 500 микролитров на мышь.

Каждый день после заражения паразитами оценивается путем сбора капли крови из хвоста с помощью иглы и проверяется с помощью микроскопии. Когда паразитмия находится на подходящем уровне, зараженная кровь собирается. 10 миллилитров шприц поддерживается в зажим или держатель и предварительной кусок фильтровальной бумаги добавляется.

Подготовленная целлюлоза DEAE выливается в шприц до уровня восьми-девяти миллилитров. Колонна промывается буфером elution. Два миллилитров зараженной крови аккуратно помещаются поверх колонны, а трипаносомы собираются в колонке элуат в 50-миллилитровой центрифугированной трубке.

Буфер Elution регулярно добавляется в зависимости от транзита трипаносом. Транзит трипаносом через столбец проверяется путем принятия капли колонки eluate через регулярные промежутки времени и наблюдения за трипаносомы с помощью световой микроскопии. Когда трипаносомы больше не наблюдаются в элуате, коническая трубка центрифугирована при 1800 раз G в течение 10 минут при четырех градусах по Цельсию.

Супернатант отбрасывается и трипаносомы в поддоне подсчитываются гемоцитометром. Собранные трипаносомы впоследствии разбавляются в среде, необходимой для запланированного расследования. Этот метод, наиболее подходящий диагностический для африканского трипаносомоза обеспечивает очищенных паразитов для иммунологических, биологических, биохимических, фармацевтических и молекулярных биологических исследований.

Эти исследования были разработаны потому, что DEAE целлюлозы очищенных паразитов могут быть легко получены в больших количествах от естественно или экспериментально инфицированных хозяев и, в частности, грызунов. Трипаносомная жизнеспособность в присутствии фармацевтических препаратов оценивается микроскопическими наблюдениями. Жизнеспособность паразитов связана с подвижностью и, следовательно, может быть проверена глазом под световым микроскопом в 40 раз или выше.

Жизнеспособность паразитов оценивается путем измерения процента подвижных форм. Разбавления тестовых соединений добавляются в каждый колодец из 96 хорошо ткани культуры пластины в то время как контроль скважины макет лечение. Каждая концентрация оценивается в триликат.

Количество жизнеспособных паразитов для каждого разбавления сравнивается с количеством паразитов в контрольных скважинах. Эффекты Пентамидина, эталонный препарат, используемый в человеческой африканской трипаносомоз терапии отображается на этой цифре. Трипаносомные макрофаги со-культуры позволяют исследование взаимодействия паразитов-хозяина на клеточном уровне.

В макрофаге паразитов со-культуры, дополнительные клеточные трипаносомы вызывают производство макрофагов аргиназы, что гидролизы аргинина орнитина. Орнитин является предшественником полиамина и трипанотиона, необходимого для выживания паразитов и роста. Кроме того, истощение аргинина уменьшает выработку трипаноцидного оксида азота.

Впоследствии, добавление ингибитора аргиназы, S-L-цистеина к совместной культуры резко снижает макрофаг индуцированного роста паразитов. Индукция аргиназы опосредована трипаносомой, выделяемой и /или выделенными факторами. Этот индуцирующие фактор аргиназы был определен как кинезин ортина.

Кинезин связывается с рецепторами связывания лектина С-типа. Аргиназа индуцируется и производит орнитин, который способствует росту паразитов. Аргиназа не индуцируется кинезином в макрофагах, культурных с 12,5 миллимолярдной маннозой или в макрофагах мышей, где макрофаг маннозных рецепторов были удалены.

Дальнейшие примеры клеточной биологии и биохимических экспериментов с использованием клеточной целлюлозы DAEA очищенные трипаносомы продемонстрированы в исследованиях, где новые цитоскелетные белки, такие как BILBO1 был определен. BILBO1 необходим для биогенеза важных цитоскелетных структур и выживания паразитов. Таким образом, BILBO1 представляет собой важную цель для вмешательства в патогенные трипаносомы.

На рисунке показано изображение, показывающее иммунофлуоресценцию, маркированную формой культуры кровотока, клетку трипаносомы бруци, исследованную анти-BILBO1 антителом. Кроме того, метаболизм глюкозы и треонина были описаны с использованием ДИАЭ целлюлозы очищенные трипаносомы и ферменты, участвующие в этих процессах были экспериментально проверены. Схематичное представление метаболизма глюкозы и треонина в кровоток-сформированных трипаносом показано на этой цифре.

Очистка африканских трипаносом из крови анионом обменивает целлюлозные колонки DEAE с недавними улучшениями остается золотым стандартом для обнаружения трипаносомы, не только у естественных хозяев с низким содержанием паразитов в эндемичных районах, но и для требования паразитов в больших количествах для экспериментальных исследований. Исследования позволили выясвоить трипаносомные молекулы, играющие важную роль в выживании и росте паразитов. Выявленные целевые показатели могут стать основой для будущей вакцины с потенциальными антигенами как для человека, так и для животных в одном подходе к здоровью.