אלקטרודה מיקרו-אגר מלח גשר ניתוח שיעור תחלופה פרוטון של חלבוני ממברנה רקומביננטי

שיטה זו יכולה לעזור עם חקירה של חלבוני קרום כגון מובילים וערוצים. המידע על אובדן שיעור תחלופת מצע המשווה בין פעילות החלבון וספנטיות לבין התנאים הפיזיולוגיים והפתולוגיים השונים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא ממזערת וריאציית הזזה פוטנציאלית ותנאי חיץ חופשיים של כלוריד.

ומגדיל באופן משמעותי את הדיוק של קביעת שיעור המחזור עקב מדידות פוטנציאליות מדויקות יותר של קרום. לאסוף את האלמנטים למדרגות האגרוף. אלה כוללים שני טיפים פיפטה מיקרו נימי, להב חד ו caliper הזזה.

עבור האלקטרודה יש חוט כסף, נייר חול ותספורת אשלגן כלורי טוחנת בהישג יד. בנוסף יש אתנול ומים לניקוי ואספקת חשמל DC. המשך בעבודה עם שני הטיפים למיקרו-פיפטה.

התחל עם הקצה שיכיל את המאגר. מניחים את הטיפ השני ליד הראשון. הזז את הקצה השני, כך שכאשר יוכנס החלק הצר שלו ירחיב לפחות חמישה מילימטרים לחלק הצר של הראשון.

סמן את המיקום שבו יצורף המאגר הראשון המכיל עצה. לאחר מכן השתמש בקליפר כדי למדוד את אורך האלקטרודה של גשר המלח מיקרו אגר. השתמש בלהב כדי לחתוך את הקצה לאורך המתאים.

נקה את המשטח החתך עם אתנול ואחריו מים. לאחר מכן, לקבל אורך של כשמונה סנטימטרים של חוט כסף עבור האלקטרודה. נקה את החוט על מגבונים עם אתנול ואחריו מים.

לאחר הניקוי, יש להשתמש בנייר חול כדי להחליק את המשטח באורך של סנטימטר אחד בקצה אחד. חוט זה עם הקצה החלק שלו מוכן להיות מצופה אלקטרו-כימית. שים את הקצה החלק לתוך פתרון אשלגן כלורי עם הקצה השני מחובר לאספקת חשמל DC לציפוי.

כאשר מצופה, לנתק את האלקטרודה ולנקות אותו עם מים. לאחר ייבושו, לקבוע את האורך המאפשר לו לחדור את קצה נימי מיקרו עמוק ככל האפשר. חותכים את האלקטרודה מהצד הלא צותה לאורך המתאים.

עכשיו, להמשיך הלאה כדי להכין תותח מלח עם אגרוז. בבקבוק המכיל מים להמיס אשלגן כלורי ולהשתמש מערבל מגנטי כדי לסייע ערבוב. לאחר הסרת המערבב מוסיפים אגרוז לבקבוקון.

קח את הבקבוק למיקרוגל וחום אותו כדי להמיס את אגוארו על 100 מעלות צלזיוס. מוציאים את זה כדי לבדוק ויזואלית שהאגרוז מומס לחלוטין. ברגע שהתעוררות מומסת פיפטה 10 microliters לתוך המיקרו נימי לאט כדי למנוע בועות אוויר.

חשוב לצנרת בזהירות את תותח מלח אגר לתוך קצה נימי מיקרו, במיוחד בריכוזי אגר גבוהים. אם לא נעשה כראוי בועות אוויר מיוצרים בקלות בקצה לחסום זרימה חשמלית. לאחר הסרת הקצה מן פיפטה לדחוף את האלקטרודה לתוכו.

ודא שהאלקטרודה חודרת לתסתר המלח. כאשר האלקטרודה היא בטמפרטורת החדר לחבר אותו באלקטרודה התייחסות לתוך מגבר. תמיכה באלקטרודה הפניה כך שניתן יהיה להוריד אותו לתוך מיכל פלסטיק עם מיליליטר אחד של חיץ.

לאחר מכן, טובלים את האלקטרודה של גשר המלח לתוך הפתרון. יש למרוח מתח ולבדוק שיש תגובה עדכנית לפני שתמשיך. אם הבדיקה מוצלחת, נתק את האלקטרודות.

במידת הצורך, לאחסן את האלקטרודה גשר מלח על ידי טבילת אותו בתספורת אשלגן כלורי טוחן שלוש. לאחר מכן, הכינו את המאגר המכיל קצה פלסטיק. קח קצה נימי מיקרו ולזהות נקודה שני סנטימטרים מהחלק הצר.

השתמש בחוט חימום כדי לכופף את הצינור 90 מעלות במצב זה. עם סכין חדה לחתוך את הצינור חמישה מילימטרים מהכופף. נקה את האזור שנחתך עם אתנול ואחריו מים.

לפני שתמשיך, השתמש במיקרוסקופ אור עם סולם כדי למדוד את קוטר החור בקצה. לאחר מכן, להזיז את פיפטה להיות ליד מיכל של ממס ועוד של חיץ. פיפטה שלושה מיקרוליטרים של הממס לתוך ומתוך הקצה.

לאחר מכן, מלא את קצה המדידה בשלושה מיקרוליטרים של חיץ. עכשיו, לאחזר את גשר המלח מתספורת אשלגן כלורי. חבר את קצה המדידה עם המאגר לאלקטרודה של גשר המלח.

חבר את האלקטרודה של גשר המלח ואת אלקטרודת הייחוס למגבר. בשלב זה, להשעות את האלקטרודה גשר מלח בתתברית החיץ עם אלקטרודה התייחסות. ייצוג התצורה עבור הניסוי נמצא בשרטוט זה.

במהלך הניסוי, הממברנה ת להיווצר בסוף המאגר המכיל פיפטה. לאסוף נתונים כדי למצוא את קיבולת הממברנה. עשה זאת על-ידי החלת אות מתח משולש לסירוגין כדי ליצור תגובת זרם מלבנית לסירוגין.

לאחר מכן, מצא את היוליכות והמתח בזרם אפס. הפוך את היישום של רמפת מתח לאוטומציה הנעה בין מינוס 50 ל-50 מילי-וולט והקליט את הזרם. התאם פונקציה ליניארית לנתונים.

השיפוע הוא ההי מוליכות, יירוט ה-x הוא המתח בזרם אפס. כאשר נעשה להסיר את קצה המדידה מגשר המלח. מלאו קצה מדידה חדש במאגר, התאימו אותו לערך pH שונה כדי להגדיר מעבר צבע של פרוטון לאורך הממברנה.

להקים מחדש את הגדרה ניסיוני עם קצה מדידה חדש אלקטרודות על מנת לחזור על המידות. להלן הקלטות מתח זרם מייצגות בנוכחות שיפוע pH. ובהיעדר שיפוע pH.

הקווים מייצגים התאמה ליניארית לנתונים. ההסטה בנקודת ההצטלבות של ציר ה- x עבור ערכי ה- pH השונים נחזית על-ידי משוואת Nernst. נתונים אלה מייצגים את השינוי בפוטנציאל הממברנה בזמן לאלקטרודה כלוריד כסף סטנדרטית בלבן, ואת אלקטרודה גשר מלח מיקרו אגר בשחור.

האלקטרודה של גשר המלח אגר הייתה יציבה יותר עם תזוזה מקסימלית של פחות מחמישה מילי-וולטים במשך 300 שניות של מדידה. בעלילה זו של השינוי הפוטנציאלי כפונקציה של שיפוע pH שני האלקטרודות נתפסים להתנהג באופן שונה באופן משמעותי כמו שיפוע pH עולה. ניתן למצוא את שיעור תחלופת הפרוטון ולהושוות אותו לשני סוגי האלקטרודות.

להלן מספרי מחזור פרוטון שנקבעו עבור חלבון מיטוכונדריאלי בלתי מפריד UCP1 אחד נמדד על ידי האלקטרודה גשר מלח לעומת אלקטרודה סטנדרטית. יש גם נתונים עבור UCP3 שהוכן באופן דומה. התעריפים נראים מדויקים יותר עם האלקטרודה גשר מלח אגר.

בעת ניסיון הליך זה חשוב לזכור כי האלקטרודה חודרת את תותח מלח אגר. גשר המלח חייב גם לטבול לתוך פתרון החיץ. לבסוף, ודא כי תסנון מלח אגר אינו מכיל בועות אוויר.