微胶质细胞抗体介导的陶氏清除研究

治疗性抗陶抗体减少阿尔茨海默病病理学的拟议机制之一是通过微胶来清除病理聚合的前Tau。在这里，我们提出细胞基质测定，以评估Tau通过微胶质的吸收。这种检测是一种有用的研究工具，可以更好地描述抗陶抗体的作用机制。

在实验的第一天，准备BV-2细胞，首先用1xPBS在烧瓶中清洗它们。然后在37摄氏度和5%C02下用05%的三辛EDTA孵育它们，直到它们从烧瓶中分离出来。通过上下移液三到五次，重新悬浮培养培养的细胞。

在培养培养中，每毫升含有200微克的肝素，最终浓度为每毫升10万个细胞，并准备细胞悬浮液。在96井组织培养平底板中，每井加入250微升的细胞悬浮液。在37摄氏度下用5%C02孵育板，过夜。

解冻之前在冰上准备的pH染料-Tau集料后，每份无血清介质的65微升稀释，使500纳米摩尔溶液得到稀释。在65微升的血清自由介质中稀释抗体，实现所需浓度的两倍。将 pH 染料-Tau 聚合和抗体混合到 96 井 U 底板中。

密封这个稀释板，并在37摄氏度过夜孵育。第二天，用BV-2细胞从96井板中去除介质。用100微升室温1倍PBS清洗每个井中的细胞。

从 BV-2 细胞板上取出 PBS。使用多通道移液器将125微升氨基酸从稀释板转移到96井BV-2细胞板的每个井中，并在37摄氏度下孵育2小时，CO2含量为5%。孵育后，从细胞中去除氨基酸复合物，用100微升室温1xPBS清洗每个井中的细胞。

去除1x PBS后，加入50微升25%的二丁山水合二苯醚，在37摄氏度下孵育20分钟，二氧化碳为5%。之后，加入200微升的培养介质，通过上下移液来分离细胞，重新悬浮井。将电池转移到96井U底板，并在4摄氏度下以400xg离心5分钟。

将板放在冰上，然后拆下介质。加入150微升冰1x PBS，在4摄氏度下以400克再次离心5分钟。将板放在冰上，然后再次清洗，去除以前添加的1x PBS，每井添加150微升冰冷PBS。

在相同条件下再次离心。将板放在冰上，通过去除先前添加的PBS和每井添加150微升的ACCS缓冲液来清洗细胞。在4摄氏度下再次在400 g下离心5分钟。

将板放在冰上，取出先前添加的 FACS 缓冲液，并在每井 200 微升 FACS 缓冲液中重新悬浮电池。立即由 FACS 进行分析，获取实时单元门中的 20，000 个事件。对于 FACS 分析，使用前射散区或 FSCA 与侧散射区或 SSCA 密度图通过排除具有较低前散射水平的事件（如碎片和死细胞）来对活细胞进行门控。

然后在活动细胞群体中使用 FSCA 与向前散点高度或 FSCH 创建单点门并排除细胞双精度和聚合。然后使用单数门中的事件生成 pH 染料单参数直方图。使用生成的直方图首先确定平均荧光强度。

之后，通过排除使用BV-2的唯一对照确定负细胞，确定pH染料-Tau阳性细胞的百分比。CBTau-28.1抗体促进BV-2细胞中Tau的吸收，其剂量依赖方式如流细胞学所示。高亲和力双突变CBTau-28.1抗体在BV-2细胞中占比高于野生型抗体。

CBTau-28.1 Fab 片段没有增加基底 Tau 吸收，表明 FC 受体中调节内化机制。共体显微镜确认抗体中化增加Tau吸收。标有Tau集料的绿色pH染料通常与Lysotracker红色染料染色酸性细胞器共同本地化，从而表明Tau集料在内分体隔间中存在。

Cbtau-28.1 Fab 片段没有再次增加 Tau 吸收， 表明吸收确实是 Fc 调解的。我们刚才描述的测定方法使我们能够通过微胶质来具体一致地量化由Tau吸收的抗体。通过这种测定产生的数据有助于阐明抗陶抗体的作用机制，从而成为推进抗陶抗体进一步发展的潜在AD治疗的有用工具。