Name: Monitoraggio di sopravvivenza di un neurone tramite microscopia a fluorescenza longitudinale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: Impara a monitorare la sopravvivenza neuronale a livello di singola cellula mediante microscopia a fluorescenza longitudinale su neuroni corticali. Questo metodo consente di identificare predittori di morte cellulare nelle malattie neurodegenerative.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ringraziamo Steve Finkbeiner e membri del laboratorio Finkbeiner per pionieristico microscopia robotica. Ringraziamo anche Dan Peisach per costruzione il software iniziale necessaria per elaborazione di immagini e analisi di sopravvivenza automatizzata. Questo lavoro è stato finanziato dall'Istituto nazionale per i disordini neurologici e colpo (NINDS) R01-NS097542, University of Michigan Protein Folding malattia iniziativa e Ann Arbor attivo contro ALS.

Tutto il lavoro degli animali vertebrato è stato approvato dal Comitato per l'uso e la cura degli animali presso l'Università del Michigan (protocollo n # PRO00007096). Gli esperimenti vengono pianificati attentamente per ridurre al minimo il numero di animali sacrificati. Incinta femmina wild-type (WT), non transgenica ratti lungo Evans (Rattus norvegicus) sono alloggiati singolarmente in camere dotate di arricchimento ambientale e curato dall'unità per laboratorio animale medicina (ULAM) presso l'Università del Michigan, in conformità con la Guida di NIH-supportato per la cura e l'uso di animali da laboratorio. Tutti i ratti sono stati tenuti in custodia per il minor tempo possibile prima dell'eutanasia, coerenza con le raccomandazioni delle linee guida sull'eutanasia dell'associazione medica veterinaria americana e l'Università del Michigan metodi di eutanasia di routine Linee guida di specie.
1. materiale preparazione
<ol><li>Sezionare i neuroni corticali da giorno embrionale 19 – 20 cuccioli del ratto e cultura ratto neuroni corticali a 0,5 x 106 cellule per millilitro sulle piastre rivestite con poli-D-lisina per 4 giorni in vitro, come descritto in precedenza13,14, 15,16,17,18,19.</li>
	<li>Preparare il plasmide DNA di interesse seguendo la procedura descritta da un isolamento di DNA plasmidico privo di endotossina kit (Vedi Tabella materiali). Quantificare il DNA risultante utilizzando uno spettrofotometro.</li>
	<li>Il giorno in vitro filtro aliquota, 4 (DIV4), sterilizzare e incubare i seguenti supporti a 37 ° c: 6 mL ridotto media del siero (RSM; ad es.., OptiMEM), 25 mL di un neurone media basale (NBM), 40 mL NBKY (NBM + acido chinurenico 1 mM + 10 mM MgCl2, regolato ad un pH di 7. 4), 10ml NBC (NBM + 1 x un neurone delle cellule supplemento cultura + 1 x supplemento di L-Glutammina + 1 x penna Strep). Nota: Volumi elencati sono sufficienti per trasfettando una piastra a 96 pozzetti. Fare riferimento alla Tabella materiali per reagenti specifici.</li>
</ol>2. transfezione dei neuroni corticali del ratto
<ol><li>Modificare il fornito esempio foglio di transfezione (vedere Supplemental File 1) regolando il tipo di piastra, mappa di piastra, numero di DNAs, concentrazione del DNA e il numero di pozzetti (scatole verdi). Nota: Il DNA totale somme a 0,2 µ g per bene, indipendentemente dal fatto se uno (es.., A DNA) o più (ad es., DNA B e C) costrutti di DNA vengono aggiunti a ciascun pozzetto.</li>
	<li>Lavorando dal foglio di calcolo, combinare la quantità appropriata di RSM e DNA in una provetta. Combinare la quantità appropriata di RSM e transfezione reagente (ad es., Lipofectamine) in un tubo separato.</li>
	<li>Incubare a temperatura ambiente (TA) per 5 min.</li>
	<li>Unire i composti RSM reagente DNA e transfezione e incubare a temperatura ambiente per 20 min.</li>
	<li>Durante questa fase di incubazione, utilizzare una pipetta multicanale e depressioni di plastica sterile per lavare le cellule 2x con 100 µ l di NBM. Riserviamo il media condizionati (CM) e conservare a 37 ° C. Per questo e come segue, fare attenzione a ridurre al minimo la quantità di tempo che i neuroni sono esposti all'aria.</li>
	<li>Rimuovere il supporto NBM e sostituire con 100 µ l di NBKY.</li>
	<li>Sono trascorsi 20 minuti, aggiungere 50 µ l della miscela reagente/DNA transfezione goccia a goccia in ciascun pozzetto.</li>
	<li>Incubare le cellule con i complessi di DNA/reagente di transfezione per 20 min a 37 ° C.</li>
	<li>Sciacquare 2x con NBKY e sostituire con 100 µ l di CM e 100 µ l di NBC per pozzetto.</li>
	<li>Cellule trasfettate con successo devono essere visibile da microscopia di fluorescenza all'interno 16 – 24 h di transfezione. Per valutare l'efficienza, è necessario utilizzare un microscopio a fluorescenza per controllare la transfezione dopo una notte di incubazione a 37 ° C. Nota: Questa tecnica si traduce in un'efficienza di trasfezione complessiva del 5-10%.</li>
</ol>3. imaging
<ol><li>Collocare la piastra su un microscopio a fluorescenza con un tavolino motorizzato e stabilire un fiduciario (per esempio, un interrogativo sul fondo del piatto) che permetterà all'utente di allineare la piastra ogni volta che si è ripreso. Salvare un'immagine di questo fiduciari per riferimento.</li>
	<li>Passare a un campo di interesse e le coordinate x-y relative l'intestazione fiduciaria di notare.</li>
	<li>Concentrarsi su cellule transfettate che esprimono un'etichetta fluorescente.</li>
	<li>Prendere immagini fluorescenti nel canale appropriato o canali (ad es., proteina fluorescente rossa proteina fluorescente [RFP], verde [GFP], 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole [DAPI]), sia manualmente che in modo automatico. Prendendo diverse immagini a intervalli regolarmente distanziati, un montaggio del pozzo possa essere assemblato durante elaborazione dell'immagine (Vedi punto 4). Nota: La spaziatura dipende da parecchi fattori, compreso l'ingrandimento, l'ottica del microscopio e le dimensioni del rivelatore. In generale, la spaziatura ottica tra le immagini adiacenti sarà tra 90 – 95% delle dimensioni di ogni immagine, per consentire un certo grado di sovrapposizione di immagine e sono dotate di allineamento.</li>
	<li>Ripetere questo processo come spesso come richiesto, allineamento per la fiduciaria originale ogni volta. Per l'analisi di sopravvivenza, imaging avviene ogni 6 – 24 h, a seconda del tipo di cella e lo scopo dell'esperimento.</li>
</ol>4. image Processing
Nota: A seguito di acquisizione di immagini, una serie di passaggi di elaborazione sono richiesti prima dell'analisi di immagine. Questi includono, ma non sono limitati a, impunture, accatastamento e sottrazione di sfondo (Figura 1). L'obiettivo della procedura è quello di produrre una serie di immagini, o serie temporali, in cui le cellule sono chiaramente distinguibili dal loro background e facile da seguire nel corso di più punti di tempo. Una macro dedicato di FIJI (Image_Processing.ijm, vedere Supplemental File 2), esegue la cucitura base, accatastamento e sottrazione di base. Nella sezione discussione è fornire una spiegazione di ogni passaggio e i parametri da prendere in considerazione durante l'elaborazione di immagine.
<ol><li>Regolare i dati grezzi o directory di input per applicare la formattazione illustrato nella Figura 2.</li>
	<li>Se punti temporali non sono contigui (cioè, T1, T2, T3), rinominare queste cartelle in modo che essi sono. Questo passaggio è fondamentale per garantire che la macro Image_Processing non bloccarsi durante l'impilamento.</li>
	<li>Fare doppio clic sull'icona del Fiji per aprire il programma, quindi fare clic e trascinare la barra di Fiji la macro Image_Processing . Verrà aperta la macro all'interno di Fiji.</li>
	<li>Regolare le righe 2-7 della macro Image_Processing per specificare la directory di input contenente immagini, la directory di output desiderato per immagini cucite e impilate, il numero di punti temporali imaging, numero di canali fluorescente e formato del piatto.</li>
	<li>Determinare l'ordine in cui sono state acquisite le immagini. Per eseguire questo test, cucire manualmente un montaggio di immagini in FIJI manovrando per plugin drop down menu | Impunture | Collezione/grid impunture. Regolare le impostazioni all'interno dei menu a discesa tipo e ordine fino a quando non viene prodotta un'immagine con precisione cucita.</li>
	<li>Modificare le variabili GRID_TYPE e STITCH_ORDER in linee 8 e 9 della macro Image_Processing per abbinare queste selezioni.</li>
	<li>Specificare il numero di immagini per pozzetto regolando riga 10 della macro Image_Processing . Nota: Per un montaggio di 2 x 2 di immagini, questa linea avrebbe letto DIM = 2.</li>
	<li>Se è necessaria la sottrazione di sfondo, regolare linea 14 nella macro Image_Processing BGSUB = true.</li>
	<li>Impostare il raggio di rotolamento sfere regolando linea 15 nella macro Image_Processing . Nota: Per risultati ottimali, impostate il raggio su almeno il diametro dell'oggetto in primo piano più grande nell'immagine.</li>
	<li>Fare clic su Esegui per avviare la macro Image_Processing . Una volta avviato, Image_Processing avanzerà automaticamente attraverso cuciture, accatastamento e sottrazione di sfondo.</li>
</ol>5. segnando la morte delle cellule
Nota: Vedere la sezione di discussione per ulteriori informazioni su dati censura e segnando la morte delle cellule.
<ol><li>Individuare la serie di immagini prodotte dallo script Image_Processing . Aprire questi in FIJI.</li>
	<li>Utilizzare il punto strumento all'interno di FIJI per etichettare singolarmente ogni cella con un numero. Premendo t dopo ogni punto aggiungerà l'identificatore di cella con il Manager di ROI (regione d'interesse). Nota: Gli identificatori possono essere visualizzati cliccando le caselle di controllo etichette e visualizzare tutto in gestione il ROI.</li>
	<li>
Progresso attraverso i punti temporali in ogni serie di immagini e registrare il timepoint quando ogni cellula muore o ha bisogno di essere censurato nel file Survival_spreadsheet.csv (Vedi File supplementare 3).
	<ol>
<li>Ogni cella che occupa una singola riga nel foglio di calcolo, dove un identificatore univoco (ID) per ogni cella è costituito da suo corrispondente bene e ROI numero all'interno di quel pozzo. tp_death è l'ultimo punto di tempo che una cella è osservata per essere viva, mentre time_death rappresenta il tempo effettivo di morte in ore. Per ogni cella, questi dati di input. È fondamentale per mantenere questa struttura per l'analisi successiva usando sopravvivenza. R (vedere Supplemental File 4). Nota: I criteri per determinare la morte delle cellule sono cruciali e possono variare a seconda del tipo di cella. Tre criteri principali sono utilizzati nell'identificazione dei neuroni morti11,20 (Figura 3): perdita di intensità di fluorescenza (ad es., il neurone 1 a 69 h), arrotondamento del corpo cellulare (ad esempio, il neurone 2 a 188 h) e la perdita di neuriti l'integrità o blebbing (ad esempio, il neurone 2 a 188 h).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Registrare lo stato di censore della cella nell'ultima colonna. Nota: Qui, a causa di quella peculiare censura viene gestita da R, censurate celle sono contrassegnate da 0, mentre le cellule senza censure sono contrassegnate da 1. Si noti che tutte le cellule che vivono all'ultimo punto nel tempo sono censurate e pertanto contrassegnate come 0.</li>
</ol>6. esecuzione proporzionale di Cox di rischi d'analisi e visualizzazione risultati
<ol><li>Se necessario, scaricare R studio presso https://cran.r-project.org/mirrors.html.</li>
	<li>Aprire R studio e fare doppio clic sull'icona per la sopravvivenza di . R script.</li>
	<li>Posizionare il cursore sulla linea 2 di sopravvivenza . R e fare clic sul pulsante Esegui nella finestra principale di R studio al fine di caricare la libreria di sopravvivenza.</li>
	<li>Modificare la riga 5 della sopravvivenza . R script per corrispondere la posizione del file Survival_spreadsheet.csv. Fare clic su Esegui per caricare i dati di sopravvivenza come un dataframe.</li>
	<li>Evidenziare le linee 8 e 9 e fare clic sul pulsante Esegui nella finestra di console di R studio al fine di eseguire analisi di rischi proporzionali di Cox. Risultati e statistiche di uscita vengono visualizzati nella finestra della console di studio R.</li>
	<li>Evidenziare linee 12-16 di sopravvivenza . R e premere il pulsante di esecuzione al fine di produrre un rischio cumulativo di morte plot, che apparirà nella scheda trame in studio di R. Questo file può essere salvato facendo clic sul pulsante Esporta sopra la trama.</li>
	<li>Se è auspicabile per tracciare i dati di sopravvivenza come una curva di Kaplan-Meier, evidenziare le righe 19-24 di sopravvivenza . R e premere il pulsante Esegui .</li>
</ol>

<ol><li>Lockshin, R. A., Zakeri, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cell death in health and disease.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 11, 1214-1224 (2007).</li>
<li>Kepp, O., Galluzzi, L., Lipinski, M., Yuan, J., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+assays+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Cell death assays for drug discovery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10, 221-237 (2011).</li>
<li>Lemasters, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+permeability+transition+in+cell+death%3A+a+common+mechanism+in+necrosis%2C+apoptosis+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial permeability transition in cell death: a common mechanism in necrosis, apoptosis and autophagy.</a> Biochimica et Biophysica Acta Bioenergetics. , 177-196 (1998).</li>
<li>Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+for+apoptosis.+Flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+early+apoptotic+cells+using+fluorescein+labelled+Annexin+V%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V.</a> Journal of Immunological Methods. 184, 39-51 (1995).</li>
<li>Chien, K. R., Abrams, J., Serroni, A., Martin, J. T., Farber, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+phospholipid+degradation+and+associated+membrane+dysfunction+in+irreversible%2C+ischemic+liver+cell+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Accelerated phospholipid degradation and associated membrane dysfunction in irreversible, ischemic liver cell injury.</a> Journal of Biological Chemistry. 253, 4809-4817 (1978).</li>
<li>Zwaal, R. F. A., Comfurius, P., Bevers, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+exposure+of+phosphatidylserine+in+pathological+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Surface exposure of phosphatidylserine in pathological cells.</a> Cell and Molecular Life Sciences. 62, 971-988 (2005).</li>
<li>Mitchell, D. B., Santone, K. S., Acosta, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+cytotoxicity+in+cultured+cells+by+enzyme+leakage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Culture+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of cytotoxicity in cultured cells by enzyme leakage.</a> Journal of Tissue Culture Methods. 6, 113-116 (1980).</li>
<li>Moran, J. H., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+beta-NADH-linked+fluorescence+assay+for+lactate+dehydrogenase+in+cellular+death%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">A rapid beta-NADH-linked fluorescence assay for lactate dehydrogenase in cellular death.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 36, 41-44 (1996).</li>
<li>Mossman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+colorimetric+assay+for+cellular+growth+and+survival%3A+Application+to+proliferation+and+cytotoxicity+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays.</a> Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).</li>
<li>Guerzoni, L. P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Modulation+of+TrkB+Receptor+Signaling+upon+Sequential+Delivery+of+Curcumin-DHA+Loaded+Carriers+Towards+Promoting+Neuronal+Survival%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">In Vitro Modulation of TrkB Receptor Signaling upon Sequential Delivery of Curcumin-DHA Loaded Carriers Towards Promoting Neuronal Survival.</a> Pharmaceutical Research. 34 (2), 492-505 (2017).</li>
<li>Arrasate, M., Finkbeiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+microscope+system+for+determining+factors+that+predict+neuronal+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Automated microscope system for determining factors that predict neuronal fate.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102, 3840-3845 (2005).</li>
<li>Christensen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivariate+survival+analysis+using+Cox%E2%80%99s+regression+model%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Multivariate survival analysis using Cox’s regression model.</a> Hepatology. 7, 1346-1358 (1987).</li>
<li>Barmada, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+induction+enhances+TDP43+turnover+and+survival+in+neuronal+ALS+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models.</a> Nature Chemical Biology. 10, 677-685 (2014).</li>
<li>Barmada, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amelioration+of+toxicity+in+neuronal+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+by+hUPF1%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112, 7821-7826 (2015).</li>
<li>Malik, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrin+3-dependent+neurotoxicity+is+modified+by+nucleic+acid+binding+and+nucleocytoplasmic+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Matrin 3-dependent neurotoxicity is modified by nucleic acid binding and nucleocytoplasmic localization.</a> Elife. 7, (2018).</li>
<li>Archbold, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP43+nuclear+export+and+neurodegeneration+in+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+frontotemporal+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">TDP43 nuclear export and neurodegeneration in models of amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia.</a> Scientific Reports. 8, 4606(2018).</li>
<li>Green, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAN+translation+at+C9orf72-associated+repeat+expansions+is+selectively+enhanced+by+the+integrated+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">RAN translation at C9orf72-associated repeat expansions is selectively enhanced by the integrated stress response.</a> Nature Communications. 8, 2005(2017).</li>
<li>Park, S. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+the+essential+Sis1+chaperone+reduces+TDP-43+effects+on+toxicity+and+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Overexpression of the essential Sis1 chaperone reduces TDP-43 effects on toxicity and proteolysis.</a> PLOS Genetics. 13, e1006805(2017).</li>
<li>Gupta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Proline%2FArginine+Dipeptide+from+Hexanucleotide+Repeat+Expanded+C9ORF72+Inhibits+the+Proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">The Proline/Arginine Dipeptide from Hexanucleotide Repeat Expanded C9ORF72 Inhibits the Proteasome.</a> eNeuro. 4, (2017).</li>
<li>Angelov, B., Angelova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+clustering+of+the+neurotrophin+receptor+TrkB+revealed+by+super-resolution+STED+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Nanoscale clustering of the neurotrophin receptor TrkB revealed by super-resolution STED microscopy.</a> Nanoscale. 9 (28), 9797-9804 (2017).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Qui, è presentata una metodologia per monitorare direttamente la sopravvivenza di un neurone su base cella singola. Contrariamente ai tradizionali saggi per la morte delle cellule che sono limitati a intervalli di tempo discreti e intere popolazioni delle cellule, questo metodo consente la valutazione continua di una varietà di fattori quali la morfologia cellulare, l'espressione della proteina o localizzazione, e possibile determinare come ciascun fattore influenza la sopravvivenza cellulare in modo prospettico.
<p ...

Morte delle cellule anormali è un fattore trainante in molte malattie, compreso cancro, neurodegenerazione e corsa1. Saggi di robuste e sensibile per la morte delle cellule sono essenziali per la caratterizzazione di questi disordini, come pure lo sviluppo di strategie terapeutiche per estendere o ridurre la sopravvivenza cellulare. Attualmente esistono decine di tecniche per la misurazione di morte delle cellule, direttamente o tramite surrogati marcatori2. Ad esempio, morte delle cellule può essere valutata visivamente con l'ausilio di coloranti vitali che macchia selettivamente cellule morte o vita3, o controllando l'aspetto dei fosfolipidi specifici sulla membrana plasmatica4,5,6 . Misure di componenti intracellulari o di metaboliti cellulari rilasciati in media dopo la dissoluzione cellulare utilizzabile anche come proxy per cellule morte7,8. In alternativa, la vitalità cellulare può essere approssimata valutando attività metabolica9,10. Anche se questi metodi forniscono mezzi rapidi di valutare la sopravvivenza delle cellule, non sono senza avvertimenti. Ogni tecnica osserva la cultura come un'unica popolazione, rendendo impossibile distinguere tra le singole celle e loro unici tassi di sopravvivenza. Inoltre, tali dosaggi basati sulla popolazione sono in grado di misurare i fattori che possono essere importanti per la morte delle cellule, compreso la morfologia cellulare, l'espressione della proteina o localizzazione. In molti casi, queste analisi sono limitate ai punti di tempo discreto e non consentono l'osservazione continua delle cellule nel corso del tempo.
Al contrario, microscopia a fluorescenza longitudinale è una metodologia altamente flessibile che direttamente e continuamente controlla il rischio di morte su una singola cellula base11. In breve, microscopia a fluorescenza longitudinale consente a migliaia di singole celle per essere monitorati ad intervalli regolari per lunghi periodi di tempo, consentendo precise determinazioni di morte delle cellule e dei fattori che migliorano o sopprimono la morte delle cellule. Alla sua base, il metodo prevede la trasfezione transiente o trasduzione delle cellule con vettori codificanti proteine fluorescenti. Un unico fiduciario viene quindi stabilito, e la posizione di ogni cellule transfettate in relazione a questa pietra miliare consente all'utente di immagine e tenere traccia di singole cellule nel corso di ore, giorni o settimane. Quando queste immagini vengono visualizzate in sequenza, la morte delle cellule è contrassegnata da cambiamenti caratteristici in fluorescenza, la morfologia e la frammentazione del corpo cellulare, consentendo l'assegnazione di un tempo di morte per ogni cella. Il tasso di morte, determinata dalla funzione di rischio, calcolato può quindi essere quantitativamente rispetto tra le condizioni, o correlato per selezionare caratteristiche cellulari utilizzando monovariante o analisi multivariata rischi proporzionali di Cox12. Insieme, questi approcci consentono la discriminazione accurata e obiettiva dei tassi di morte delle cellule fra popolazioni cellulari e l'identificazione delle variabili che significativamente predicono la morte delle cellule e/o sopravvivenza (Figura 1).
Anche se questo metodo può essere utilizzato per monitorare la sopravvivenza in qualsiasi tipo di cellule post-mitotiche in una varietà di formati di placcatura, questo protocollo descriverà le condizioni per trasfezione e imaging neuroni corticali del ratto coltivati in una piastra a 96 pozzetti.

<table><tbody><tr><td>Medium neurobasale</td><td>GIBCO</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>GIBCO</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>CompactPrep Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12863</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio esaidrato</td><td>Sigma</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>Acido chinurenico idrato</td><td>TCI</td><td>H0303</td><td></td></tr><tr><td>Poly D-Lysine</td><td>Millipore</td><td>A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>GIBCO</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>52887</td><td></td></tr><tr><td>B27 integratore</td><td>Thermo Fisher</td><td>A3582801</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>GIBCO</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>piastre a 96 pozzetti</td><td>TPP</td><td>0876</td><td></td></tr></tbody></table>

monitoraggio di sopravvivenza di un neurone tramite microscopia a fluorescenza longitudinale

Monitoring Neuronal Survival via Longitudinal Fluorescence Microscopy

Saggi di citotossicità standard, che richiedono la raccolta di lisati o celle fisse a più punti di tempo, hanno limitato la sensibilità e la capacità di valutare i fattori che influenzano il destino di un neurone. Queste analisi richiedono l'osservazione di popolazioni separate delle cellule a intervalli di tempo discreti. Di conseguenza, le singole celle non possono essere seguite prospetticamente nel tempo, limitando gravemente la capacità di discriminare se subcellulari eventi, ad esempio puncta formazione o mislocalization di proteine, sono driver patogeni della malattia, le risposte omeostatiche, o fenomeni puramente coincidenti. Cella singola longitudinale microscopia supera queste limitazioni, che permette al ricercatore di determinare le differenze nella sopravvivenza tra popolazioni e disegnare relazioni causali con maggiore sensibilità. Questa video guida illustrerà un flusso di lavoro rappresentativo per gli esperimenti di sopravvivenza unicellulari di primaria neuroni corticali del ratto, che esprime un proteina fluorescente indicatore di misura. Lo spettatore sarà imparare a raggiungere ad alta efficienza transfezioni, raccogliere ed elaborare immagini consentendo il monitoraggio prospettico delle singole celle e confrontare la relativa sopravvivenza di popolazioni neuronali utilizzando analisi rischi proporzionali di Cox.

Utilizzando la procedura di trasfezione descritta qui, neuroni corticali del ratto di DIV4 transfected con un plasmide che codifica la proteina fluorescente mApple. A partire dal post-transfezione 24h, cellule erano imaged da microscopia di fluorescenza ogni 24 h per 10 giorni consecutivi. Le immagini risultanti sono state organizzate come indicato in Figura 2, poi cucite, impilate e ha segnate per la morte delle cellule (Figura 1</strong...

Qui, presentiamo un protocollo per monitorare la sopravvivenza su una base di singola cellula e identificare le variabili che significativamente predicono la morte delle cellule.

Monitoraggio di sopravvivenza di un neurone tramite microscopia a fluorescenza longitudinale

Standard cytotoxicity assays, which require the collection of lysates or fixed cells at multiple time points, have limited sensitivity and capacity to ...

Questo protocollo consente ai ricercatori di monitorare la sopravvivenza su una singola cellula e identificare variabili che predicono significativamente la morte o la sopravvivenza cellulare. I test di citotossicità convenzionali valutano le popolazioni di cellule e mancano della capacità di discriminare le singole cellule. La microscopia longitudinale consente l'assegnazione del tempo di morte per ogni cellula in una popolazione.Questa tecnica è adatta per valutare nuove terapie per malattie neurodegenerative e altre condizioni. Questo metodo si è dimostrato prezioso per esplorare i meccanismi della malattia in condizioni neurodegenerative e potrebbe essere applicato con uguale efficacia verso altri disturbi in cui la morte cellulare è di interesse. I ricercatori possono avere difficoltà a raggiungere adeguate efficienze di trasfezione senza tossicità indebita.La pratica con la pipetta multicanale e la familiarità con il protocollo dovrebbero diminuire queste difficoltà nel tempo. La microscopia è una metodologia intrinsecamente visiva. Pertanto, la tecnica può essere più facilmente compresa guardando oltre alla lettura.Per iniziare, combinare la quantità appropriata di mezzi siere ridotti e reagente di trasfezione in un unico tubo e ridurre i mezzi siere e il DNA in un tubo separato. Incubarli a temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi, combinare il contenuto di entrambi i tubi e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti.Utilizzare una pipetta multicanale e trogoli di plastica steril per lavare i neuroni corticali due volte con 100 microlitri di mezzi basali neurali per pozzo. E conservare i supporti condizionati e altri supporti rimanenti a 37 gradi Celsius. Sostituire l'NBM con 100 microlitri di soluzione NBKY precedentemente preparata per pozzo.Dopo 20 minuti, pipettare 50 microlitri del reagente di trasfezione e miscela di DNA dropwise in ogni pozzo. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 20 minuti. Risciacquare le cellule due volte con la soluzione NBKY.Quindi aggiungere 100 microlitri di supporti condizionati e 100 microlitri di soluzione NBC ai pozzi. Per iniziare a immaginare le cellule, posizionare la piastra del pozzo 96 su un microscopio fluorescente. Utilizzare un segno fiduciario univoco per ogni lastra come riferimento per l'allineamento futuro e salvare un'immagine come riferimento futuro.Quindi, passare alle aree di interesse e registrare le coordinate x e y relative al segno. Utilizzare un segno fiduciario univoco per ogni lastra come riferimento per l'allineamento futuro e salvare un'immagine come riferimento futuro. Infine, concentrati sulle cellule trasfette che esprimono un'etichetta fluorescente.Scatta più immagini a intervalli regolarmente distanziati nei canali fluorescenti appropriati. Per iniziare con l'elaborazione delle immagini, fai doppio clic sull'icona delle Fiji. Quindi, fare clic e trascinare la macro di elaborazione del carattere di sottolineatura dell'immagine sulla barra delle Fiji per aprire la macro all'interno delle Figi.Regolare le righe da due a sette della macro di elaborazione del carattere di sottolineatura dell'immagine in base al protocollo di testo. Quindi, fare clic su cuciture, quindi griglia / cuciture di raccolta. Regolare le impostazioni all'interno dei menu a discesa, digitare e ordinare, fino a produrre un'immagine cucita con precisione.Regolare il tipo di griglia e le variabili dell'ordine di punto nelle righe otto e nove in base a queste selezioni. Quindi, regola la riga 10 per specificare il numero di immagini per pozzo e imposta l'opzione di sottrazione di sfondo nella riga 14 su true, se necessario. Regolare la riga 15 per impostare il raggio della palla rotolante in base al protocollo di testo e fare clic su Esegui.Infine, aprire gli stack di immagini di output e identificare manualmente i neuroni morti in base al protocollo di testo. Registrare i dati in un file di foglio di calcolo. Per eseguire analisi statistiche, fare doppio clic sull'icona per la sopravvivenza.R script. Evidenziare la linea due e fare clic sul pulsante esegui per caricare la libreria di sopravvivenza. Quindi, modificare il percorso nella riga cinque per chiamare il foglio di calcolo di input e fare clic sul pulsante esegui.Evidenziare le linee otto e nove e fare clic sul pulsante esegui per eseguire l'analisi dei pericoli proporzionali Cox. Evidenziare le linee da 12 a 16 e da 19 a 24. Fare clic sul pulsante esegui per tracciare il rischio cumulativo di morte e i dati di sopravvivenza come curva kaplan-meier.In questo studio, i neuroni corticali del ratto sono stati trasfettato a quattro giorni dopo la placcatura con un plasmide che codifica per la proteina fluorescente M mela. 24 ore dopo la trasfezione, i neuroni sono stati imageati dalla microscopia a fluorescenza ogni 24 ore per 10 giorni consecutivi. A seguito dell'acquisizione dell'immagine, le immagini sono state elaborate e sono state esaminate in sequenza per celebrare la morte cellulare.Il tempo di morte per ogni cellula era determinato da cambiamenti nella fluorescenza, morfologia e frammentazione del corpo cellulare. L'analisi dei pericoli proporzionali cox eseguita sui dati di sopravvivenza dei neuroni mutanti ha portato ad un rapporto di pericolo di 2,2. Questo risultato ha indicato un tasso di morte più veloce nei neuroni mutanti rispetto alla popolazione di tipo selvaggio.La cosa più importante da ricordare quando si tenta questa procedura è quella di pipet con attenzione. Ridurre al minimo l'esposizione all'aria ed evitare le bolle è fondamentale per una trasfezione di successo. Dopo la trasfezione, la microscopia a fluorescenza longitudinale può essere utilizzata per tenere traccia di vari fattori che possono contribuire alla morte cellulare, tra cui localizzazione proteica, turnover e livello di espressione, oltre alla sopravvivenza cellulare.Nel campo della neurodegenerazione, la natura dinamica della microscopia longitudinale ha fatto luce sul fatto che l'aggregazione di proteine associate alla malattia rappresenti un evento tossico o protettivo. Nessuno di questi reagenti o strumenti è pericoloso.

monitoring-neuronal-survival-via-longitudinal-fluorescence-microscopy

Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

Noi descriviamo un protocollo che permette l'imaging di mitocondri in vita i neuroni tramite microscopia a fluorescenza su durate lunghe. Imaging per lunghi periodi si realizza attraverso lentivirus-mediata espressione di una proteina fluorescente mitocondri mirata e l'uso di un poco costoso stadio-top incubatore che è stato progettato e costruito nel nostro laboratorio.

Neuromodulazione e mitocondriale di trasporto: Imaging Live in neuroni dell&#39;ippocampo oltre durate a lungo

Live-cell imaging di caspasi-3 apoptosi mediata in immortalato N19-oligodendrociti colture cellulari usando...

Monitoraggio spaccati Caspase-3 Attività e apoptosi di cellule oligodendrogliali Immortalata dal vivo utilizzando cellule Imaging e Cleaveable fluorogenici-dye seguenti supporti di potassio indotta depolarizzazione della membrana

Questo rapporto descrive l'uso di imaging cellulare dal vivo e le tecniche di fotosbiancante per determinare l'espressione di superficie, vie di trasporto e la cinetica di traffico esogeno espresso, sensibile al pH GFP-tagged proteine ​​a livello della membrana plasmatica dei neuroni.

Diffusione laterale e esocitosi delle proteine ​​di membrana in neuroni in coltura valutata utilizzando Recovery fluorescenza e fluorescenza-loss photobleaching

Fonte: Krishnamurthy, K. et al. Misurazione fluorescente in tempo reale delle funzioni sinaptiche nei modelli di sclerosi laterale amiotrofica. J. Vis. Exp. (2021)Questo video mostra l'imaging del calcio in tempo reale per monitorare l'attività sinaptica nei neuroni mutanti della SLA che esprimono un biosensore di calcio geneticamente codificato. Delinea i passaggi per preparare i neuroni per l'imaging, stimolare la dinamica del calcio e registrare la fluorescenza per misurare i cambiamenti in...

Imaging a fluorescenza della dinamica sinaptica del calcio in un modello in vitro di sclerosi laterale amiotrofica

Il rimodellamento intracellulare del Ca2+ nell'invecchiamento può contribuire all'eccitotossicità e al danno neuronale, processi mediati dal sovraccarico di Ca2+. Abbiamo mirato a studiare il rimodellamento del Ca2+ nel cervello che invecchia utilizzando l'imaging a fluorescenza e bioluminescenza del Ca2+ citosolico e mitocondriale in colture a lungo termine di neuroni ippocampali di ratto, un modello di invecchiamento neuronale.

Fluorescenza e bioluminescenza di subcellulare Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; In Aged neuroni dell&#39;ippocampo

È descritto un protocollo robusto per monitorare le popolazioni neurali di time-lapse video-microscopia seguita da basati su software di post-elaborazione. Questo metodo rappresenta un potente strumento per identificare gli eventi biologici in una popolazione selezionata durante esperimenti dal vivo di formazione immagine.

Seguita dalla singola cellula di rilevamento a Monitor biologia cellulare e la progressione di lignaggio di popolazioni neurali Multiple immagini dal vivo

Presentato qui è un metodo di tubo rullo modificate per la coltura e fette di imaging ad alta risoluzione intermittente del cervello del roditore sopra molte settimane con riposizionamento preciso sulle lamelle di fotoincisioni. Vitalità neuronale e fetta morfologia sono ben tenute. Vengono fornite applicazioni di questo sistema completamente chiusa usando i virus per espressione specifica del tipo di cella.

Metodo del tubo rullo modificate per Imaging intermittente precisamente localizzata e ripetitivi durante la coltura a lungo termine delle fette di cervello in un sistema chiuso

Formazione immagine della vivere-cella fornisce una ricchezza di informazioni su singole cellule o di intere popolazioni che è irraggiungibile da cella fissa imaging da solo. Qui, i protocolli di imaging di cellule vive per valutare le decisioni di destino delle cellule dopo il trattamento con il paclitaxel della droga anti-mitotico sono descritti.

A lungo termine Live cell Imaging per valutare il destino delle cellule in risposta a Paclitaxel

Le cellule staminali neurali/progenitrici mostrano varie dinamiche di espressione dei componenti di segnalazione di Notch che portano a diversi risultati di eventi cellulari. Tale espressione dinamica può essere rivelata dal monitoraggio in tempo reale, non dall'analisi statica, utilizzando un sistema di imaging a bioluminescenza altamente sensibile che consente la visualizzazione di rapidi cambiamenti nelle espressioni geniche.

Risonanza in tempo reale sulla bioluminescenza delle dinamiche di segnalazione di nota durante la neurogenesi di Murine

Sono descritti due metodi correlati per visualizzare gli eventi subcellulari necessari per la trasmissione sinaptica. Questi protocolli consentono il monitoraggio in tempo reale della dinamica dell'afflusso di calcio presinaptico e della fusione della membrana delle vescicole sinaptiche utilizzando l'imaging a cellule vive di neuroni in coltura in vitro .

Misurazione fluorescente in tempo reale delle funzioni sinaptiche in modelli di sclerosi laterale amiotrofica

Impara a monitorare la sopravvivenza neuronale a livello di singola cellula mediante microscopia a fluorescenza longitudinale su neuroni corticali. Questo metodo consente di identificare predittori di morte cellulare nelle malattie neurodegenerative.

Monitoraggio di sopravvivenza di un neurone tramite microscopia a fluorescenza longitudinale

Esplora altri video