Name: 절연, 전파, 그리고 인간의 치과 펄프의 줄기 세포의 신경 분화 동안 프리온 단백질 표정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 50 s
Description: 학습하세요 인간 치과 펄프 줄기세포(DPSCs)의 효율적인 분리 및 배양 방법과 신경 분화 과정에서의 프리온 단백질 발현 평가 기법을. 이 프로토콜은 재생의학 연구와 바이오뱅크 구축에 활용됩니다.

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이 작품은 "피코 Varrone" 및 티 대학 허브 "사비 나 Universitas" 빈첸초 Mattei에 의해 지원 되었다.
그림 5 (A, B) 테일러 & 프랜시스 회사에서 게시자의 허가 reprinted: 역할의 프리온 단백질-EGFR multimolecular 복잡 한 인간의 치과 펄프 파생 된 줄기 세포의 신경 분화 하는 동안. Martellucci, S., Manganelli V. Santacroce C., Santilli F., 자녀 가족 L., Sorice M., Mattei V. 프리온. 3 월 4 2018입니다. 테일러 & 프랜시스

연구에 사용 하는 세 번째 어 금 니 환자 (13-19 세)의 약물 또는 알코올 소비 이전 역사 없이, 모든 비 흡연와 적절 한 구강 위생에서에서 excised 했다. 설명 과학 치과와 로마의 "역사적인" 대학 Maxillofacial 당일 동의 환자 또는 부모에서 얻은 했다. 동의 윤리적 고려 사항 및 윤리 위원회의 승인에 따라 얻은 했다.
1. 치아 및 치과 펄프 추출
<ol><li>
보존 또는 교통에 대 한 적절 한 매체의 준비.
	<ol>
<li>L-글루타민 (494.5 mL)와 포도 당 (DMEM-L)의 Dulbecco의 수정이 글의 중간 낮은 농도 준비 합니다.</li>
		<li>페니실린/스 (1%)의 5 mL을 추가 고 암포 (0.1%)의 0.5 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>환자에서 세 번째 어 금 니를 추출, 신속 하 게 PBS와 린스, 매체와는 15ml 테스트 튜브에 넣고 2 시간 미만에 실험실으로 전송.</li>
	<li>생물 학적 후드 코로나 가공 패스 병렬 및 펄프 챔버의 지붕을 통해 접선 하 여 치아 커터 엽니다.</li>
	<li>부드럽게 작은 굴 삭 기와 펄프를 제거 하 고 테스트 튜브에.</li>
	<li>PBS로 3 회 세척 하 고 실시간에 10 분 동안 2500 x g 에서 원심</li>
</ol>2. 치과 펄프의 줄기 세포 분리 처리
<ol><li>제거는 상쾌한, 행 크의 솔루션에는 펠 릿을 resuspend 및 페 트리 접시에. 5% CO2에서 37 ° C에서 2 시간에 대 한 품 어.</li>
	<li>
4 콜라 솔루션 준비를 입력 합니다.
	<ol>
<li>DMEM L. 0.8 mL를 준비</li>
		<li>유형 IV 콜라 DMEM과 몇 분 동안 소용돌이의 0.8 ml의 1 m g을 녹여.</li>
		<li>DMEM L 추가 최종 농도를 1 mL을 1 mg/mL.</li>
		<li>0.22 μ M 필터 솔루션을 필터링 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>RT에서 10 분 동안 2500 x g 에서 원심 분리 하 여 행 크의 솔루션을 제거 하 고 일회용 메스와 각자 작은 조각 approximatively 1 m m으로 펄프를 분할.</li>
	<li>펄프 조각을 페 트리 접시에 놓고 유형 IV 콜라 5% CO2에서 37 ° C에서 15 분의 1 mL와 함께 품 어.</li>
	<li>
중간 문화 준비 (500 mL)입니다.
	<ol>
<li>DMEM-L과 L-글루타민의 445 ml.</li>
		<li>소 태아 혈 청 (FBS) (10%)의 50 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>페니실린/스 (1%)의 5 mL를 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>RT에서 10 분 동안 2500 x g 에서 샘플 원심, 제거는 상쾌한, 5% CO2에서 37 ° C에서 줄기 세포에 대 한 특정 T25 플라스 크에 문화와 매체 (2.5 단계)에서 펠 릿 resuspend.</li>
</ol>3. 줄기 세포 배양 및 전파
<ol><li>매일 매일 문화를 확인 하 고, 3 일 후의 성장, 플라스 크 내의 부착 세포의 다른 클론을 관찰.</li>
	<li>3 일 마다 문화 매체를 변경합니다.</li>
	<li>7 ~ 12 일, 부착 셀 범위 합류, 일단 분리 그들 트립 신-EDTA 37 ° C에서 3 분의 1 mL로 세포 치료 또는 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 부드럽게 합니다.</li>
	<li>트립 신 작업 중지 문화 매체 (2.5 단계)의 4 ml (비율 1:5)를 추가 합니다.</li>
	<li>259 x g6 분에 대 한 세포 현 탁 액을 원심, 제거는 상쾌한 고 전파 T25 플라스 크에 세포를 배치. 참고: 3 일 마다 셀 합류에 도달합니다.</li>
	<li>비-줄기 세포 문화에와 같은 존재를 피하기 위해 21 ~ 28 일 (약 6-8 구절)까지 셀을 전파 합니다.</li>
	<li>트립 신-EDTA 부드럽게 된다고 37 ° C에서 3 분의 1 mL로 세포를 분리 합니다. 셀 서 스 펜 션 259 x g6 분에 대 한 원심</li>
	<li>제거는 상쾌한 고 cytofluorimetric 분석 (6 단계)에 대 한 셀을 테스트 합니다.</li>
</ol>4. 과도 PrPC Silencing siRNA에 의해
<ol><li>24 시간 배양 (2.5 단계)의 2 개 mL와 hDPSCsin 6 잘 플레이트 (2 x 105 셀/mL) 문화.</li>
	<li>
다음날, siRNA PrP 매체 (400 µ L)를 준비 합니다.
	<ol>
<li>멸 균 시험관에 추가 384 µ L DMEM L.</li>
		<li>DMEM-l 5의 최종 농도를 1 µ L siRNA PrP의 각 유형에 대 한 추가 nM (4 siRNA PrP 사용 하 고 최저 효율 ≥70 %를 보장 하는 공급자에 의해 확인 되었다).</li>
		<li>DMEM L. transfectionreagent의 12 µ L 추가</li>
		<li>소용돌이 혼합물과 transfection 단지의 형성 수 있도록 RT에서 10 분 동안 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>각 샘플에 siRNA PrP 매체의 400 μ를 추가 하 고 37 ° c.에 6 h에 대 한 품 어</li>
	<li>SiRNA PrP 매체를 폐기 하지 않고 문화 매체 (2.5 단계)의 1.6 mL (1 ~ 5의 비율)을 추가 합니다.</li>
	<li>37 ° c.에서 72 h에 대 한 셀을 두고</li>
	<li>상쾌한을 제거 하 고 3 번 실시간에 PBS의 2 mL로 씻어</li>
	<li>7 / 14 일 (단계 5.1)에 대 한 신경 문화 매체의 2 개 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>3 일 마다 신경 문화 매체를 변경 합니다. 참고: SiRNA PrP 솔루션 각 시간 바꾸기 신경 문화 매체를 교체 합니다.</li>
	<li>시간의 끝에, RT에서 PBS의 2 mL로 3 번 세척 하 고 서쪽 오 점 분석에 의해 신경 표면 항 원에 대 한 테스트.</li>
</ol>5. 신경 유도 과정 hDPSCs
<ol><li>
신경 문화 매체 준비 (500 mL)입니다.
	<ol>
<li>신경 세포에 공식화 하는 기저 미디어의 444.7 mL를 준비 합니다.</li>
		<li>매체에 배아와 성인 신경 줄기 세포 (10%)의 장기 생존 능력을 지 원하는 데 사용 되는 혈 청 무료 보충의 50 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>매체 (최종 농도 20 ng/mL)를 200 µ L의 기본적인 섬유 아 세포 성장 인자 (bFGF) (최종 농도가 40 ng/mL) 및 100 µ L 표 피 성장 인자 (EGF)를 추가 합니다.</li>
		<li>페니실린/스 (1%)의 5 mL을 추가 하는 매체.</li>
	</ol>
</li>
	<li>6 잘 플레이트 (2 x 105 셀/mL)에 문화 hDPSCs 펄프 분리에서 28 일까지 고 신경 문화 매체의 2 mL와 함께 그들을 자극 하는 것.</li>
	<li>3 일 마다 삭제는 상쾌한, RT에서 PBS의 2 mL로 3 번 세척 하 고 신경 문화 매체의 2 개 mL를 대체.</li>
	<li>7 / 14 일 후, 트립 신-EDTA 37 ° C에서 3 분의 1 mL 또는 부드럽게를 스 크레이 퍼 셀을 분리 합니다.</li>
	<li>문화 매체 (2.5 단계) trypsin 작업 중지의 4 mL (비율 1:5)를 추가 합니다.</li>
	<li>교류 cytometry 분석에 의해 프리온 단백질 표정 (7 단계) 나 신경 표면 항 원 (6 단계)의 존재에 대 한 테스트.</li>
</ol>6입니다. hDPSCs Flow Cytometry로의 특성
<ol><li>선택 mesenchymal stromal (MSC)-특정 또는 신경 표면 항 원.</li>
	<li>문화 문화 매체 (2.5 단계)의 2 개 mL와 6 잘 플레이트 (2 x 105 셀/mL)에서 hDPSCs.</li>
	<li>28 일 치과 펄프 분리 또는 37 ° C 또는 부드럽게 스 크레이 퍼에 3 분에 대 한 트립 신-EDTA의 1 mL와 신경 문화 매체 (단계 5.1)의 14 일 후에 hDPSCs를 분리 합니다.</li>
	<li>트립 신 행동을 막으려고 문화 매체 (2.5 단계)의 4 ml (비율 1:5)을 추가 하 고 259 x에서 centrifugate g 실시간에서 6 분에 대 한 다른 2 mL의 PBS로 2 회에 세척 실시간</li>
	<li>4 ° c.에서 10 분에 대 한 PBS에 4 %paraformaldehyde 치료 또는 치료 hDPSCs를 수정</li>
	<li>0.1% (v/v) 비 이온 계면 활성 제 PBS에서 실시간에 추가 10 분으로 hDPSCS를 permeabilize</li>
	<li>실시간에서 1 시간에 대 한 PBS의 1 mL에 5% 탈지 말린 우유와 함께 차단 수행</li>
	<li>1 mL의 PBS로 3 회 세척 하 고 안티 CD105 셀을 품 어 (1: 100 / 5 x 105 셀), 안티-CD44 (1: 100 / 5 x 105 셀), 안티-STRO-1 (1: 100 / 5 x 105 셀), 안티-CD90 (1: 100 / 5 x 105 셀), 안티-CD73 (1: 100 / 5 x 105 셀), β3-Tubulin 안티 (1: 100 / 5 x 105 셀), 안티-NFH (1: 100 / 5 x 105 셀)와 안티-GAP43 (1: 100 / 5 x 105 셀) 실시간에서 1 h mAb</li>
	<li>셀 1 mL의 PBS로 3 회 세척 하 고 반대로 마우스 PE (1시 50분/5 105 셀 x) 또는 반대로 토끼 CY5 품 어 (1시 50분/105 셀 x 5) mAb 실시간에 추가 1 시간에 대 한</li>
	<li>게이팅 (반대로 마우스 PE 또는 반대로 토끼 CY5 mAb) immunopositive 세포에 대 한 2 차 항 체를 사용 하 여 교류 cytometer와 모든 샘플을 분석 하 고 적어도 20000 이벤트를 취득.</li>
</ol>7. hDPSCs Flow Cytometry 분석에 PrPC 식의 평가
<ol><li>문화 문화 매체 (2.5 단계)의 2 mL와 함께 hDPSCsin 6 잘 플레이트 (2 x 105 셀/mL).</li>
	<li>21, 28 일 치과 펄프 분리에서 트립 신-EDTA의 1 mL와 신경 문화 매체 (5.1 단계)와 7 / 14 일 후에 hDPSCs를 분리 하 고 단계 6.4에에서 설명 된 대로 trypsin 작업 중지. 표본 4% paraformaldehyde PBS에 4 ° c.에서 10 분으로 수정</li>
	<li>0.1% (v/v) 비 이온 surfactantin PBS 10 분에 대 한 실시간 제거에서와 상쾌한 permeabilize 고 얼룩 토끼 안티-PrP mAb EP1802Y (1시 50분/105 셀 x 5) 셀 mAb 실시간 품 방지 토끼 CY5 (1시 50분/105 셀 x 5)에서 1 시간에 대 한 대 한 mAb 실시간에 추가 1 시간</li>
	<li>교류 cytometer와 모든 샘플을 분석 하 고 적어도 20000 이벤트를 확보.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

이 작품에서는, 우리가 격리와 hDPSCs;의 신경 분화에 대 한 방법론에 초점을 맞춘 또한, 우리는이 과정에서 PrPC 의 역할 평가. 분리 과정에서 신경 세포와 같은 세포에 중요 한 단계는 hDPSCs를 차별화 하는 여러 방법이 있다. hDPSCs는 chondroblasts, adipocytes, osteoblasts, 신경 등 여러 계보에서 차별화 수 있습니다. 우리 신문, 우리 신경 감 별 법의 메커니즘 및 PrPC의 존재를 조사. 위에서 설명 했 듯이, 이러한 세포 STRO 1 CD44, CD90, CD105, CD73, 및10,,2526같은 전형적인 엽 stromal 특정 표면 항을 표현 한다.
프로토콜, 몇 가지 중요 한 단계는 분리 절차의 실패를 일으킬 수 있습...

중간 엽 줄기 세포는 골 수, 탯 줄 혈액, 인간의 치과 펄프, 지방 조직, 그리고 혈액1,2,3,,45 를 포함 하 여 여러 조직에서 고립 되어 있다 , 6. 여러 저자에 의해 보고, hDPSCs 표시 플라스틱 준수, 전형적인 구와 같은 형태학. 이러한 개별 복제와 증식 및 차별화 용량7,8차이 매우 이질적인 인구를 나타냅니다. hDPSCs 익스프레스 중간 엽 줄기 세포 (CD44, CD90, CD73, CD105, STRO-1)에 대 한 특정 마커, 그들은 일부 조 혈 마커 (CD14 CD19 등)에 대 한 부정적인 고 생체 외에서 multilineage 차별화9, 의 10,11.
몇몇 저자가이 세포는 NGF, bFGF, 특정 미디어 및 보충7,12와 함께에서 EGF의 추가 포함 하는 다른 프로토콜을 사용 하 여 같은 신경 세포로 분화 할 수 나타났습니다. 또한, 많은 단백질 신경 분화 과정에 참여 하 고,이 중, 여러 논문 표시 모두 배아와 성체 줄기 세포13, 관련 역할 및 세포 프리온 단백질 (PrPC)의 중요 한 표현 14. PrPC 나타냅니다 구리 물질 대사, apoptosis로 셀 안에 서로 다른 기능을 수행할 수 있는 다 면 발현 성 분자 그리고 저항을 산화 스트레스15,,1617 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22.
우리의 이전 종이23, 우리는 PrPC hDPSCs 신경 분화 과정에서의 역할을 조사. 사실, hDPSCs 익스프레스 PrPC 조 하 고, 신경 감 별 법 후 추가 증가 관찰 하는 것이 가능 했다. 다른 저자는 PrPC 줄기 세포의 신경 분화 과정에서의 가능한 역할을 가정 했다. 실제로, PrPC 신경, oligodendrocytes, 및 이다24에 인간 배아 줄기 세포의 분화를 드라이브. 이 연구의 목적은 신경 감 별 법 동안 치과 펄프, 그것의 분화 과정과 PrPC 의 역할에서 줄기 세포를 얻기 위한 방법론을 강조 했다.

<table><tbody><tr><td>Amphotericin B 솔루션</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2942</td><td>이것은 세포 배양 매체를 보충하는 데 사용되며, Streptomyce</td></tr><tr><td>Anti-B3tubulin</td><td>세포 신호 기술의</td> 폴리엔 항진균 항생제입니다.<td>#4466</td><td>여섯 가지 B-tubulin isoform 중 하나로, 태아와 출생 후 발달 중에 높게 발현되며, 말초 신경계에서 높게 유지</td></tr>되는 <tr><td>Anti-CD105&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>611314</td><td>Endoglin (CD105)은 인간 혈관 내피의 주요 당단백질로, 큰 세포 외 영역, 소수성 transmembrane 영역, 그리고 짧은 세포질 꼬리를 가진 타입 I 일체형 막 단백질입니다</td></tr>. <tr><td>Anti-CD44</td><td>Millipore</td><td>CBL154-20ul</td><td>양성 세포 마커 항체는 중간엽 줄기 세포에 대해 지시</td></tr>됩니다. <tr><td>Anti-CD73&nbsp;</td><td>세포 신호 전달 기술&nbsp;</td><td>13160</td><td>CD73은 세포 외 뉴클레오시드 모노포스페이트의 가수분해를 촉진하는 70 kDa 글리코실 포스파티딜이노시톨, 막 결합 당단백질로, 세포 외 뉴클레오시드 모노포스페이트의 가수분해를 촉매</td></tr>합니다. <tr><td>Anti-CD90</td><td>Millipore</td><td>CBL415-20ul</td><td>양성 세포 마커 항체는 중간엽 줄기 세포에 대한</td></tr> 항체입니다. <tr><td>Anti-GAP43&nbsp;</td><td>세포 신호 전달 기술&nbsp;</td><td>#8945</td><td>는 성장 원뿔 및 고가소성</td></tr><tr><td>항-마우스 PE&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab7003</td><td>은 플로우 사이토메트리 또는 FACS 분석에서 사용되는 항체입니다</td></tr><tr><td>. Anti-NFH&nbsp;</td><td>세포 신호 전달 기술&nbsp;</td><td>#2836</td><td>은 총 Neurofilament-H 단백질</td></tr><tr><td>Anti-PrP mAb EP1802Y의</td> 내인성 수준을 감지하는 항체입니다.<td>Abcam</td><td>ab52604</td><td>토끼 단클론 [EP 1802Y]에서 프리온 단백질 PrP</td></tr><tr><td>안티-토끼 CY5&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab6564</td><td>는 유세포 분석 또는 FACS 분석에 사용되는 항체입니다</td></tr>. <tr><td>Anti-STRO 1</td><td>Millipore</td><td>MAB4315-20ul</td><td>양성 세포 마커 항체는 중간엽 줄기 세포</td></tr><tr><td>B27 Supp XF CTS</td><td>Gibco에 의해 생명 과학 기술</td><td>A14867-01</td><td>B-27&nbsp; 만능 줄기 세포(PSC)에서 인간 신경 줄기 세포(hNSC)의 유도, hNSC의 확장을 지원하는 데 사용할 수 있습니다. hNSC의 분화 및 배양에서 성숙한 분화 뉴런의 유지</td></tr><tr><td>BD Accuri C6 유세포 분석기&nbsp;</td><td>블루 레이저(488 nm)와 레드 레이저(640 nm)가 장착된</td> <td>BD Biosciences</td><td>AC6531180187</td> 유세포 분석기</tr><tr><td>BD Accuri C6 소프트웨어&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>는 데이터를 획득하고, 통계를 생성하고, 결과를 분석하기 위해 BD Accuri C6 유세포 분석기 시스템을 제어합니다</td></tr>. <tr><td>bFGF</td><td>PeproThec, DBA</td><td>100-18B</td><td>basic Fibroblast Growth Factor&nbsp;</td></tr><tr><td>원심분리기 CL30R</td><td>Termo fisher Scientific</td><td>11210908</td><td>이것은 밀도를 기반으로 액체, 가스 또는 액체의 분리에 사용되는 장치입니다</td></tr>. <tr><td>CO2 인큐베이터 3541</td><td>Termo fisher Scientific</td><td>317527-185</td><td>세포 배양에 대한 최적이고 재현 가능한 성장 조건을 보장합니다</td></tr>. <tr><td>콜라겐 분해 효소, IV 타입;</td><td>Life Technologies</td><td>17104019</td><td>Collagenase는 중성 아미노산 (X)과 글리신 사이의 결합을 Pro-X-Glyc-Pro 순서로 절단하는 프로테아제이며, 이는 콜라겐 일회용 메스에서 높은 빈도로 발견됩니다</td></tr><tr><td>.</td><td>Swann-Morton</td><td>501</td> 조직을 <td>절단하는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td>.</td><td>DMEM-L</td><td>Euroclone</td><td>ECM0060L Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose with L-Glutamine with Sodium Pyruvate</td></tr><tr><td>EGF</td><td>PeproThec, DBA</td><td>AF-100-15</td><td>표피 성장 인자&nbsp;</td></tr><tr><td>라이프 테크놀로지</td>스 <td>10270-106</td> FBS의 <td>소 태아 혈청</td> 깁코<td>는 세포 배양에서 다양한 기능을 제공하기 때문에 인기 있는 미디어 보충제입니다. FBS는 영양소, 성장 및 부착 인자를 전달하고 무혈청 매체(SFM) 시스템에서 재현하기 어려운 메커니즘에 의해 산화 손상 및 세포사멸로부터 세포를 보호합니다</td></tr>. <tr><td>Filtropur BT50 0.2,500 mL Bottle top filter</td><td>Sarstedt</td><td>831,823,101</td><td>용액의 여과에 사용되는 장치입니다</td></tr>. <tr>PRNP <td>Qiagen</td><td>GS5621</td><td></td><td>용 Flexitube GeneSolutionEntrez 유전자 5621을 위한 4개의 siRNA. 표적 서열 N.1 TAGAGATTTCATAGCTATTTA&nbsp; N.2 CAGCAAATAACCATTGGTTAA&nbsp; N.3. CTGAATCGTTTCATGTAAGAA&nbsp; N.4&nbsp; CAGTGACTATGAGGACCGTTA</td></tr><tr><td>Hank의 솔루션 1x</td><td>Gibco by life technologies</td><td>240200083</td><td>Hanks&prime의 필수 기능; 균형 잡힌 소금 용액은 pH와 삼투압 균형을 유지하는 것입니다. 또한 세포에 물과 필수 무기 이온을 제공합니다</td></tr><tr><td>. HiPerFect Transfection Reagent&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>301705</td><td>HiPerFect Transfection 시약은 양이온성 및 중성 지질의 독특한 혼합물로, 효과적인 siRNA 흡수와 세포 내 siRNA의 효율적인 방출을 가능하게 하여 낮은 siRNA 농도의</td></tr><tr><td>Neurobasal A&nbsp를</td> 사용하더라도 높은 유전자 녹다운을 가능하게 합니다.<td>생명 기술의 Gibco</td><td>10888022</td><td>Neurobasal-A Medium은 순수한 출생 후 및 성인 뇌 뉴런의 장기 유지 및 성숙을 위해 설계된 기초 배지입니다&nbsp;</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30525-89-4</td><td>파라포름알데히드는 염색 절차 중 세포와 조직 부분을 고정하는 데 사용되었습니다</td></tr><tr><td>. 페니실린/스트렙토마이신;</td><td>유로클론</td><td>ECB3001D&nbsp;</td><td>세균 오염을 통제하기 위하여 세포 배양 매체를 보충하기 위하여 사용</td></tr> 입니다<tr><td>인산염 완충 식염수&nbsp; (PBS)</td><td>유로클론</td><td>ECB4004LX10&nbsp;</td><td>PBS는 포유류 세포의 취급 및 배양에 사용되는 균형 잡힌 염 용액입니다. PBS는 포유류 세포를 관개하고, 세척하고, 희석하는 데 사용됩니다. 인산염 완충은 생리학적 범위</td></tr><tr><td>TC-Platte 6 well, Cell+,F</td><td>Sarstedt</td><td>833,920,300</td><td>부착 세포의 성장 표면입니다</td></tr><tr><td>조직 배양 플라스크 T-25,Cell+,Vented Cap</td><td>Sarstedt</td><td>833,910,302</td><td>조직 배양 플라스크 T-25, 폴리스티렌, 민감한 부착 세포를 위한 Cell+ 성장 표면, 예: 일차 세포, 경사진 목, 환기 캡, 노란색, 멸균, 발열원이 없고, 비세포 독성, 10 개/봉지</td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td>약한 비변성 조건에서 막 구성 요소의 회수를 위해 널리 사용되는 비이온 계면활성제</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA&nbsp;</td><td>유로클론</td><td>ECB3052D&nbsp;</td><td>트립신은 라이신과 아르기닌 아미노산 잔기의 C 말단 쪽에서 펩타이드를 절단합니다. 트립신은 배양 표면에서 부착 세포를 제거하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>튜브</td><td>Sarstedt</td><td>62,554,502</td><td>튜브 15 mL, 120 mm x17 mm, PP</td></tr><tr><td>VBH 36 C2 컴팩트</td><td>멸균</td><td>ST-003009000</td><td>환경 및 작업자를 완전히 보호합니다</td></tr>. <tr><td>ZEISS Axio Vert.A1 &ndash; 반전&nbsp; 현미경</td><td>Zeiss</td><td>3849000962</td><td>ZEISS Axio Vert.A1은 독보적인 보급형 가격이며 명시야, 위상차, PlasDIC, VAREL, 향상된 hoffman 변조 대비(iHMC), DIC 및 형광을 포함한 모든 콘트라스트 기술을 제공할 수 있습니다. 형광 표지된 세포에 대한 부드러운 이미징을 위해 LED 조명을 통합합니다. Axio Vert.A1은 일상적인 작업을 위해 인체공학적으로 설계되었으며 조직 배양 후드 내부에 넣을 수 있을 만큼 컴팩트합니다.</td></tr></tbody></table>

절연, 전파, 그리고 인간의 치과 펄프의 줄기 세포의 신경 분화 동안 프리온 단백질 표정

Isolation, Propagation, and Prion Protein Expression During Neuronal Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells

Bioethical 문제점 배아 줄기 세포의 조작에 관련 된 의료 연구의 분야에서 발전을 방해 있다. 이러한 이유로, 혈액, 골 수, 탯 줄, 지방 같은 다른 조직에서 성체 줄기 세포를 얻기 위해 매우 중요 하다. 가능한 소스 중 치과 펄프 이므로 특히 흥미로운 bioethical 고려 사항에 대 한 얻을 쉽습니다. 실제로, 인간 치과 펄프 줄기 세포 (hDPSCs) 같은 신경 세포에서 분화 할 수 성인 줄기 세포의 종류와 건강 한 환자 (13-19 세)의 세 번째 어 금 니에서 얻어질 수 있다. 특히, 치과 펄프 굴 삭 기 제거, 작은 조각으로 잘라, 콜라 4로 치료 되었고 플라스 크에서 경작. 신경 감 별 법을 유도, hDPSCs는 2 주 동안 EGF/bFGF와 자극 했다. 이전에 우리는 분화 과정에서 세포 프리온의 내용을 hDPSCs에서 단백질 (PrPC) 증가 증명 하고있다. Cytofluorimetric 분석 PrPC 신경 감 별 법 과정 후 증가의 초기 표현을 했다. SiRNA로 PrPC 의 절제 PrP EGF/bFGF에 의해 유도 된 신경 감 별 법을 방지. 이 문서에 우리 우리 향상 격리, 분리 및 여러 쉬운 절차를 가진 hDPSCs의 재배 방법을 생체 외에서 보다 효율적인 세포 클론 했다 중간 엽 줄기 세포 (MSCs)의 획득 및 대규모 확장 설명 관찰 되었다. 우리는 또한 어떻게는 프로토콜에 대 한 자세한 방법으로 얻은 hDPSCs는 MSCs의 신경 분화 과정과 후속 세포질과 분자 과정을 공부 하는 우수한 실험 모델을 보여줍니다.

세 번째 모 랄에서 얻은 치과 펄프에서 hDPSCs의 격리 및 분리 절차는 작은 변화 파괴적인 결과 발생할 수 있는 복잡 한 프로세스. 이 문서에서 사용 하는 프로토콜의 아서 외. 12 여러 가지 개선입니다. 절차의 대표적인 구조는 그림 1에 표시 됩니다.
hDPSCs 셀 별개 복제와 증식 및 차별화 용량7,8차이의 이종 인구를 나타냅니다. 펄프 분리 및 펄프의 작은 파편의 시드, 후 주변에 확장 하는 셀의 클러스터 관찰 합니다. 그림 2 는 4 일 (중앙 패널)과 7 일 (오른쪽 패널) 치과 펄...

여기 우리는 프리온 단백질 표정 신경 분화 과정을 평가 하기 위해 인간의 치과 펄프의 줄기 세포 분리 및 전파에 대 한 프로토콜을 제시.

Bioethical issues related to the manipulation of embryonic stem cells have hindered advances in the field of medical research. For this reason, it is very ...

치과 펄프에서 줄기 세포를 얻는 표준 방법은 제대로 효율적이며, 이것은 몇 가지 변수에 따라 달라집니다. 우리의 프로토콜은 케이스의 90%에서 처리된 치아에서 줄기 세포의 성공적인 격리를 얻는 것을 허용했습니다. 몇 주에 세포의 높은 수를 얻는 것이 주요 이점입니다.이를 통해 우리는 재생 의학에서 세포를 사용하고 다른 과학자들에게 이 유용한 도구를 제공하는 바이오 뱅크를 만들 수 있습니다. 치아를 여는 절차는 콘스탄티노 산타크로체 박사가 수행합니다. 그 후, 프로토콜은 스테파노 마르텔루치에 의해 표시됩니다, 내 실험실에서 박사 과정 학생, 누가 기사의 첫 번째 저자입니다.시작하려면 환자에게서 세 번째 어금니를 추출하고, PBS로 빠르게 헹구고, 배지로 15 밀리리터 테스트 튜브에 넣고, 2시간 이내에 실험실로 이송합니다. 생물학적 위험 후드 아래에서 커터를 사용하여 펄프 챔버의 지붕을 통해 관상 절단 패스, 평행 및 접선으로 치아를 엽니다. 작은 굴삭기로 펄프를 부드럽게 제거하고 테스트 튜브에 놓습니다.그런 다음 PBS로 세 번, 원심분리기를 실온에서 2, 500g에서 10분간 세척합니다. 원심 분리 후, 상체를 제거합니다. 행크의 용액에서 펠릿을 다시 중단하고 샘플을 페트리 접시로 옮킨다.행크의 용액을 실온에서 2, 500배 에서 10분 동안 원심분리하여 제거합니다. 그런 다음 일회용 메스를 사용하면 펄프를 약 1mm 슬라이스로 나누고 IV 콜라게나아제 타입의 밀리리터를 추가합니다. 다음으로, 10분 동안 실온에서 2, 500배 g의 원심분리기.상체를 제거하고 매체에서 펠릿을 다시 분리합니다. 5%의 이산화탄소에서 섭씨 37도에서 줄기 세포에 특이적인 T25 플라스크에서 배양합니다. 인큐베이션 기간 동안, 3일마다 배양 배지를 변경한다.부착 세포가 합류에 도달하면, 그들을 분리하기 위해 세포에 트립신-EDTA 용액의 1 밀리리터를 추가하고 3 분 동안 섭씨 37도에서 세포를 배양하십시오. 다음으로, 배양 배지의 4밀리리터를 1대 5 비율로 추가하여 트립신 작용을 중지하고, 6분 동안 259배 g의 세포 현탁액을 원심분리한다. 상부체를 제거합니다.그런 다음, 전파T25 플라스크에 세포를 배치합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 트립신-EDTA 1 밀리리터로 세포를 3분간 분리합니다. 6 분 동안 259 배 g에서 세포 현탁액을 원심 분리합니다.상체를 제거하고 세포불피 분석을 위해 세포를 테스트합니다. 일시적인 프리온 단백질 침묵 단계를 수행하기 위해, 먼저 인간 치과 펄프 줄기 세포를 배양하여 배양 배지의 2밀리리터를 24시간 동안 배양한다. 그런 다음, 각 샘플에 작은 간섭 RNA PrP 배지의 400 마이크로리터를 추가하고 6 시간 동안 섭씨 37도에서 배양합니다.siRNA PrP 배지를 폐기하지 않고, 배양 배지의 1.6 밀리리터를 1대 5 비율로 추가하고, 세포를 섭씨 37도에서 72시간 동안 둡니다. 인큐베이션 기간 이후에는 상체를 제거하고 실온에서 PBS 2밀리리터로 셀을 세워주세요. 그런 다음, 신경 배양 배지의 2 밀리리터를 추가하고, 섭씨 37도에서 인큐베이터에서 7~14일 동안 세포를 유지한다.인큐베이션 기간 후 실온에서 PBS2밀리리터로 세포를 세척하고 서부 블롯 분석을 진행하여 뉴런 표면 항원 검사를 진행한다. 신경 유도 과정을 수행하기 위해, 배양 2 백만 인간의 치과 펄프 줄기 세포 6 잘 플레이트에서, 펄프 분리에서 최대 28 일. 3일마다 상체를 버리십시오.실온에서 PBS2밀리리터로 3회 세척하고, 뉴런 배양 배지의 2밀리리터를 교체한다. 7~14일 후에는 섭씨 37도에서 트립신-EDTA 1밀리리터로 세포를 3분간 분리합니다. 그런 다음 배양 배지의 4밀리리터를 1대 5 비율로 추가하여 트립신 동작을 중지합니다.인간 치과 펄프 줄기 세포를 유동 세포측정에 의한 특성화하기 위해, 배양 배지의 2밀리리터를 가진 6웰 플레이트에서 세포의 밀리리터당 2백만 배양. 28 일 치과 후 펄프 분리 또는 뉴런 배양 배지와 함께 추가 14 일 후, 세포를 분리하는 3 7 섭씨 37도에서 트립신-EDTA의 1 밀리리터를 추가합니다. 다음으로, 배양 배지의 4밀리리터를 1대 5 비율로 추가하여 트립신 작용을 중지하고, 원심은 실온에서 259배 g에서 6분 동안 한다.PBS에서 4%의 파라포름알데히드300마이크로리터를 10분 동안 섭씨 4도에 고정합니다. 다음으로, 원심분리기는 상온에서 PBS에서 1%비이온 계면활성제로 세포를 10분 간 추가로 퍼미크하게 한다. 그런 다음 원심분리기를 다시 폐기하고, 상온에서 PBS의 1밀리리터에서 5%의 무지방 건조 우유로 블로킹을 수행합니다.PBS의 1 밀리리터로 세 번 세척하고, 안티 CD105, 안티 -CD44, 안티 스트로 - 1, 안티 CD90, 안티 CD73, 안티 베타 - 3 튜룰린, 안티 NFH, 및 반 GAP43 단일 클론 항체를 1 시간 동안 으로 배양. 다음으로, 세포를 6분 간격으로 PBS 1밀리리터로 3회 연속으로 다시 3회 연속한 다음, 실온에서 항마우스 PE 또는 항토끼 CY5 모노클론 항체로 배양한다. 면역 양성 세포를 게이팅하기 위해 이차 항체를 사용하고 유동 세포계로 모든 샘플을 분석하십시오.배양 배지의 2밀리리터를 가진 6웰 플레이트에서 인간 치과 펄프 줄기 세포의 밀리리터 당 2백만 개의 세포를 배양한다. 21 일과 28 일 치과 후 펄프 분리 또는 뉴런 배양 배지와 함께 7 ~ 14 일 추가 후, 세포를 분리하는 3 분 동안 섭씨 37도에서 트립신-EDTA의 1 밀리리터를 추가합니다. 그런 다음 원심분리기를 폐기한 다음 PBS에서 4%의 파라포름알데히드로 표본을 10분 동안 섭씨 4도에 수정합니다.다음으로, 원심분리기는 상주체를 버린 다음 실온에서 PBS에서 1%가 아닌 계면활성제로 10분 동안 퍼메아빌화한다. 상체를 제거하고 토끼 안티 PrP 단일 클론 항체로 세포를 실온에서 1 시간 동안 얼룩지게하십시오. 마지막으로, 원심분리기는 상체를 폐기한 다음 실온에서 토끼 CY5 모노클론 항체를 추가로 배양한다.유동 세포계로 모든 샘플을 분석합니다. 펄프 분리 후, 인간 치과 펄프 줄기 세포의 클러스터는 주변에 확장되었다. EGF/bFGF에 의해 유도된 신경 분화 전후에 이들 세포의 성장 사이의 비교는 세포 형태와 중성염에 있는 중요한 변화를 보여주었습니다.치료되지 않은 인간 치과 펄프 줄기 세포는 CD44, CD90, CD105, CD73 및 STRO-1과 같은 다능성 중간엽 기질 특정 표면 항원들을 발현하였다. 적절한 신경 유도 자극 후, 이러한 세포는 베타-3-tubulin, NFH 및 GAP43과 같은 특정 신경 마커를 발현하였다. 처리되지 않은 세포 또는 처리된 세포는 CD14 및 CD19와 같은 조혈 마커를 발현하지 않았다.28일 후, 프리온 단백질은 해당 음성 조절에 비해 인간 치과 펄프 줄기 세포에서 조숙하게 발현되었고, EGF/bFGF에 의해 유도된 뉴런 분화 과정 이후에 그 발현이 증가하였다. 서양 얼룩 분석은 EGF/bFGF 자극 전에 sRNA에 의한 프리온 단백질을 침묵시키는 것은 신경 마커 베타-3-튜룰린 및 NHF의 발현을 방지함으로써 인간 치과 펄프 줄기 세포의 신경 분화 과정에 영향을 미칠 수 있음을 보여주었다. 가장 중요한 것은 펄프에서 세포를 분리하는 효소의 선택입니다.사실, 효소가 너무 공격적이면 세포가 손상될 수 있으며 성장과 분화 능력이 손상될 수 있습니다. 치과 펄프 줄기 세포는 재생 의학 분야에서 생체 내 및 체외 연구에 사용할 수있는 우수한 실험 모델입니다. PrP는 치과 펄프 줄기 세포의 신경 분화 과정에 중요한 역할을하기 때문에,이 마커는 신경 퇴행성 질환에서 효과적인 대상으로 우수한 후보가 될 수 있습니다.조언해야 할 가장 중요한 측면은 전염병의 부재와 같은 환자의 건강 상태입니다.

isolation-propagation-prion-protein-expression-during-neuronal

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

방법 중 하나를 사용하여 인간의 치과 펄프의 줄기 세포 (hDPSCs)의 분리 및 특성...

인간 치과 펄프의 줄기 세포의 분리, 특성화 및 비교 차별화 두 가지 방법을 사용하여 영구 치아에서 파생

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교차 의사소통을 위한 치아 치수 세포와 삼차 신경 세포의 공동 배양 확립

이 비디오는 테트라사이클린 반응성 요소의 제어 하에 신경인성 전사 인자 유전자를 운반하는 엔지니어링된 렌티바이러스로 인간 만능 줄기세포를 형질 주입하여 뉴런으로 분화하도록 유도한 후 테트라사이클린 유도체 및 성숙 배지로 처리하는 과정을 보여줍니다.

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이 프로토콜 인간의 치과 여 포에서 추출한 치아 줄기 세포의 변이 유전 공학에 설명 합니다. 적용된 비 바이러스 성 수정 전략 치료 줄기 세포 제품의 개선 위한 기초 될 수 있습니다.

절연, 특성화 및 예측에 관한 기반 유전자 조작 인간 치과 여 포 줄기 세포의

우리는 치과 펄프 (DP) 1 차 세포의 격리, 분산 및 도금이 지나치게 트랜스웰 필터 위에 배양된 삼차 (TG) 뉴런을 설명합니다. DP 세포의 세포 반응은 면역 형광 또는 RNA /단백질 분석으로 분석 될 수있다. 공초점 현미경검사법을 가진 신경 마커의 면역형광은 신경질성 파생 반응의 분석을 허용합니다.

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이 논문은 외식물 배양 방법을 사용하여 치수 줄기세포의 1차 배양을 확립하고 ICSCRT 지침에 따라 이러한 세포의 특성을 분석하기 위한 단계별 가이드를 제공합니다. 이 프로토콜에 의해 분리된 세포는 추가 응용을 위한 중간엽 줄기 세포로 간주될 수 있습니다.

치과용 치수줄기세포의 1차 배양

이 프로토콜은 효소 소화를 통해 치수에서 다분화능 줄기 세포의 추출, 배양 및 보존을 강조합니다. 또한 조골세포, 지방세포 및 연골세포로 분화할 수 있는 잠재력을 보여주며 공정에서 정밀도와 일관성의 중요성을 강조합니다.

Isolation, Culture, and Characterization of Dental Pulp Stem Cells from Human Deciduous and Permanent Teeth(인간 낙엽 및 영구치에서 치과용 치수 줄기 세포의 분리, 배양 및 특성화)

인간의 근육에서 유래한 주요 부착 세포 유형은 근육 세포와 섬유아세포입니다. 여기에서 세포 집단은 CD56 항원을 기반으로 하는 자기 활성화 세포 분류를 사용하여 농축됩니다. 이후 특정 항체를 사용한 면역 라벨링과 이미지 분석 기법을 사용하여 개별 세포의 세포질 및 핵 특성을 정량화할 수 있습니다.

인간의 골격근에서 기본 근육 조직 세포와 섬유 아 세포의 분리 및 정량 면역 세포 화학 특성

이 프로토콜은 다능성 검사를 통해 피하 지방 조직에서 돼지 지방 유래 줄기 세포(pADSC)를 분리하는 방법을 설명합니다. 다분성 pADSC는 지방 세포 분화 과정을 설명하고 재생 연구를 위해 중배엽 중간엽의 여러 세포 계통 또는 외배엽 및 내배엽의 추가 계통으로의 전분화를 연구하는 데 사용됩니다.

돼지 피하 지방이 조직에서 분리 및 지방이 유래 줄기 세포의 분화

학습하세요 인간 치과 펄프 줄기세포(DPSCs)의 효율적인 분리 및 배양 방법과 신경 분화 과정에서의 프리온 단백질 발현 평가 기법을. 이 프로토콜은 재생의학 연구와 바이오뱅크 구축에 활용됩니다.

절연, 전파, 그리고 인간의 치과 펄프의 줄기 세포의 신경 분화 동안 프리온 단백질 표정

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