Name: 線虫剤群連鎖球菌によって引き起こされる酸化ストレスの勉強 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: 学ぶ Caenorhabditis elegansを用いたMitis Group streptococciによる過酸化水素産生の病原性解明法。生物学的活性酸素種を活用し、宿主-病原体相互作用における酸化ストレス応答を評価する持続可能な実験系を確立します。

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我々 は博士 Bing ヤン王、博士ジーナ ・ トリブル (テキサス大学、歯学部) に感謝博士リチャード ・ ラモント (ルイビル大学、歯学部), と博士サミュエル ・ シェルバーン (MD アンダーソンがんセンター) 研究室と臨床株の提供するため可鍛鋳鉄群連鎖球菌。我々 はまたc. の elegansの緊張のため博士キース ・ ブラックウェル (遺伝部、ハーバード大学医学部) を感謝します。最後に、試薬、研究を行なうワーム株を提供するため博士ダニエル ガーシン、彼女の研究室 (テキサス大学、マクガヴァン医学) をありがちましょう。いくつかのワームの系統は、CGC、研究インフラ プログラム (P40 OD010440) の NIH のオフィスによって資金が供給されるによって提供されました。

1. 汝 (トッド ・ ヒューイット酵母エキス) 寒天の調製
<ol><li>メディアの 1 L は、トッド ・ ヒューイット パウダー、酵母エキスと 2 L の三角フラスコに寒天 20 g 2 g の 30 g を追加します。970 mL の脱イオン水をフラスコの内容に追加し、攪拌棒を含めます。オートクレーブ 15 ポンド/インチ2 30 分のための 121 ° C の温度及び圧力でメディア。その後、メディアを撹拌プレート上に設定し、穏やかな攪拌しながら冷却を可能にします。</li>
	<li>層流の下で適切に大きさで分類された滅菌シャーレ (35 × 10 mm 皿でアッセイを殺す細菌の成長と維持のため 100 mm × 15 mm 皿) にメディアを注ぐ。層流フードの下で 2 時間乾燥するメディアを許可します。その後、プレートを 4 ° C で 1 ヶ月保存できます。</li>
</ol>2. 線虫培 (NGM) と RNAi プレート (NGM RNAi) の供給の準備
<ol><li>攪拌棒を使用して、2.5 g ペプトンと 970 ml の脱イオン水 2 L の三角フラスコでの塩化ナトリウム 3 g を溶解します。寒天 20 g をメディアに追加します。オートクレーブ 15 ポンド/インチ2 30 分のための 121 ° C の温度及び圧力でメディア撹拌プレートにメディアを設定し、穏やかな攪拌しながら冷却を可能にします。</li>
	<li>NGM プレートの準備のためメディアに以下のソリューションを追加: 25 mL の 1 M カリウム リン酸バッファー (pH = 6.0)、1 M MgSO4、1 M CaCl2、(95% エタノールに 5 mg/mL) コレステロールの 1 mL の 1 mL の 1 mL、1 mL (10% のエタノールで v/w) ナイスタチンと 25 mg/mL ストレプトマイシンの 1 mL。</li>
	<li>NGM RNAi プレートを給餌の準備のためメディアに以下のソリューションを追加: 25 mL の 1 M カリウム リン酸バッファー (pH = 6.0)、1 M MgSO4、1 M CaCl2、(95% エタノールに 5 mg/mL) コレステロールの 1 mL の 1 mL の 1 mL、(10% のエタノールで v/w) ナイスタチンの 1 mL、50 mg/mL carbenicillin 1 mL と IM IPTG の 1 mL。</li>
	<li>層流の下で滅菌シャーレ 60 mm × 15 mm にメディアを注ぐ。層流フードの下で 2 時間乾燥するメディアを許可します。その後、1 ヶ月、4 ° C でプレートを格納できます。</li>
</ol>3. c. の elegansのメンテナンス
<ol><li>シード一晩 50 μ L スポッティングによる NGM 板には、プレートの中央にエシェリヒア属大腸菌OP50 が栽培されています。大腸菌文化はルリア ベルターニカミラ (LB) メディアに事前に準備し、数ヶ月のための 4 ° C で保存します。プレートをカバーし、層流フードの下で 24 時間乾燥し、その後プレートをポリスチレン容器に格納できるようにします。</li>
	<li>解剖顕微鏡の下で滅菌ワーム ピックを使用して妊娠大人 12 名に 10 をピックアップし、大腸菌にワームを転送 OP50 シード NGM プレート。20 ° C でプレートを一晩インキュベートします。</li>
	<li>次の日は滅菌ワーム ピックを使用して大人を削除し、20 ° c (~2.5 日) L4 幼虫に成長する胚を許可します。</li>
</ol>4. 人口ワームの同期の準備
<ol><li>
2 M9W を使用して 4 つの NGM プレートから妊娠の大人を洗浄し、15 mL の円錐管でそれらを収集します。
	<ol>
<li>M9W を準備する: 塩化ナトリウム 3 g、6 g の Na2HPO4KH2PO4の 3 g を結合し、最終的な量 1 L の脱イオン水に溶解します。オートクレーブ ソリューション 1 M MgSO4の 1 つの mL を追加。</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 分の 450 x gでチューブをスピンし、ワームのペレットがままを確保しつつ、上清をデカントします。</li>
	<li>8.25% ナトリウム次亜塩素酸 (家庭用漂白剤) の 400 μ L とワームの換散ソリューションを準備する 5 N NaOH の 100 μ L を追加します。ワーム ペレットを溶解ソリューションを追加し、大人のワームの 70% が分離するまで管をフリックで内容をミックスします。卵の overbleaching がないように解剖顕微鏡下でチューブの内容を定期的に観察します。</li>
	<li>M9W の 10 mL をコニカル チューブの内容に追加することで漂白剤ミックスを希釈します。</li>
	<li>1 分デカント上澄みの 450 x gでチューブをスピンし、M9W の 10 mL を追加します。</li>
	<li>4.5 の手順を 2 回繰り返します。</li>
	<li>3-5 ml M9W 結果卵ペレットを再懸濁します。チューブ回転にチューブを置きます。一晩常温 (RT) 18 rpm の速度で回転するチューブを許可します。</li>
	<li>次の日は、L1 幼虫を餌に 1 分間、450 x gでチューブをスピンします。管の液体の ~ 250 μ L を残して、吸引によって M9W のほとんどを削除します。L1 幼虫を再懸濁します、シャーレの蓋、解剖顕微鏡を用いた μ L 当たりワーム数を推定上にワーム懸濁液の場所 3 5 μ L が値下がりしました。</li>
</ol>5. ワームの RNAi の誘導
<ol><li>生殖を使用してループやピックアップ、50 μ G/ml carbenicillin とテトラサイクリンの 15 μ G/ml を含む 100 mm × 15 mm LB 寒天プレートの上に冷凍株 (Ahringer とヴィダル ライブラリ) から必要な RNAi を含む大腸菌系統を連勝。24 h の 37 ° C で版を孵化させなさい。</li>
	<li>ピックアップし、50 μ G/ml carbenicillin を添加した LB の 2 mL を含む滅菌 15 mL の円錐管に、RNAi ひずみから隔離されたコロニーを接種します。150 rpm で軌道シェーカーの 16 h の 37 ° C でチューブを孵化させなさい。</li>
	<li>次の日は 150 μ L 滅菌スプレッダーを使用して 65 mm × 15 mm NGM RNAi 給餌プレートの上に一晩培養の広がった24 h の 37 ° C で版を孵化させなさい。</li>
	<li>37 ° C で培養後 RT に冷却板を許可します。大腸菌(ワーム ステップの人口同期から取得) ~ 200 L1 幼虫を含む M9W の適切なボリューム シード餌板 NGM RNAi を追加します。幼虫 L4 段階 (~2.5 日) に達するまでは、20 ° C で版を孵化させなさい。</li>
</ol>6 可鍛鋳鉄群連鎖球菌の感染症のための準備
<ol><li>汝の寒天 100 mm × 15 mm の希望菌株のレンサ球菌を連勝 (プレートが 4 ° C で保存されている場合事前ウォーム プレートは 37 ° C それぞれの菌株をストリー キングする前に)、微好気の en を提供するキャンドル瓶に 37 ° C 一晩 (~ 18 h) でプレートをインキュベート(縞板は 4 ° C で 1 週間保存できます) レンサ球菌の成長のための環境。</li>
	<li>レンサ球菌の臨床分離株を反映するには、トリプシン大豆血液寒天培地を使用します。(〜 18 h) キャンドル瓶を一晩で 37 ° C でプレートを孵化させなさい。</li>
	<li>次の日はキャンドル瓶からプレートを取り外して滅菌ループを使用して隔離されたコロニーを拾います。汝の液 2 mL を含む 15 mL 滅菌円錐管を接種します。レンサ球菌の臨床分離菌を繁殖させる補完 THY ヒツジ血の 5 %v/v とスープ。タイトなキャップを閉じ、静的条件下 37 ° C でチューブを孵化させなさい。</li>
</ol>7 試金のサバイバル
注:このアッセイに必要な手順は、図 1に描かれています。グループはワームの殺害を担当、可鍛鋳鉄で H2O2が派生したことを示すため、カタラーゼ、または変異株 ΔspxBとメディアを補完し、補完するひずみ ΔspxB; spxB + s. gordoniiのことができます。使用します。SpxB は、H2O2剤群の生産に責任があるピルビン酸オキシダーゼをエンコードします。
<ol><li>35 × 10 mm をあらかじめ暖かい 37 ° c. に汝のプレートレンサ球菌の目的の系統の一晩の栽培文化の 80 μ L を追加し、滅菌スプレッダーを使用して寒天表面に細菌を完全に 。(〜 18 h) キャンドル瓶を一晩で 37 ° C でプレートを孵化させなさい。としてコントロール、エシェリヒア属大腸菌OP50 の一晩の栽培文化の 80 μ L でシード 2 35 ミリメートル × 10 mm NGM プレート。37 ° C でプレートを一晩インキュベートします。</li>
	<li>H2O2可鍛鋳鉄グループ プロデュースがワームの殺害に責任があることを確認、追加、なたにカタラーゼ c の 1,000 台を含む 50 μ L プレート。滅菌スプレッダーを使用してカタラーゼ溶液を広がり、30 分シードそれぞれ連鎖球菌株手順 7.1 で説明されているようでその後プレートを層流で乾燥するプレートを許可します。</li>
	<li>次の日キャンドル瓶からプレートを削除でき、滅菌ワームを使用して 10-15 分の RT に冷却するプレートを選ぶ、NGM またはレンサ球菌にプレートを供給 NGM RNAi から転送 30 L4 幼虫シード汝のプレートが。2 シード株のレンサ球菌あたり 60 ワームの合計で汝のプレートです。25 ° C で版を孵化させなさい</li>
	<li>解剖顕微鏡を使用して、各板いくつか縦長時ライブとデッドの L4 幼虫の数をカウントします。当初は、死者のようにワームをスコア、またはライブ 30 分毎。その後、ワームは急速に死に始め場合、は、15 分間隔でそれらをスコアします。優しくデッドオアア ライブかどうかワームを突くし滅菌ワーム ピックを使用します。ワームは動き、催促に応答がない場合、死者と見なされます。</li>
	<li>アッセイは、完了する 5 〜 6 時間かかります。2 回以上の実験を繰り返します。分析が完了したら、2 つのプレートからデータをプールします。各グループのデータを入力、生存曲線を比較し、統計ソフトを用いたカプラン ・ マイヤー生存分析を実行します。</li>
</ol>8. Agarose パッドの顕微鏡検査のための準備
<ol><li>電子レンジでソリューションを加熱することによって 2 %w/v 脱イオン水で寒天を溶解します。5 mL の溶液の量が 20 スライドを準備する十分です。</li>
	<li>ラボのテープの 2 つのガラス スライドに沿って縦棒します。これは agarose パッドの厚さを決定します。録音された 2 つのスライドの間のきれいなガラス スライドを配置します。</li>
	<li>きれいなスライドの中央に溶融 agarose の場所 100 μ L。すぐに溶融 agarose の上に別のきれいなガラスを置き、軽くパッドを作成する押し下げます。アガロースを固めるし、その後一番上のスライドを削除するを許可します。アガロース パッドは使用可能です。</li>
</ol>9.連鎖球菌感染に応答 SKN 1 局在の観察
注:このアッセイに必要な手順は、図 2で描かれています。SKN 1 のローカリゼーションは、SKN-1 b/C::GFP トランスジェニック ワームひずみを使用して決定されました。(WT) H2O2可鍛鋳鉄のグループは、野生型の生産のため SKN 1 のローカライズ、ΔspxB、およびを補体ひずみΔspxB; spxB + s. gordoniiを示すために使用されました。さらに、遺伝子改変レポーターひずみ SKN-1 b/C::GFP と RNAi 干渉は、p38 MAPK 経路のコンポーネントが SKN 1 のローカリゼーションを規制することを示すため使用されました。
<ol><li>35 × 10 mm をあらかじめ暖かい 37 ° c. に汝のプレート連鎖球菌の目的の系統の一晩の栽培文化の 80 μ L を追加し、滅菌スプレッダーを使用して寒天表面に細菌を完全に 。(〜 18 h) キャンドル瓶を一晩で 37 ° C でプレートを孵化させなさい。としてコントロール、エシェリヒア属大腸菌OP50 の一晩の栽培文化の 80 μ L でシード 3 35 ミリメートル × 10 mm NGM プレート。37 ° C 〜 18 時間でこれらの版を孵化させなさい。</li>
	<li>次の日、キャンドル瓶からプレートを削除、NGM から M9W を使用して 10-15 分洗浄 L4 幼虫の RT に冷却するプレートと NGM RNAi 給餌プレート。15 mL の円錐管にワームを収集します。</li>
	<li>450 x gで 1 分間、上清をデカントでチューブをスピンし、M9W の 10 mL を追加します。</li>
	<li>9.3 のステップを 3 回繰り返します。</li>
	<li>M9W の ~ 250 μ L でワームを再懸濁し、きれいなペトリ皿にワーム懸濁液の場所 3 つの 5 μ L 滴蓋し解剖顕微鏡を用いた μ L 当たりワームの数を推定します。</li>
	<li>汝の連鎖球菌シードそれぞれ、NGM大腸菌シード プレート 100 ~ L4 幼虫を追加します。細菌の株あたり 3枚のプレートを使用します。25 ° C で 2 に 3 h の版を孵化させなさい</li>
	<li>その後、インキュベーターからプレートを削除、M9W で洗って、15 mL の円錐管にワームを収集します。</li>
	<li>ワーム 3 を洗って x に従って手順 9.3。</li>
	<li>吸引により、M9W の大部分を除去し、M9W 含む 2 mM ナトリウム アジ化または 2 mM tetramisole 塩酸塩を 500 μ l 添加をワームのペレットに追加します。これはワーム、顕微鏡下でイメージを作成するとき、移動は行われませんを確保を麻酔が。 注意:アジ化ナトリウムを処理するときは、個人保護用具 (PPE) を使用します。化学のフードの下でアジ化ソリューションを準備します。</li>
	<li>15 分間常温ワーム餌を孵化させなさい。その後、準備されたアガロース パッドにワーム懸濁液の 15 μ L スポット。号 1.5 coverslip を麻酔下のワームを含む agarose パッドにそっとかぶせます。</li>
	<li>蛍光顕微鏡を用いた、SKN 1 利用フィルター FITC と DAPI のローカリゼーションを視覚化します。10 x、20 x の倍率でワームをイメージ。</li>
	<li>SKN 1 の局在化のレベルに基づくワームをスコアします。核局在化、SKN-1 b/C::GFP 前部または後部のワームでのローカリゼーション、SKN-1 b/C::GFP すべての腸細胞の核局在化として分類されるない低、中、高レベルのローカリゼーションのそれぞれ。</li>
	<li>蛍光顕微鏡を得点した後 chi - 乗と統計解析ソフトウェアを使用したフィッシャーの正確なテストの統計的な差異を決定します。</li>
</ol>

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著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

腸球菌 faecium、また嫌気性下で栽培した H2O2を作り出すなど他の病原細菌の説明する方法を使用できるまたは微好気条件26。通常、最も病原性生物の週間生存の試金を完了するにいくつかの日が必要。ただし、H2O2可鍛鋳鉄グループのメンバーによって堅牢な生産のためこれらの試金は記載されている条件の下で 5-6 時間以内完了でした。これにより短時間で宿主免疫に関与するいくつかの遺伝子候補と酸化ストレス応答を選別する能力です。
このプロトコルでは、細菌によって生成される H2O2はいくつかの障壁を越える必要がありますその他の外因性 ROS のソースではなく、ワームの腸の細胞と直接接触です。これにより、腸内細胞に H2O2が配信されることそれ故より堅牢な殺害の応答は、ワームで観察されます。蛍光に分類された細菌を使用すると、ワームが病原体を腸管<sup...

可鍛鋳鉄群連鎖球菌は、口腔咽頭腔1の人間共生生物です。ただし、これらの生物はこのニッチを脱出し、侵襲性疾患2のさまざまなを引き起こすことができます。これらの微生物によって引き起こされる感染症は、菌血症、心内膜炎、眼窩蜂巣炎2,3,4,5,6に含まれます。さらに、彼らは浮上して血流感染症の病原体としての免疫不全、好中球減少、および化学療法5,7,8,9を受けている癌患者.
可鍛鋳鉄グループの根本的な発生機序はあいまいなので、いくつかの病原因子が同定されているメカニズムです。H2O2、口腔微生物10で重要な役割を果たすことを示している可鍛鋳鉄グループが知られています。最近では、いくつかの研究は、上皮細胞の死11,12を誘導する毒素としての H2O2の役割を強調しています。このグループに属しているs. 肺炎は、DNA 損傷と肺胞細胞13でアポトーシスを誘導する H2O2の高レベルを生成する示されています。急性肺炎動物モデルを使用して、同じ研究者は、細菌によって H2O2の生産が病原性の利点を付与を示した。肺炎球菌性髄膜炎に関する研究は、その病原体由来 H2O2は神経細胞死14をトリガーするニューモリシンと相乗的行為をも示しています。これらの観察は明らかに病原性の細菌のこのグループによって生成される、H2O2が大事を確立します。
興味深いことに、それも示されている、可鍛鋳鉄のメンバー グループ化剤H2O215,16の生産を介して線虫C. elegansの死を引き起こす口腔単純性疱疹を米します。この線虫は、多くの生物学的過程を研究する、シンプルで扱いやすい遺伝子モデルとして使用されています。最近では、ワームは、宿主-病原体相互作用17,18を研究するモデルとして登場しました。さらに、いくつかの研究は、この有機体19,20,21を使用して酸化ストレスを調査する重要性を強調しています。そのライフ サイクルは短い、RNAi が興味の遺伝子をノックダウンし、緑色蛍光タンパク質 (GFP) の使用能力-融合レポーター遺伝子の発現を監視する、いくつかの魅力的なモデル システムにする属性。もっと重要なは、酸化ストレスとワームの自然免疫を調節する経路は哺乳類20,22と非常に節約されます。
このプロトコルではc. の elegansを使用してレンサ球菌由来 H2O2による病原性を解明する方法を示した。変更された生存分析が表示され、可鍛鋳鉄グループのメンバーが急速にワームを殺すことでH2O2の生産。活性酸素種の持続的な生物的源可鍛鋳鉄グループのメンバーを使用してこの (ROS) がワームで酸化ストレスを誘発する化学のソースではなく、提供されます。さらに、細菌は急速に、ワームを植民地化することができる H2O2 (いくつかの障壁を交差する必要がある他の情報源と比較して) 腸管細胞へ直接ターゲットとすることができます。アッセイは、どちらかskn 1変異株のまたは 2) N2 野生型を基準にしてワームおよびベクター駆除処理されたワームで RNAi を用いたskn 1ノックダウンの生存を決定する 1) によって検証されます。SKN 1 はc. の elegans23,24,25の酸化ストレス応答を調節する重要な転写因子です。生存の試金、以外 SKN-1 b/C::GFP 遺伝子改変レポーターを表現するワームひずみは可鍛鋳鉄グループによる活性化、酸化ストレス応答を介してH2O2の生産を監視するために使用されます。

<table><tbody><tr><td>培地および化学薬品</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アガロース&nbsp;</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>A9539-50G</td><td></td></tr><tr><td>バクトペプトン&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>DF0118-17-0</td><td></td></tr><tr><td>BDバクトトッドヒューイットブロス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>DF0492-17-6</td><td></td></tr><tr><td>BD BBL羊の血、除細動&nbsp;&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>B11947</td><td></td></tr><tr><td>BD Difco寒天&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>DF0145-17-0</td><td></td></tr><tr><td>BD Difco LBブロス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>DF0446-17-3</td><td></td></tr><tr><td>血液寒天培地(羊の血液を含むTSA)</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>R01200</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>BP510-500</td><td></td></tr>カル<tr><td>ベニシリン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP26481</td><td></td></tr><tr><td>カタラーゼ&nbsp;</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>C1345-1G</td><td></td></tr><tr><td>コレステロール</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>ICN10138201</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>MP21021012</td><td></td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム</td> フィ<td>ッシャー サイエンティフィック</td><td>BP213-1</td><td></td></tr><tr><td>ナイスタチン</td><td>アクロス 有機物</td><td>AC455500050</td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム 二塩基</td>性 <td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>BP363-500</td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム一塩基性</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP362-500</td><td></td></tr>ア<tr><td>ジ化ナトリウム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>S2002-25G</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>SS266-1</td><td></td></tr><tr><td>8.25%次亜塩素酸</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ナトリウムリン酸二塩基性&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>ストレプトマイシン硫酸塩&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP910-50</td><td></td></tr><tr><td>テトラサイクリン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>87128-25G</td><td></td></tr><tr><td>(マイナス)-テトラミソール塩酸塩</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>L9756</td><td></td></tr><tr><td>酵母エキス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1422-500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td><ストロング>消耗品&nbsp;</強力></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL円錐形滅菌ポリプロピレン遠心分離チューブ&nbsp;</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>12-565-269</td><td></td></tr><tr><td>ディスポーザブル・ポリスチレン・セロジカル・ピペット 10mL</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>07-200-574</td><td></td></tr><tr><td>ディスポーザブル・ポリスチレン・セロジカル・ピペット 25 mL</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>07-200-575</td><td></td></tr> ファ<tr><td>ルコン・バクテリア・シャーレ 蓋付き (35 mm x 10 mm)</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>08-757-100A</td><td></td></tr><tr><td>No. 1.5&nbsp; 18 mm x 18 mm カバースリップ</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>12-541A</td><td></td></tr><tr><td>透明蓋付きシャーレ (60 mm x 15 mm)</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>透明蓋付きシャーレ (100 mm x 15 mm)</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>プレーンガラス顕微鏡スライド (75 mm x 25 mm)</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>12-544-4</td><td></td></tr><tr><td><ストロング>ソフトウェア&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism</td><td>Graphpad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacterial Strains<</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>em>S. oralis ATCC 35037</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S. mitis ATCC 49456</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S. gordonii DL1 Challis&nbsp;&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>大腸菌OP50</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>大腸菌HT115</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Worm株</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strain</td><td>Genotype</td><td>Transgene</td><td>Source</td></tr><tr><td>N2</td><td>C. elegans 野生分離株</td><td></td><td>CGC</td></tr><tr><td>EU1</td><td>skn-1(zu67) IV/nT1 [unc-?(N754) Let-?](IV;V)</td><td></td><td>CGC</td></tr><tr><td>LD002</td><td>IdIs1</td><td>SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006)</td><td>キース・ブラックウェル</td></tr></tbody></table>

線虫剤群連鎖球菌によって引き起こされる酸化ストレスの勉強

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

線虫 (C. elegans)、線虫は、ホスト病原体の相互作用を研究する魅力的なモデルとして登場しました。提案するプロトコルは、H2O2の生産を介して可鍛鋳鉄群連鎖球菌によって引き起こされる病原性を決定するため、このモデルを使用します。可鍛鋳鉄群連鎖球菌菌血症、心内膜炎、眼窩蜂巣炎など多くの疾患を引き起こす新たな脅威であります。ここで説明した H2O2への応答でこれらのワームの生存を確認するためのプロトコルが病原体のこのグループによって生成されます。酸化ストレス応答転写因子の遺伝子skn 1エンコーディングを使用して、このモデルはレンサ球菌感染に対して不可欠な宿主遺伝子を識別するために重要であることを示す.さらに、緑色蛍光タンパク質 (GFP)、SKN 1 を融合遺伝子改変レポーター ワームひずみを用いたこれらの病原体の存在下で酸化ストレス応答の活性化を監視できることを示します。これらのアッセイは、H2O2を外ではなく、生物学的ソースによって派生する酸化ストレス応答を勉強する機会が活性酸素種 (ROS) ソースを追加提供します。

可鍛鋳鉄のメンバー グループ化剤、 s. 口腔単純性疱疹とs. gordonii急速に死亡とは対照的に, S. mutans、 s. レンサと非病原性大腸菌のワームは、OP50 (図 3A)。剤、 s. 口腔単純性疱疹、 S. gordoniiの生存期間の中央値は 300 分、300 分、345 分であった。殺害された H2O2によって仲介されるかどうかを決定するには、カタラーゼは汝の寒天に補われました。ワームの殺害は、カタラーゼ (図 3B) の存在下で廃止されました。さらにレンサ球菌派生 H2O2媒介ワーム、ΔspxB変...

線虫の線虫は、宿主-病原体相互作用を分析する優れたモデルです。ここで説明した、可鍛鋳鉄群連鎖球菌のメンバーとワームに感染し、H2O2を有機体のこのグループによって生成に対する酸化ストレス応答の活性化を決定するプロトコルです。

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented ...

このプロトコルでは、Mitis Groupストレプトコックシを介して生成された過酸化水素によって引き起こされる病原性を解明するために、自由な生きている方法c.エレガンスを使用する方法を示す。この技術の主な利点は、1リットルのメディアに対してトッド・ヒューイット粉末30g、酵母エキス2g、20gのアガーを2リットルのエルリン・マイヤーフラスコに加える化学源とは対照的に、活性酸素種の持続的な生物学的供給源を使用して、ワームの病原性とストレス応答の活性化を研究できることです。フラスコの内容物に970mlの脱イオン水を加え、攪拌棒に入れます。開口部をカバーするためにアルミホイルを使用してください。121°Cの温度でフラスコにメディアをオートクレーブし、30分間平方インチあたり15ポンドの圧力を加えます。その後、フラスコを攪拌プレートにセットし、穏やかな攪拌で冷まします。ラミナーフードの下に、適切なサイズの無菌ペトリ皿にメディアを注ぎます。メディアを2時間乾燥させます。その後、プレートを摂氏4度で1ヶ月まで保管します。ミティスグループレンサ球菌の準備の前に、THY寒天プレートをインキュベーターで摂氏37度に温めます。その後、場所にレンサプチコッシの所望の株をストリークアウトする無菌ループを使用します。その後、プレートをキャンドルジャーに入れ、瓶を摂氏37度で一晩で約18時間インキュベートし、微小性好水性環境を提供します。翌日、キャンドルジャーからプレートを取り出し、滅菌ループを使用して孤立したコロニーを選びます。2 ml の THY ブロスを含む 15 ml の滅菌コニカル チューブを接種します。キャップをしっかりと閉じ、静電気条件下で37°Cでチューブをインキュベートします。37°Cのインキュベーターで事前に暖かいTHYプレートは、THYプレートに1000単位のカタラーゼを含む溶液50マイクロリットルを追加します。滅菌スプレッダーを使用してカタラーゼ溶液を広げ、プレートを層流フードで30分間乾燥させます。レンサ球菌株でプレートを播種するには、ピペットを使用して一晩栽培された培養物の80マイクロリットルをプレートに加え、無菌スプレッダーを使用して寒天表面全体に細菌を完全に広げます。一晩キャンドルジャーに摂氏37度でプレートをインキュベートします。コントロールとして、2つのNGMプレートに、播種用に大腸菌OP-50の一晩成長培養物の80マイクロリットルを加える。一晩で摂氏37度でプレートをインキュベートします。翌日、キャンドルジャーからプレートを取り出し、プレートを室温まで冷却します。滅菌ワームピックを使用して、NGMフィードプレートから30 L4幼虫をレンサ球菌播種THYプレートに移します。プレートを摂氏25度でインキュベートします。解剖顕微鏡の下で、いくつかの時点で各プレート上の生きているおよび死んだL4幼虫の数を数える。滅菌ワームピックを使用して、ワームを穏やかに推進し、それらが死んでいるか生きているかを判断します。最初は、ワームを死んだものとしてスコア付けするか、30分ごとに生きています。ワームが急速に死に始めたら、15分間隔でそれらを採点する。アッセイの完了には5~6時間かかります。その後、実験を2回繰り返します。アガロースパッドを準備するには、2つのガラススライドに沿ってラボテープを縦に貼ります。これはアガロースパッドの厚さを決定します。2 つのテーピングスライドの間にきれいなガラススライドを置きます。アガロースを脱イオン水に溶かし、2重量体積%にし、溶液を電子レンジで加熱します。ピペットを使用して、100マイクロリットルの溶融アガロースをきれいなスライドの中央に置きます。すぐに溶融アガロースの上に別のきれいなガラススライドを置き、パッドを作るために穏やかに押し下げます。アガロースを固め、その後、トップスライドを削除します。アガロースパッドは使用する準備ができています。THYプレートを摂氏37度に予め温めます。生存アッセイで以前に行われたように、レンサ球菌株でプレートをシードします。コントロールとしてE-大腸菌OP-50と種子3 NGMプレートと一晩摂氏37度でインキュベート。翌日、プレートを室温まで冷やします。M9Wバッファーを使用して、NGMまたはNGM RNAiの給餌プレートから15mlの円錐形チューブにL4幼虫を洗浄します。チューブを450回gで回転し、遠心分離機で1分間回転させます。上清をデカントし、各チューブにM9Wの10 mlを加えます。遠心工程をさらに3回繰り返します。M9Wの250マイクロリットルでワームを再中断し、ワームサスペンションの3つの5マイクロリットルの滴をきれいなペトリ皿の蓋に置きます。解剖顕微鏡の下で、マイクロリットル当たりのワーム数を推定する。ピペットを使用して、各THYレンサ球菌種とNGM大腸菌種のプレートに約100 L4幼虫を加えます。細菌の株ごとに3つのプレートを使用してください。25°Cで2〜3時間プレートをインキュベートします。その後、インキュベーターからプレートを取り出します。M9Wでそれらを洗浄し、15ml円錐管でワームを収集します。遠心工程で以前に行われたようにワームを3回洗います。吸引によってM9Wのほとんどを取除く。そして、麻酔のためのワームペレットに2ミリモルナトリウムアジ化ナトリウムまたは四量体塩酸塩を含むM9Wの500マイクロリットルを加える。室温で15分間、ワームペレットでチューブをインキュベートします。次いで、15マイクロリットルのウォーム懸濁液を調製したアゴローズパッドに落とす。蛍光顕微鏡で、フィッツィーフィルターとダッピーフィルターを利用したskn-1の局所化を可視化します。画像ワームは10倍と20倍の倍率で表示されます。3つのレベルの局所化に基づいてワームを採点し、核局所化が観察されない低局所化、中局所化、SKN 1 BCGFPをワームの前部または後部に、そしてskn-1 BCGFPの核局所化がすべての腸細胞で観察される高い局地化を有する。この実験では、ミティスグループのメンバーは、S.ミュータン、S.サリバリウス、非病原性大腸菌OP-50とは対照的に、急速にワームを殺しました。カタラーゼをTHYアガーに補うと、ワームの殺滅は廃止された。ワームの死は、野生型および賛辞株と比較してデルタspxB突然変異株では観察されなかった。これらのデータは、ミティスグループによって産生された過酸化水素がワームの殺滅を仲介することを示唆している。skn-1ノックダウンワームの生存率の有意な減少は、治療されたワームのベクター制御と比較して観察された。同様の殺死表現型は、skn-1変異株およびN2野生型ワームで観察された。これは、skn-1がミティスグループのワームの生存に影響を与えることを示しています。skn-1 BCGFPの局地化は、野生型N-補間株にさらされたワームで観察され、SコルドナエのデルタspxB突然変異株に応答しなかった。P38マップキナーゼ経路の成分を倒した後、skn-1 BCGFPおよびノックダウン処理されたワームの局所化を減少させ、治療されたワームのベクター制御に対して、観察された。レンサ球菌cを用いた。エレガンス系は、過酸化水素が小胞性ストレスに及ぼす影響、ミトコンドリア損傷、ミトポホギ、およびトフォギーをさらに検討することができる。さらに、過酸化水素が細胞のコアプロセスを破壊することによって免疫応答を引き出すビリエンス因子として作用するメカニズムを同定することができる。

studying-oxidative-stress-caused-mitis-group-streptococci

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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宿主-病原体相互作用研究のための Streptococcus mitis 培養の調製

出典:Naji, A., 他カエノラブディティス・エレガンスにおけるミティス群連鎖球菌による酸化ストレスの研究。J. Vis. Exp.(2019年)このビデオでは、C. elegansにおける緑色蛍光色タンパク質標識SKN-1を用いて、緑色蛍光を追跡することで酸化ストレスを監視する方法を示しています。 S. gordonii に曝露されたミミズは強い核蛍光を示し、病原体誘発ストレスを裏付ける一方、大 腸菌...

GFPタグ付けSKN-1を用いた C. elegans における病原体誘発性酸化ストレスの可視化

の酸化ストレス抵抗を測定<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em&gt; 96ウェルのマイクロタイタープレート中

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線虫の大規模栽培のプレート ・ ベース: 糖尿病の代謝変化に関する研究のための試料作製

永続的な化学物質のトランスおよび多世代の影響は、環境と人間の健康に対する長期的な影響を判断する上で不可欠です。我々は、自由に生きている線虫カエノルハブ炎エレガンスを用いて、トランスおよび多世代の効果を研究するための新しい詳細な方法を提供する。...

毒性物質のトランスおよび多世代効果の研究のためのカエナルハブ炎エレガンスの使用

このプロトコルは、カエネラブディティスエレガンスの腸透過性を測定する方法を記述します。この方法は、腸内細菌とその宿主との相互作用に関連する腸の健康に関する基礎生物学的研究や、漏出性腸症候群および炎症性腸疾患を治癒するためのプロバイオティクスおよび化学薬品を同定するためのスクリーニングに役立ちます。...

ケネラブディティス・エレガンスの腸透過性に及ぼす細菌および化学物質の影響の測定

ここでは、線虫C.エレガンスにおける細胞タンパク質毒性ストレス応答を、蛍光転写レポーターの活性化を測定し、生理学的ストレスに対する感受性をアッテルすることによって特徴付ける。...

エレガンスにおける生理的ストレス応答の測定

微胞子虫寄生虫ネマトシダ・パリシイによるCaenorhabditis...

微胞子虫感染症の カエノラブディティス・エレガンス モデルにおける遺伝性免疫の研究

腸内微生物は、特定のまたは保存されたメカニズム を介して 宿主の健康にプラスまたはマイナスの影響を与える可能性があります。 カエノラブディティスエレガンスは 、そのような微生物をスクリーニングするための便利なプラットフォームです。本プロトコルは、線虫の健康状態の代理として使用される、線虫ストレス耐性への影響についての48の細菌分離株のハイスループットスクリーニングを記載している。...

カエノラブディティス・エレガンスの健康に影響を与える微生物分離物のハイスループットスクリーニング

学ぶ Caenorhabditis elegansを用いたMitis Group streptococciによる過酸化水素産生の病原性解明法。生物学的活性酸素種を活用し、宿主-病原体相互作用における酸化ストレス応答を評価する持続可能な実験系を確立します。

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