Derribo condicional combinado y ensayo de formación de esferas adaptadas para estudiar un gen asociado a la stemness de células madre de cáncer gástrico derivadas del paciente

Las células madre cancerosas están implicadas en la metástasis recidivante del cáncer en la resistencia a los medicamentos. Este protocolo proporciona un método eficaz para investigar las funciones de los genes clave en las células madre cancerosas. Utilizando un sistema de derribo condicional y un ensayo de formación de esferas adaptadas, este método se adapta fácilmente para estudiar las funciones in vitro e in vivo en genes asociados a la stemness en diferentes tipos de células madre cancerosas.

Demostrando el procedimiento, Yuting Li y Xiangyu Tan, asistentes de investigación de mi laboratorio. Para generar partículas de lentivirus, siembra cuatro millones de células de envasado lentiviral 293T en un plato Petri de 100 milímetros con 10 mililitros de DMEM complementados con 10%FBS. Incubar las células durante la noche a 37 grados celsius y 5%dióxido de carbono, asegurándose de que las células sean de 50 a 80% confluentes el día de la transfección.

Lleve un medio sérico reducido a temperatura ambiente y prepare los tubos A y B de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Añadir el contenido del tubo A al tubo B.Mix bien e incubar el tubo durante 15 minutos a temperatura ambiente para preparar complejos de lípidos-ADN. Retire cinco mililitros de medio del plato de cultivo celular.

Luego agregue cinco mililitros del complejo de lípidos-ADN en el plato de cultivo celular gota sabia y suavemente remolino el plato. Incubar el plato de cultivo durante 24 horas a 37 grados centígrados y 5% dióxido de carbono. Después de la incubación, retire cuidadosamente el medio de transfección y reemplácelo con 10 mililitros de DMEM precalentó complementados con 10%FBS.

Incubar las células durante otras 24 horas. Aproximadamente 48 horas después de la transfección, cosechar 10 mililitros de lentivirus que contienen sobrenadantes y filtrarlos con un filtro de vertido de 0,45 micrómetros para eliminar los desechos celulares. Todos los recipientes de cultivo celular, puntas, filtros y jeringas pueden contener lentivirus y deben tratarse con 10% de lejía antes de su eliminación.

Transfiera un sobrenadante clarificado a un recipiente estéril. Agregue el concentrador Lenti-X y mezcle con una inversión suave. Incubar la mezcla a cuatro grados centígrados durante la noche.

Al día siguiente, centrifugar la muestra a 1500 veces G durante 45 minutos a cuatro grados centígrados. Retire cuidadosamente el sobrenadante, teniendo cuidado de no molestar el pellet en la parte inferior. Re-suspender suavemente el pellet en un mililitro de DMEM complementado con 10%FBS y almacenarlo en menos 80 grados Celsius.

Semilla 6 millones de células madre de cáncer gástrico o GCSC en un plato petri de 100 milímetros con 10 mililitros de DMEM complementados con 10%FBS. Cultivo de las células durante 24 horas a 37 grados Celsius y 5% dióxido de carbono. Cuando las células alcanzan 70 a 80%confluencia, aspirar el medio del plato y añadir las partículas lentivirales concentradas diluidas con cuatro milímetros de medio DMEM completo, que contienen reactivo de polibreno.

Devuelva las células a la incubadora durante 18 horas. Polibreno debe ser probado en diferentes condiciones para determinar la concentración efectiva, que generalmente está en el rango de dos a 10 miligramos por mililitro. Después de 18 horas, reemplace el medio con 10 mililitros de DMEM con 10%FBS y devuelva las células a la incubadora durante 24 horas.

Luego, aspirar el sobrenadante con los desechos celulares y añadir DMEM fresco complementado con 10%FBS y 2.5 microgramos por mililitro de Puromicina. Incubar las células durante otras 24 horas. Entonces, cambiar el medio de nuevo a DMEM fresco complementado con 10%FBS y cinco microgramos por mililitro Puromicina.

Después de otra incubación de 24 horas, enjuague los GCSC adherentes dos veces con cinco mililitros de DPBS sin calcio y magnesio. Disociar las células con un mililitro de solución de disociación celular precalentada e incubarlas durante dos a tres minutos a 37 grados centígrados. A continuación, agregue cinco mililitros de medio de cultivo completo GCSC precalentó fresco a la suspensión celular.

Dispensar tres mililitros de esta suspensión en un tubo centrífugo de 15 mililitros para criopreservación, y los otros tres mililitros en otro tubo para la inducción con doxiciclina. Centrifugar ambos tubos a 800 veces G durante cinco minutos. A continuación, aspirar el sobrenadante del tubo B y volver a suspender las células en un mililitro de medio de cultivo completo GCSC precalentado fresco.

Siembra un número adecuado de células en un nuevo plato petri de 100 milímetros con 10 mililitros de medio de cultivo completo GCSC precalentado fresco y 2,5 microgramos por mililitro de doxiciclina. Luego, incuba el plato durante 48 horas. Utilice un contador de celdas automatizado para determinar la densidad de una muestra de 10 microlitro de células.

A continuación, ajuste el volumen con un medio de cultivo completo GCSC precalegado para obtener una concentración de 20.000 células viables por mililitro. Dispensar 100 microlitros de la suspensión celular en cada pozo de una nueva placa de cultivo de 96 pozos de fijación ultra baja. Incubar las células a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono.

La formación de la esfera debe ocurrir dentro de tres a 10 días. Imagen de la formación de la esfera tumoral cada dos días. Las células madre del cáncer gástrico del adenocarcinoma gástrico humano primario se cultivaron en un medio de cultivo libre de suero.

Después de seis días, las células se expandieron desde el fenotipo similar a una célula hasta las esferas grandes. Para evaluar la función de clusterin en GCSC, se clonaron secuencias cortas de ARN de horquilla contra clusterin en el vector Tet-GV307-RFP-Puro. Las células transfectosas con el vector de expresión fueron tratadas con doxiciclina durante 48 horas.

Entonces, la expresión clusterin fue verificada por Western blot y cuantificada por densitometría. La presencia de doxiciclina y la reducción de clusterin en los GCSC inhibió la formación de esferas tumorales. Si bien no se observó inhibición de la formación de esferas tumorales en células transducidas con los controles de ARNH revueltos, lo que indica que la doxiciclina por sí sola no inhibió la formación de esferas tumorales.

Estos resultados sugieren que después del silenciamiento de clusterin, los GCSC crecen lentamente y no pueden formar esferas tumorales. Sobre la base de estos datos, clusterin desempeña un papel fundamental en la promoción de la actividad de auto-renovación de los GCSC, lo que indica que podría ser un objetivo prometedor de fármaco para suprimir las células madre cancerosas en pacientes con cáncer gástrico. Las esferas tumorales deben ser estructuras redondas sólidas en células individuales o agregadas, no deben considerarse esferas tumorales.

Sin embargo, es posible que algunas células madre cancerosas no formen estructuras típicas de la esfera tumoral. Este procedimiento se puede seguir con otros métodos para examinar las células madre cancerosas en busca de potencial renovable in vitro. Por ejemplo, se puede estudiar la expresión de marcadores relacionados con la stemness.

El protocolo se puede ampliar para estudiar las funciones de los genes críticos en las células madre cancerosas como el tallo en la supervivencia.