In Vitro Directed Evolution of a Restriction Endonuclease with More Stringent Specificity

00:05Introduction
00:49Split-and-Mix Synthesis of Mutagenic Primers
02:34Performing Compartmentalized In Vitro Transcription-translation Reaction
05:07Continued Processing of Libraries and Selection
07:20Results: Examples of Screening of NlaIV Variants for Sequence Specificity Alteration
08:16Conclusion

Summary

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Le endonucleasi di restrizione con nuova specificità della sequenza possono essere sviluppate da enzimi che riconoscono una sequenza parzialmente degenerata. Qui forniamo un protocollo dettagliato che abbiamo usato con successo per alterare la specificità della sequenza dell'enzima NlaIV. Gli ingredienti chiave del protocollo sono la compartimentazione in vitro della reazione di trascrizione/traduzione e la selezione di varianti con nuove specificità di sequenza.

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