Axonal Transport van Organellen in Motor Neuron Culturen met behulp van Microfluidic Chambers System

Axonaal transport is van vitaal belang voor de gezondheid en levensvatbaarheid van neuronale. Ons protocol beschrijft een elegante methode voor het monitoren en analyseren van axonaal transport. En kan worden aangepast voor verschillende neuronale ziekte modellen.

Het gebruik van microfluïde kamers maakt nauwkeurige ruimtelijke temporele controle mogelijk, wat cruciaal is voor het bestuderen van de axonale biologie. Axonale transportafwijkingen zijn betrokken bij verschillende neurodegeneratieve ziekten zoals ALS. Het microfluïde platform maakt het mogelijk om basismechanismen en testtherapieën te bestuderen om axonale transportdefecten te herstellen.

Het microfluidic chamber platform kan eenvoudig worden aangepast aan verschillende aspecten van axonale onderzoek, waaronder axonale groei en degeneratie van verschillende neurale subtypes. Deze methode is complex en meestal hands-on onderwezen. De visuele demonstratie zal de toegankelijkheid van deze procedure te verhogen voor elke wetenschapper die geïnteresseerd is in het bestuderen van axonaal vervoer.

Begin met het gieten van PDMS in primaire mallen. Gebruik lucht onder druk om vuil van het waferplatform te verwijderen, zodat de wafers er glad en helder uitzien voordat u verdergaat. Vul vervolgens een container met vloeibare stikstof en bereid een spuit van 10 milliliter voor met een naald van 23 meter.

Plaats in een chemische rookkap de wafer met plaat in een afsluitbare container en vul de spuit met twee milliliter vloeibare stikstof per wafer met plaat. Open een chloorprimethylsilane fles. Doorboor de rubberen dop met de spuit en injecteer de stikstof in de fles.

Zonder de naald eruit te trekken, draai je de fles ondersteboven en doe twee milliliter chlooretrimethylsilane voor elke wafer met plaat. Verdeel de chlorotrimethylsilane in de container, maar niet direct op de wafer met plaat. Sluit de container.

En het vijf minuten per wafer uitbroeden. Vervolgens wegen 47,05 gram PDMS basis in een 50 milliliter buis, en voeg PDMS uithardingsmiddel bij een verhouding van 16 tot 1 basis aan uithardingsmiddel voor een totaal van 50 gram. Meng de PDMS gedurende 10 minuten op een rotator met lage snelheid en giet deze vervolgens in elke wafer met plaat op de gewenste hoogte.

Plaats de platen gedurende twee uur in een vacuümdesiccator. Die zal verwijderen lucht gevangen in de PDMS, en vormen een duidelijke uniforme mal. Daarna de platen drie uur of 's nachts bij 70 Graden Celsius in een oven uitbroeden.

Om de microfluïde kamer of MFC te maken. Snijd en verwijder de PDMS mallen van de plaat met een scalpel, zorg ervoor dat de mallen niet te dwingen omdat ze kwetsbaar zijn. Volg de instructies in het tekstmanuscript om de kamers te slaan en te knippen, afhankelijk van de experimentele opstelling.

Voor ruggenmerg explant cultuur, punch twee zeven millimeter putten in de distale kant van een grote MFC, ervoor te zorgen dat ze overlappen met de kanaalranden. Aan de proximale kant, punch een zeven millimeter goed in het midden van het kanaal met minimale overlap, zodat er voldoende ruimte overblijft voor de explants. Punch twee extra een millimeter gaten in de twee randen van het proximale kanaal.

En snijd de PDMS in enkele kamers. Draai vervolgens de MFC naar boven, en gebruik een 20-meter naald te snijden op drie kleine explant grotten op de geponste zeven millimeter goed. Voor gescheiden motorneuron cultuur, punch vier zes millimeter putten, in de randen van de twee kanalen van een kleine MFC en snijd de PDMS in enkele kamers.

Om de MFC te steriliseren, verspreid 50 centimeter lange plakbandbanden op de bank. Druk vervolgens op beide gezichten van de kamer op de tape en trek het terug. Plaats de schone kamers in een nieuwe plaat en broed ze in analytische kwaliteit, van 70%ethanol gedurende 10 minuten op een orbitale shaker.

Gooi de ethanol en droog de kamers in een weefselkweekkap of in een oven op 70 graden Celsius. Plaats vervolgens de kamer in het midden van een weefsel cultuur rang glazen bodem sloot, en van toepassing kleine kracht op de randen om de PDMS te binden aan de schotel bodem. Incubeer de schotel gedurende 10 minuten bij 70 graden Celsius.

Druk vervolgens op de kamers om de hechting te versterken. Incubeer de schotel onder UV gedurende 10 minuten, ga dan over tot het coderen van de MFC. Voeg 1,5 nanogram per milliliter PLO toe aan beide compartimenten.

Ervoor zorgen dat de PLO door de kanalen loopt. Door het pipetten van de coatingmedia direct in de kanaalingang. Bestudeer het MFC onder een lichtmicroscoop, om te controleren op bubbels.

Als luchtbellen de microgroeven blokkeren, plaatst u de MFC gedurende twee minuten in een vacuümdesiccators. Verwijder overtollige lucht uit de MFC-kanalen. Dan uitbroeden het 's nachts met PLO.

Vervang de PLO door laminine en incubbateer het MFC voor een extra nacht. Vóór beplating, was de laminine met cultuurmedium. Ontleed een ICR E12.5 zwangere muis en scheid de embryo's van de vruchtzak.

Doe het embryo in HBSS Silicon dish. Verwijder het hoofd en de staart en draai het op zijn buik. Voorzichtig afpellen oppervlakkige huid van de embryo's terug, het blootstellen van het ruggenmerg.

Scheid het ruggenmerg van het lichaam van kop tot staart, met behulp van zachte pincet. Verwijder de hersenvliezen, verwijder vervolgens de rughoorns en snijd het ruggenmerg in een millimeter dikke dwarssecties. Gooi alle medium uit het proximale compartiment van het MFC.

Pak een enkel ruggenmerg explant met een pipet, in een totaal volume van vier microliters. En injecteer het zo dicht mogelijk bij de grot. Trek overtollige vloeistof uit de proximale goed via de laterale uitlaten.

Herhaal de vorige stap nog twee keer en zorg ervoor dat de explants zijn ingebed in het proximale kanaal. Voeg langzaam 150 microliter van SCEX medium, aan de proximale goed. Een dag na de beplating.

Verving het SCEX-medium in het proximale compartiment en voeg een rijk SCEX-medium toe aan het distale compartiment. Het handhaven van een volumegradiënt van ten minste 15 microliter per put tussen de distale en proximale putten. Na vier tot zes dagen moeten de axonen naar het distale compartiment oversteken en klaar zijn voor axonale transportbeeldvorming.

Om de mitochondriën en zure compartimenten te labelen, bereid je vers SCEX-medium met 100 nanomolar MitoTracker Deep Red FM en 100 nanomolar LysoTracker Red. En voeg het toe aan de microfluïde kamers. Broed ze 30 tot 60 minuten bij 37 graden Celsius.

Was dan drie keer met warm SCEX medium. Ga verder met live beeldvorming van axonaal vervoer. Het verwerven van een 100 time lapse beeldreeks met drie seconden intervallen.

Met een totaal van vijf minuten per film. Na zeven dagen in microfluïde kamers. Muis embryonale HB9 GFP ruggenmerg explants.

We zijn bevlekt met MitoTracker Deep Red en LysoTracker Red kleurstoffen. Om de mitochondriën en zure compartimenten te labelen. Axons in de distale groeven werden afgebeeld en Kymograph analyse werd gebruikt om de algemene bewegingsverdeling te bepalen.

Dit toonde een bias in de retrograde richting alleen in zure stadscompartimenten, maar niet in mitochondriaal vervoer. De deeltjesdichtheid werd ook gekwantificeerd, waardoor een hoger aantal mitochondriale deeltjes werd onthuld in vergelijking met zure compartimenten in de HB9 GFP-dwarslaesie axonen. Vervolgens werd een analyse van het transport van één deeltje uitgevoerd met behulp van semi-geautomatiseerde software, gevolgd door interne code.

Deze analyse toonde aan dat zure componenten en mitochondriën vergelijkbare deeltjessnelheden hebben. Maar alleen zure compartimenten vertonen een vooroordeel naar retrograde beweging. Het isoleren van het embryonale ruggenmerg kan in het begin moeilijk zijn.

Oefen deze procedure meerdere malen, zorg ervoor dat de juiste embryonale leeftijd en de juiste dissectie tools te gebruiken. Het gebruik van microfluïde kamers verandert de manier waarop we axonale biologie bestuderen. Het stelt ons in staat om gelokaliseerde axonale processen te visualiseren, waarvan we ooit verondersteld zijn om alleen in het cellichaam voor te komen.