Name: Farelerde Periosteal İskelet Kök Hücrelerinin CCL5 Kaynaklı Göçünün Gerçek Zamanlı Görüntülenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Keşfedin farelerde CCL5 kaynaklı periosteal iskelet kök hücrelerinin gerçek zamanlı göçünü intravital mikroskopi ile izleme yöntemini. Bu protokol doku rejenerasyonu ve hücre davranışları araştırmalarında kullanılabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma Teksas Kemik Hastalıkları Programı Ödülü, Caroline Wiess Hukuk Fonu Ödülü ve Ulusal Sağlık Enstitüleri NIAMS tarafından R01 AR072018, R21 AG064345, R01 CA221946 to D.P.  BCM Optik Görüntüleme ve Vital Mikroskopi Çekirdeği'ndeki M.E. Dickinson ve T.J. Vadakkan'a ve NIH (AI036211, CA125123 ve DK056338) fonlarıyla BCM İleri Teknoloji Çekirdeklerine teşekkür ederiz.
.

Tüm fareler patojen içermeyen koşullarda muhafaza edildi ve tüm prosedürler Baylor College of Medicine'ın Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı.
1. Fare hazırlığı
<ol><li>Cross Mx1-Cre17 ve Rosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato (Tom)18 fare (Jackson Laboratuvarı'ndan satın alındı) αSMA-GFP fareleri ile (burada Drs tarafından sağlanmıştır). Ivo Kalajzic ve Henry Kronenberg) Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+ (Mx1/Tomato/αSMA-GFP) muhabir fareleri üretmek için (Şekil 2A).</li>
	<li>Mx1-Cre indüksiyonu için, farelere 10 gün boyunca her gün 25 mg / kg pIpC enjekte edin.</li>
	<li>Vahşi tip C57BL/6 farelerden (WT-BMT)19'dan 1 x 106 bütün kemik iliği mononükleer hücrelerinin intravenöz naklinden 1 gün önce 9,5 Gy ile fareleri ışınlayın.</li>
	<li>6 ila 8 haftalık iyileşmeden sonra, fareleri aşağıda açıklanan periosteal hücre göç protokolünün in vivo görüntülemesine tabi edin. NOT: Mx1-Cre farelerinin ışınlanması ve WT-BMT, bir yaralanmaya yanıt verebilen endojen Mx1 etiketli hematopoetik hücreleri ortadan kaldırmak için gereklidir. Işınlama sonrası altı ila sekiz hafta, konağın hematopoetik hücre sayısı% <5'tedir ve böylece görüntülemeye hazırdır19.</li>
</ol>2. Fare tutma ve görüntüleme montajı
<ol><li>50 mL konik tüp ile bir fare kısıtlaması oluşturun (Şekil 1A).<ol>
<li>Sivri makas kullanarak konikin dibinden bir delik açın. Alt delikten konilerin üstüne kesin (kesilen taraf kısıtlamanın üst kısmı olacaktır).</li>
		<li>Önceki kesime paralel olarak yaklaşık 4-5 cm uzunluğunda ve kısıtlamanın üstünden yarıya kadar (~2 cm) bir kesim yapın. Konik bu bölümü çıkarın ve kenarları pürüzsüzleştirin gerekliydi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ayarlanabilir bir açı plakası, 0,5" optik direk ve 0,5" post, 0,1875" Hex (Şekil 1B ve Malzeme Masası) için dik açılı bir kelepçe kullanarak konik bir tüp görüntüleme montajı oluşturun.<ol>
<li>Açı plakasını 35° açıya ayarlayın. Açı plakasının sol tarafında, optik direği plakanın arkasından ikinci deliğe vidalayın.</li>
		<li>Ayarlanabilir plakanın sağ tarafına, yaylı 0,1875" Hex kilitlemeli 0,25" başparmak vidasını önden ikinci deliğe ve plakadaki son deliklere yerleştirin. Dik açılı kelepçe, konik fare kısıtlamasını yerinde sabitlemek için optik direkle birlikte kullanılacaktır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Ameliyat öncesi cerrahi prosedür
<ol><li>Fare anestezisi<ol>
<li>Ağrı yönetimi için, deri altından fareye ameliyattan 30-60 dakika önce sürekli salınımlı buprenorfin (1 mg / kg BW) enjekte edin.</li>
		<li>37.5 mg/mL ketamin, 1.9 mg/mL ksil ile 0.37 mg/mL asepromazin içeren kemirgen III CCM kombinasyonu (combo III) anestezi kullanarak fareleri uyuşturmak. Fareler için uygun dozaj, 1 kg vücut ağırlığı başına 0,75-1,50 mL'dir. Doz 30-45 dakika sürecektir.</li>
		<li>Fare uyuşturuldıktan sonra, göz dehidrasyonunu önlemek için steril bir pamuklu çubukla gözlere oftalmik merhem uygulayın.</li>
		<li>Uzun süreli görüntüleme için (>45 dk), uygun anestezi derinliğini korumak için anesteziyi tekrar uygulayarak aşağıdaki gibi uygulayabilirsiniz.<ol>
<li>Planlanan görüntüleme süresi boyunca anesteziyi korumak için yeterli miktarda kombo III ile 1 mL şırıngın hazırlayın (30 dakikalık ek sedasyon başına 0,75 mL/kg BW). Şırıngaya 12" tüplü 25 G kelebek iğne infüzyon seti takın ve anesteziyi boru ve iğneden geçirin.</li>
			<li>Kelebek iğnesini intraperitoneally yerleştirin, sonra iğneyi yerine bantleyin. NOT: Ek kombo III görüntüleme sırasında bu şekilde uygulanacaktır, böylece hayvanı hareket ettirmeye veya görüş düzlemini bozmaya gerek yoktur.</li>
		</ol>
</li>
		<li>İşlem boyunca 37°C'de tutulan bir ısıtma yastığı ile termal destek sağlayın. Uzun süreli görüntüleme için (>1 saat) ek sıvı desteği gerekecektir.  Ek sıvılar I.P.'ye görüntüleme sırasında ek Combo III veya deri altından 33 mL/kg salin (0.9 NaCl) sağlanabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fare kısıtlaması ve cerrahi bölgenin hazırlanması<ol>
<li>Başın üstünden mümkün olduğunca fazla saç çıkarmak için makas kullanın. Ameliyat bölgesinde kalan saçları çıkarmak için tıraş edilen bölgeye epilatör krem uygulayın.</li>
		<li>Farenin parmak sıkışmalarına yanıt vermeyerek tamamen uyuşturulmasını sağlayın. 15 dakika sonra, fare tam olarak uyuşturulmazsa, ikinci bir daha küçük kombo III dozu (<0.75 mL / kg BW) kullanın.</li>
		<li>Fareyi önce kısıtlama kuyruğuna yerleştirin, burnun konik kenarına hafifçe sarkacak şekilde yeterince geriye doğru kaydırarak yerleştirin.</li>
		<li>Tıbbi bant kullanarak ön pençeleri konik tüpün altına bantleyin.</li>
		<li>Konik tüpü fare ile 35° açıyla ayarlanmış ve dik açılı kelepçe kullanılarak sabit bir görüntüleme yuvasına yerleştirin (Şekil 1C).</li>
		<li>Fare görüntüleme yuvasında güvenli hale geldikten sonra, cerrahi bölgeyi betadin ovma ve% 70 izopropil alkolün alternatif önlükleriyle 3x temizleyin. Yine, hayvanın tamamen sakinleştirilerek uyuşturuldığını kontrol edin.</li>
		<li>Fareyi temiz bir emici ped için hareket ettirin ve büyük bir steril alan oluşturmak için farenin üzerine bir örtü yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Cerrahi prosedür
<ol><li>Açma kesiği<ol>
<li>İnce uçlu tokmaklar kullanarak, cildi hemen sağ kulağa medial alın. Mikrodiseksiyon makası ile, kümesler tarafından tutulan cildi kesin. NOT: Yukarıda açıklanan yöntem kullanılarak kesiğin başlatılması, işlemden sonra dikiş için daha uygun yuvarlak bir kesi oluşturur.</li>
		<li>sol kulağa doğru ilk kesiden başlayarak enine bir kesi yapın (<1 cm).  İlk kesiden başlayarak hayvanın burnuna doğru başka bir kesi yapın (sağ gözün yanından ~ 2-3 mm).</li>
		<li>Cildi periosteumdan ayıran bağ dokusunu nazikçe kesmek için önseçimleri ve makası kullanarak cildi periosteumdan ayırın.</li>
		<li>Steril bir pamuklu çubuk kullanarak, cilt kapağının üstüne biraz oftalmik merhem uygulayın.  Deri kapağını yavaşça alın ve sol gözün üzerine katlayın. Sagittal ve koronal dikişlerin kesişimi açıkça ortaya açılmalıdır (Şekil 1E). NOT: Oftalmik merhem cilt kapağını yerinde tutmak için kullanılır.</li>
		<li>Herhangi bir kan ve artık saç alanını temizlemek için açık yüzeyi steril PBS ile yıkayın. NOT: Gerekirse, kızardıktan sonra kalan tüyleri çıkarmak için ince uçlu tokalar kullanın, ancak periosteuma zarar vermemeye dikkat edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mikro çatlak<ol>
<li>Calvaria üzerinde mikro çatlaklar oluşturmak için, 29 G insülin şırıngasının pistonunun pistonunun çıkarılmasının ve şırınganın arka ucunun 300-400 uL işareti civarında kesilmesi. NOT: Bu adım, yaralanmayı üretirken diseksiyon kapsamı altında manevra yapmayı kolaylaştırır.</li>
		<li>Bir eğimin ucunu (bir ila iki iğne genişliği) koronal dikişten buruna doğru ve sagittal sütür sağ kısmına bir ila iki iğne genişliği yerleştirin (Şekil 1E).</li>
		<li>Şırıngarı saat yönünde hafifçe döndürün, sonra saat yönünün tersine birkaç kez döndürün. NOT: Genç farelerde, dairesel bir mikro çatlak oluşturmak için çok az miktarda aşağı doğru basınca ihtiyaç vardır. Kanamaya neden olacağı ve görüntülemeye müdahale edeceği için iğnenin beyne nüfuz etmesine izin vermemeye dikkat edin.</li>
		<li>Mikro çatlak ~0,4 mm'ye genişletmek için 27 G'lık bir iğne kullanın. Kemik parçaları mikro çatlakta kalırsa, bölgeyi PBS ile yıkayın. Kemik parçaları hala mikro çatlakta kalırsa, 29 G iğnesini kullanarak hafifçe dışarı çıkarabilirsiniz.</li>
		<li>Sagittal dikişin sol tarafında bir yaralanma oluşturmak için 4.2.1–4.2.4 adımlarını tekrarlayın. NOT: Bu noktada iki seçenek vardır: 1) derhal CCL5 tedavisine (bölüm 4.3) ve görüntülemeye (bölüm 5) geçin; veya 2) bölüm 6'daki ameliyat sonrası işlemleri takiben cerrahi bölgeyi kapatın. 24 saat sonra fareyi tekrar uyuşturun, cerrahi görüşü yeniden açın, yaralanmayı CCL5 (bölüm 4.3) ile tedavi edin ve intravital görüntüleme (bölüm 5) ve ameliyat sonrası bakım (bölüm 6) gerçekleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>CCL5 tedavisi<ol>
<li>RANTES (100 ng/mL) stoğundan, bodrum membran matrisi (Malzeme Masası) kullanarak 10 ng/mL'lik bir çözüm yapın. Matrisi sıvı halde tutmak için bu çözeltiyi buzda tutun.</li>
		<li>Her yaralanmayı 2-20 μL pipet kullanarak 2 μL CCL5 (10 ng/μL) ile tedavi edin (bu pipet ucu viskoz bir sıvı kullanırken daha etkili olan daha büyük bir çapa sahiptir). Matrisin katılaşmasına izin verin.</li>
		<li>Matris katılaştıktan sonra, dokunun susuz kalmamasını sağlamak için calvaria'yı deri kapağı ile hafifçe örtün. Görüntülemeden önce 1 saat kuluçkaya yatırın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. İntravital görüntüleme
<ol><li>Mikroskop ayarları<ol>
<li>Çoktoğraf lazeri açın (femtosaniye titanyum-safir lazer). Dalga boyunun 880 nm olarak ayarlanması ve kemiğin ikinci harmonik nesil (SHG) görüntüleme (440 nm) için gücü ayarlayın.</li>
		<li>GFP ve tdTomato ifade hücrelerinin çıkarılması için sırasıyla 488 nm ve 561 nm katı hal lazerlerini açın.</li>
		<li>İkinci harmonik üretim (405–455 nm algılama) ve GFP (505–550 nm algılama) sinyalleri için PMT (fotomultiplier tüp) dedektörlerini açın. Domates (590–620 nm algılama) sinyali için HyD 3 dedektörünü açın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Montaj<ol>
<li>Fareyi dürbüne taşımadan önce, farenin başının arkasına hafifçe basarak calvaria'nın görsel düzlemini kontrol edin. Düzlem düzlem değilse, fare kısıtlamasını yavaşça sola veya sağa döndürerek konumu ayarlayın. NOT: Bu, yeterli görüntü kalitesini sağlamak için kritik bir adımdır.</li>
		<li>Tüm kalvaria ve cilt kapağını örtmek ve dokunun kurumasını önlemek için suya (w/v) steril% 2 metilselüloz uygulayın.</li>
		<li>Fareyi XYZ eksenli motorlu mikroskop aşamasına yerleştirin (Şekil 1G). Epifluoresan ışığı kullanarak, fareyi 1) mikroskop ve 2) koronal ve sagittal dikişlerin kesişimi sahnenin ortalanmış referans noktası olacak şekilde hizalayın.</li>
		<li>Cam kapağı görüntüleme alanına yerleştirin ve hizalamayı iki kez kontrol edin (Şekil 1H).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hızlandırılmış görüntüleme<ol>
<li>Calvaria'yı taramak için düşük büyütme lensi (NA = 0,95 ile 25x su daldırma hedefi) kullanın. Sagittal ve koronal dikiş kesişiminin referans görüntüsünü alın.</li>
		<li>Hücrelerden gelen SHG ve floresan sinyallerini kullanarak, her yaralanma görüşünü bulun ve XYZ koordinatlarının yanı sıra sagittal ve koronal dikişlerden uzaklıkları kaydedin (Şekil 2B).</li>
		<li>Uzun süreli görüntüleme için koronal veya sagittal dikişlerde bir konum seçin. Görüntüleme sırasında referanstan bu alanın ayrıntılı bir Z yığını görüntüsünü alın. NOT: Dikişler bilinen bir P-SSC nişini temsil ettiği için, hücrelerin calvaria yaralanmasına yanıt olarak göç edeceği yer burasıdır.</li>
		<li>En az 1 saat boyunca her 1 dakikada bir görüntü kaydetmek için zaman atlamalı yazılım ayarlarını kullanın. Anlık görüntüler arasındaki süre içinde, geçerli görünüm alanını ilk görüş alanıyla karşılaştırın. Farklılarsa, görüş alanının hangi yönde ayarlanması gerektiğini belirlemek için Z yığını görüntüsünü kullanın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Ameliyat sonrası hayvan bakımı
<ol><li>Görüntülemeden sonra, metilselülozu çıkarmak için maruz kalan calvaria'yı steril PBS ile durulayın.</li>
	<li>Kesiği kapatmak için, cilt kapağını calvaria üzerine hafifçe yerleştirin. Artık oftalmik merhemleri çıkarmak ve kesi bölgesini kurutmak için steril pamuklu çubuklar kullanın.</li>
	<li>Bağlı bir C-1 ters kesme iğnesi ile monofilament naylon 5-0 boyutlu nonabsorbable dikişler kullanarak cerrahi bölgeyi kapatın. Kapalı kesiye üçlü antibiyotik merhem uygulamak için steril bir pamuklu çubuk kullanın. NOT: Yüksek kaliteli dikiş teknikleri ve minimum kanama ile yara izi azalır.</li>
	<li>Fareyi sıcak bir yüzeyde temiz bir kafese yerleştirin ve sternal reumbency elde edilene kadar her 15 dakikada bir kontrol edin.</li>
	<li>Ameliyat sonrası 72 saat sürekli salınımlı buprenorfin ikinci bir doz uygulamak.</li>
	<li>Dikişler çıkarılana kadar (~1 hafta) huddling davranışı, fırfırlı kürk ve/veya ambülasyon eksikliği için günlük olarak izleyin.</li>
</ol>

<ol><li>Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fracture+healing%3A+mechanisms+and+interventions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Fracture healing: mechanisms and interventions.</a> Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).</li>
<li>Murao, H., Yamamoto, K., Matsuda, S., Akiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periosteal+cells+are+a+major+source+of+soft+callus+in+bone+fracture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Periosteal cells are a major source of soft callus in bone fracture.</a> Journal of Bone and Mineral Metabolism. 31 (4), 390-398 (2013).</li>
<li>Colnot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+cell+fate+decisions+within+periosteum+and+bone+marrow+during+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Skeletal cell fate decisions within periosteum and bone marrow during bone regeneration.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 24 (2), 274-282 (2009).</li>
<li>Roberts, S. J., van Gastel, N., Carmeliet, G., Luyten, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncovering+the+periosteum+for+skeletal+regeneration%3A+the+stem+cell+that+lies+beneath%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Uncovering the periosteum for skeletal regeneration: the stem cell that lies beneath.</a> Bone. 70, 10-18 (2015).</li>
<li>Duchamp de Lageneste, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periosteum+contains+skeletal+stem+cells+with+high+bone+regenerative+potential+controlled+by+Periostin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Periosteum contains skeletal stem cells with high bone regenerative potential controlled by Periostin.</a> Nature Communications. 9 (1), 773(2018).</li>
<li>Olivos-Meza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pretreatment+of+periosteum+with+TGF-beta1+in+situ+enhances+the+quality+of+osteochondral+tissue+regenerated+from+transplanted+periosteal+grafts+in+adult+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Pretreatment of periosteum with TGF-beta1 in situ enhances the quality of osteochondral tissue regenerated from transplanted periosteal grafts in adult rabbits.</a> Osteoarthritis Cartilage. 18 (9), 1183-1191 (2010).</li>
<li>Debnath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+a+periosteal+stem+cell+mediating+intramembranous+bone+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Discovery of a periosteal stem cell mediating intramembranous bone formation.</a> Nature. 562 (7725), 133-139 (2018).</li>
<li>Ransom, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axin2-expressing+cells+execute+regeneration+after+skeletal+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Axin2-expressing cells execute regeneration after skeletal injury.</a> Scientific Reports. 6, 36524(2016).</li>
<li>Ouyang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prx1+and+3.2kb+Col1a1+promoters+target+distinct+bone+cell+populations+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Prx1 and 3.2kb Col1a1 promoters target distinct bone cell populations in transgenic mice.</a> Bone. 58, 136-145 (2013).</li>
<li>Wilk, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+Calvarial+Skeletal+Stem+Cells+Expressing+PRX1+Reside+Exclusively+in+the+Calvarial+Sutures+and+Are+Required+for+Bone+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Postnatal Calvarial Skeletal Stem Cells Expressing PRX1 Reside Exclusively in the Calvarial Sutures and Are Required for Bone Regeneration.</a> Stem Cell Reports. 8 (4), 933-946 (2017).</li>
<li>Ortinau, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Functionally+Distinct+Mx1%2BalphaSMA%2B+Periosteal+Skeletal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of Functionally Distinct Mx1+alphaSMA+ Periosteal Skeletal Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 25 (6), 784-796 (2019).</li>
<li>Deveza, L., Ortinau, L., Lei, K., Park, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+gene+expression+identifies+distinct+molecular+signatures+of+bone+marrow-+and+periosteal-skeletal+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of gene expression identifies distinct molecular signatures of bone marrow- and periosteal-skeletal stem/progenitor cells.</a> PLoS One. 13 (1), 0190909(2018).</li>
<li>Schindeler, A., McDonald, M. M., Bokko, P., Little, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+remodeling+during+fracture+repair%3A+The+cellular+picture%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Bone remodeling during fracture repair: The cellular picture.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 19 (5), 459-466 (2008).</li>
<li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gli1+identifies+osteogenic+progenitors+for+bone+formation+and+fracture+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Gli1 identifies osteogenic progenitors for bone formation and fracture repair.</a> Cell Stem Cell. 15 (2), 782-796 (2017).</li>
<li>Zhou, B. O., Yue, R., Murphy, M. M., Peyer, J. G., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptin-receptor-expressing+mesenchymal+stromal+cells+represent+the+main+source+of+bone+formed+by+adult+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Leptin-receptor-expressing mesenchymal stromal cells represent the main source of bone formed by adult bone marrow.</a> Cell Stem Cell. 15 (2), 154-168 (2014).</li>
<li>Grcevic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+fate+mapping+identifies+mesenchymal+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells.</a> Stem Cells. 30 (2), 187-196 (2012).</li>
<li>Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+gene+targeting+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Inducible gene targeting in mice.</a> Science. 269 (5229), 1427-1429 (1995).</li>
<li>Srinivas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre+reporter+strains+produced+by+targeted+insertion+of+EYFP+and+ECFP+into+the+ROSA26+locus%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus.</a> BMC Developmental Biology. 1, 4(2001).</li>
<li>Park, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+bone+marrow+MSCs+are+dynamic%2C+fate-restricted+participants+in+bone+maintenance+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Endogenous bone marrow MSCs are dynamic, fate-restricted participants in bone maintenance and regeneration.</a> Cell Stem Cell. 10 (3), 259-272 (2012).</li>
<li>Nitzsche, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+Review%3A+MSC+Adhesion+Cascade-Insights+into+Homing+and+Transendothelial+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise Review: MSC Adhesion Cascade-Insights into Homing and Transendothelial Migration.</a> Stem Cells. 35 (6), 1446-1460 (2017).</li>
<li>Adler, J., Pagakis, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+image+distortions+due+to+temperature-related+microscope+stage+drift%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Reducing image distortions due to temperature-related microscope stage drift.</a> Journal of Microscopy. 210, Pt 2 131-137 (2003).</li>
<li>Roberts, S. J., Ke, H. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anabolic+Strategies+to+Augment+Bone+Fracture+Healing%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Osteoporosis+Reports%22%5BJournal%5D)">Anabolic Strategies to Augment Bone Fracture Healing.</a> Current Osteoporosis Reports. 16 (3), 289-298 (2018).</li>
</ol>

L.C.O. ve D.P., "Kemik Onarımında Periosteal İskelet Kök Hücreleri" (BAYM) başlıklı bekleyen bir patenti açıkladılar. P0264US. P1). Geri kalan yazarlar rakip çıkar beyan etmemektedir.

Kemik iyileşmesi sırasında periosteal hücreler, bir yaralanma callusu içinde yeni farklılaşmış kondrositlerin ve osteoblastların ana kaynağıdır3. Kemik iliğine benzer şekilde periosteum4,5,6'da osteojenik/kondrojenik SSC'ler de tanımlanmıştır. Endojen P-SSC fonksiyonel özelliklerini değerlendirmek teknik olarak zordur. Genellikle, SSC'lerin göçmen dinamikleri in vitro olarak değerlendirilir ve karşılık ge...

Kırık onarımı embriyonik iskelet gelişimi ve tadilattan farklı dinamik, çok hücreli bir süreçtir. Bu süreçte, hasarlı dokudan gelen yaralanma sinyallerinin indüksiyonunu, kırıkların genel stabilitesi ve sabitlenmesi için kritik öneme sahip olan iskelet sapı/progenitör hücrelerinin hızlı bir şekilde işe alınması, çoğalması ve daha sonra farklılaşması takip eder1. Özellikle, kırık iyileşmesinin erken aşamaları, esas olarak periosteal yerleşik hücrelere atfedilen yumuşak nasır oluşumunu gerektirir2. Kemikler yaralandığında, periosteal hücrelerin bir alt kümesi hızla yanıt verir ve callus3 içindeki yeni farklılaşan kıkırdak aralarına ve osteoblastlara katkıda bulunur ve periosteum içinde belirgin bir iskelet sapı / progenitör hücre popülasyonunun varlığını bu işe bular. Bu nedenle periosteumda yerleşik iskelet kök hücrelerinin (SSC) tanımlanması ve fonksiyonel karakterizasyonu dejeneratif kemik hastalıkları ve kemik defektleri için umut verici bir terapötik yaklaşım oluşturmaktadır4.
SSC'lerin kemik iliği de dahil olmak üzere birden fazla doku bölgesinde bulunduğu düşünülmektedir. Kemik iliğine benzer şekilde periosteum4,5,6'da osteojenik/kondrojenik SSC'ler de tanımlanmıştır.  Bu periosteal SSC'ler (P-SSC'ler) fetal kemik gelişimi sırasında erken mezenkimal soy belirteçleri (örneğin Prx1-Cre5, Ctsk-Cre7 ve Axin2-CreER8) ile etiketlenebilir4,7,8,9,10. Bu tek genetik soy izleme modellerinin önemli bir sınırlaması, etiketli hücre popülasyonlarında önemli bir heterojenlik olmasıdır. Ayrıca, etiketli SSC'leri progeny in vivo'larından ayırt edemezler. Bu sınırlamayı gidermek için, yakın zamanda kemik iliği SSC'lerinden (BM-SSC'ler)11'den P-SSC'leri belirgin bir şekilde görselleştirmek için çift muhabir fare (Mx1-Cre +Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+) geliştirdik. Bu model ile P-SSC'lerin Mx1+αSMA+ çift etiketleme ile işaretlendiği, daha farklılaştırılmış Mx1+ hücrelerinin ise kemik iliği, endosteal ve periosteal yüzeyler ile kortikal ve trabeküler kemiklerde bulunduğu tespit edilmiştir11,12.
Çoklu sitokinler ve büyüme faktörlerinin kemik tadilatını ve onarımını düzenlediği bilinmektedir ve kritik segment kusurlarında iskelet onarımının arttırıcısı için test edilmiştir1,13. Bununla birlikte, kemik bölmesinin fiziksel bariyerinin bozulmasıyla ortaya çıkan yaralanma modellerinin hücresel karmaşıklığı nedeniyle, bu moleküllerin endojen P-SSC göçü ve iyileşme sırasında aktivasyon üzerindeki doğrudan etkileri belirsizdir. SSC'lerin fonksiyonel özellikleri ve göçmen dinamikleri genellikle diğer hücre popülasyonlarında göçü teşvik ettiği bilinen sitokinler veya büyüme faktörleri ile birlikte bir transwell veya scratch tahlil yapılarak in vitro olarak değerlendirilir. Bu nedenle, bu in vitro deneylerden elde edilen sonuçların ilgili in vivo sistemlerinde uygulanması için yorumlanması zordur. Şu anda, iskelet sapı / progenitör hücre göçünün in vivo değerlendirmesi tipik olarak gerçek zamanlı olarak gözlenmez; aksine, kırık sonrası sabit zaman noktalarında ölçülür5,7,14,15,16.
Bu yöntemin bir sınırlaması, geçişin tek hücre düzeyinde değerlendirilmemesidir; bunun yerine, hücre popülasyonlarındaki değişikliklerle ölçülür. Canlı hayvan intravital mikroskopislerindeki son gelişmeler ve ek muhabir farelerin üretimi nedeniyle, bireysel hücrelerin in vivo takibi artık mümkündür. Canlı hayvan intravital mikroskopisi kullanarak, Mx1/Tomato/αSMA-GFP farelerinde 24-48 saat yaralanma sonrası kemik hasarında P-SSC'lerin kalvaria dikiş nişinden kemik yaralanmasına belirgin göçünü gözlemledik.
CCL5/CCR5 yakın zamanda erken yaralanma yanıtı sırasında işe alım ve aktivasyon P-SSC'lerini etkileyen düzenleyici bir mekanizma olarak tanımlandı. İlginçtir ki, gerçek zamanlı olarak bir yaralanmaya yanıt olarak önemli bir P-SSC göçü tespit edilmemiştir. Bununla birlikte, CCL5 ile bir yaralanmanın tedavisi, gerçek zamanlı olarak yakalanabilen sağlam, yönlü olarak farklı bir P-SSC göçü üretir. Bu nedenle, bu protokolün amacı, CCL5 ile tedaviden sonra P-SSC'lerin in vivo geçişini gerçek zamanlı olarak kaydetmek için ayrıntılı bir metodoloji sağlamaktır.

<table><tbody><tr><td>&frac12; &rdquo; optik direk</td><td>ThorLabs</td><td>TR2</td><td>Görüntüleme montajı için</td></tr><tr><td>1 mL şırınga</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>27G iğne</td><td>BD PercisionGlide 305111</td><td></td><td></td></tr><tr><td>29G insülin şırıngası</td><td>McKesson</td><td>102-SN05C905P</td><td></td></tr><tr><td>50 mL konik tüp</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td>Fare kısıtlaması için</td></tr><tr><td>Ayarlanabilir açılı plaka</td><td>Renishaw</td><td>R-PCA-5023-50-20</td><td>Görüntüleme montajı için</td></tr><tr><td>Alkollü mendiller</td><td>Coviden</td><td>6818</td><td></td></tr><tr><td>betadin cerrahi önlük</td><td>Henry Schen</td><td>67618-151-16</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfin SR-LAB</td><td>ZooPharm</td><td></td><td>1mg/mL Sürekli Salım</td></tr><tr><td>Combo III</td><td>Personel veterinerinden elde edilen</td> N<td>/A</td><td>37.6 mg/mL Ketamin; 1.9 mg / mL Ksilazin; 0.37 mg / mL Asepronazin</td></tr><tr><td>Lamel</td><td>Fisher</td><td>12-545-87</td><td>24 x 40 premium superslip</td></tr><tr><td>İnce uç forcepts</td><td>FST</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>KetaVed</td><td>50989-161-06</td><td>100 mg / mL</td></tr><tr><td>Leica TCS SP8MP DM6000CFS</td><td>Leica Microsystems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>R & D Systems</td><td>344500101</td><td></td></tr><tr><td>Tıbbi bant</td><td>McKesson</td><td>100199</td><td>3" x 10 yds (7,6 cm x 9,1 m)</td></tr><tr><td>Metoselüloz</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>19560</td><td></td></tr><tr><td>Mikrodiseksiyon makası</td><td>FST</td><td>1456-12</td><td></td></tr><tr><td>Motorlu kademe</td><td>Anaheim otomasyonu</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>İğne tutucu</td><td>FST</td><td>12500-12</td><td></td></tr><tr><td>Emilemeyen sütürler</td><td>McKesson</td><td>S913BX</td><td>monofilament naylon 5-0 emilmeyen sütürler takılı C-1 ters kesme iğnesi</td></tr><tr><td>Oftalmik merhem</td><td>Rugby</td><td>0536-1086-91</td><td></td></tr><tr><td>RANTES</td><td>Biolegend</td><td>594202</td><td>10 & mikro; G/50 ve Mikro; L</td></tr><tr><td>&frac12 için dik açılı kelepçe; &rdquo; Gönderi, 3/16" Hex</td><td>ThorLabs</td><td>RA90</td><td>Görüntüleme montajı için</td></tr><tr><td>Yaylı 3/16" Altıgen kilitleme ve frak14; &rdquo; kelebek vida</td><td>ThorLabs</td><td>TS25H</td><td>Görüntüleme montajı için</td></tr><tr><td>Steril pamuklu çubuklar</td><td>Henry Schen</td><td>100-9249</td><td></td></tr><tr><td>Steril DPBS (1x)</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>Steril örtüler</td><td>McKessen</td><td>25-517</td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi eldivenler</td><td>McKessen</td><td>3158VA</td><td></td></tr><tr><td>Üçlü antibiyotik merhem</td><td>Taro Pharmaceuticals USA, Inc. </td><td>51672-2120-2</td><td></td></tr><tr><td>Vacutainer kan alma seti</td><td>BD</td><td>REF 367298</td><td>12 "tüplü 25G kelebek iğne infüzyon seti</td></tr></tbody></table>

farelerde periosteal İskelet kök hücrelerinin ccl5 kaynaklı göçünün gerçek zamanlı görüntülenmesi

Real-Time Imaging of CCL5-Induced Migration of Periosteal Skeletal Stem Cells in Mice

Periosteal iskelet kök hücreleri (P-SSC' ler) ömür boyu kemik bakımı ve onarımı için gereklidir, bu da onları kırık iyileşmesini artırmak için tedavilerin geliştirilmesi için ideal bir odak noktası haline getirir.  Periosteal hücreler, kırık iyileşmesi için yeni kondrositler ve osteoblastlar sağlamak için hızla bir yaralanmaya göç eder. Geleneksel olarak, bir sitokinin hücre göçünü teşvik etme etkinliği sadece transwell veya scratch tahlil yapılarak in vitro olarak gerçeklenmiştir. Multifotoni ekscitasyonu kullanılarak intravital mikroskopideki gelişmelerle, yakın zamanda 1) P-SSC'lerin göçmen geni CCR5 ve 2) CCL5 olarak bilinen CCR5 ligand ile tedavinin kırık iyileşmesini ve CCL5'e yanıt olarak P-SSC'lerin göçini iyileştirdiği keşfedilmiştir. Bu sonuçlar gerçek zamanlı olarak yakalandı. Burada açıklanan, CCL5 ile tedavi edildikten sonra kalvarial dikiş iskelet kök hücresi (SSC) nişinden yaralanmaya doğru P-SSC geçişini görselleştirmek için bir protokoldür. Protokol, bir fare kısıtlaması ve görüntüleme montajının yapımını, fare kalvarisinin cerrahi olarak hazırlanmasını, bir calvaria kusurunun indüksiyonunu ve zaman atlamalı görüntülemenin kazanılmasını detaylandırıyor.

İskelet atalarının göçmen veya dolaşım potansiyeline sahip olduğu önerilmiştir20. Son zamanlarda, Mx1-Cre +Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+ (Mx1/Tomato/αSMA-GFP) muhabir fareleri üretildi ve P-SSC'ler Mx1+α SMA+ çift etiketleme ile işaretlendi (Şekil 2A,B). Mx1+α SMA+ P-SSC'lerin önemli göçü 24-48 saat y...

Bu protokol, canlı hayvan intravital mikroskopisi kullanılarak CCL5 aracılı periosteal iskelet kök hücre göçünün gerçek zamanlı olarak saptanmasıdır.

Farelerde Periosteal İskelet Kök Hücrelerinin CCL5 Kaynaklı Göçünün Gerçek Zamanlı Görüntülenmesi

Periosteal skeletal stem cells (P-SSCs) are essential for lifelong bone maintenance and repair, making them an ideal focus for the development of ...

Standartlaştırılmış protokol, endojen hücre göçünü değerlendirmek için kullanılabilir ve iskelet fenotiplerinin yanı sıra çeşitli hücre tiplerine de uygulanabilir. Bu tekniğin avantajı, yaralanma ve/veya sitokin tedavisine yanıt olarak bir hücre popülasyonu yerine tek tek hücreler için in vivo hücre göçünün izlenmesine izin vermesidir. Prosedüre başlamadan önce, anestezi uygulanmış farede ayak parmağının sıkışmasına yanıt verilmediğini onaylayın ve hayvanın gözlerine merhem sürün.Daha sonra, hemen medialden sağ kulağa sol kulağa doğru enine, bir santimetreden daha az bir kesi yapın ve ilk kesiden, sağ gözün yanından buruna doğru yaklaşık iki ila üç milimetre arasında ikinci bir kesi yapın. Cildi periosteumdan ayırmak için forseps kullanın ve cildi kalvaria periosteumasından ayırmak için bağ dokusunu nazikçe kesmek için makas kullanın. Steril bir pamuklu çubuk kullanarak, cilt flebinin üst kısmına oftalmik merhem sürün ve flebi sol gözün üzerine nazikçe katlayın.Sagital ve koronal sütürlerin kesişimi açıkça ortaya çıkarılmalıdır. Kan ve kalıntı kıl alanını temizlemek için açık yüzeyi steril PBS ile yıkayın ve bir eğimin ucunu koronal sütürden buruna doğru bir ila iki iğne genişliği

real-time-imaging-ccl5-induced-migration-periosteal-skeletal-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Burada, fare Kapkaççı lökosit homing çalışmada non-invaziv bir iki foton (2P) mikroskopi yaklaşımı açıklar. Biz, bizim doku görüntüleme hazırlık teknik yönlerini tartışmak ve yürütme ve veri toplama için kurulmuş ilk tipik bir deney yoluyla okuyucu yürümek.

Lökosit Homing Göç ve non-invaziv Görüntüleme In vivo</em

In vivo biyolüminesans ve manyetik rezonans görüntüleme (i) ve (ii) post mortem histolojik analiz: Bu makale ile kemirgen beyinde hücresel greft multimodal görüntüleme için optimize edilmiş olaylar dizisi anlatılmaktadır. Tek bir hayvan bu görüntüleme yöntemleri birleştirerek, yüksek çözünürlüklü, duyarlılık ve özgüllük ile hücresel greft değerlendirilmesine olanak tanımaktadır.

Fareler ve Merkezi Sinir Sisteminde Kök Hücre İmplantasyonu Multimodal Görüntüleme

Fare M. Cremaster'ın mikro intravital mikroskopi eşsiz ve çevresel kemik iliği kök hücre göçü analizi için in vivo model yanı sıra standart sunmaktadır.

Periferik Kök Hücre Göç Analizi Fare Cremaster Muscle Mikrosirkülasyon Intravital Mikroskopi

Kırık iyileşmesi kemik progenitör fonksiyonunun kantitatif ölçümü yüksek çözünürlüklü seri görüntüleme teknolojisini gerektirir. Burada, protokoller görseli sırayla ve kemik kırığı tamir sürecinde endojen osteojenik kök / progenitör hücrelerin hareketi, çoğalması ve farklılaşması ölçmek için intravital mikroskopisi ve osteo-dizi izleme kullanarak verilmiştir.

Ardışık<em&gt; In vivo</em&gt; Kırık Onarım sırasında Osteojenik Kök / Progenitör Hücrelerinin Görüntüleme

Hematopoetik kök hücrelerin işaretleme Kombinatoryel 5 floresan proteinleri rejenerasyon sırasında kemik iliği hematopoetik mimarisi içine anlayışlar, confocal ve iki foton mikroskopi ile in vivo klonal izleme sağlar. Bu yöntem nakli aşağıdaki kapsamlı bir süre için sağlam dokularda spektral kodlu HSPCs kökenli hücrelerin non-invaziv kader haritalama sağlar.

Eşodaklı ve multiphoton Mikroskopi kullanarak beş Floresan Proteinleri ile işaretlenmiş Hematopoetik kök hücrelerin in vivo klonal Takip

Hematopoietik kök ve projenitör hücreler (HSPCs) ve kemik iliği niş arasındaki etkileşimin doğası tam olarak anlaşılamamıştır. Özel donanım modifikasyonları ve çok adımlı bir satın alma protokolü ex vivo görüntünün kemik iliği alanları içinde bağlantılı etiketli HSPCs, izleme etkileşimleri ve hareket için iki-foton ve konfokal mikroskopi kullanımına izin verir.

Yetişkin Fare Kalvaryal Kemik İliği içinde Hematopoietik kök hücrelerin Vivo 4-Boyutlu Takip

Monositler, doğuştan gelen bağışıklığın anahtar düzenleyicileridir ve periferik mononükleer fagositik sistemin yenilenmesinde ve iltihaplanma durumunda kritik bir rol oynarlar. Bu el yazması, monosit mobilizasyon mekanizmasını incelemek için fare kalvaria kemik iliğinin gerçek zamanlı görüntüleme prosedürünü açıklamaktadır.

Fare Kemik İliği monositlerin Takip<em&gt; İn Vivo</em

Otolog ve allojenik kemik greft implantasyonu önemli kraniofasial kemik kaybını tedavi yaklaşımları kabul teşkil. Oysa neovaskülarizasyon, hücre farklılaşması ve kemik oluşumu arasındaki etkileşime greft bileşiminin etkisi belirsizdir. Biz greft yakınlık anjiyogenez-osteogenesis bağımlılığın aydınlatmak için amaçlandığı multimodal görüntüleme protokol mevcut.

Bilgisayarlı Tomografi ve Osteogenezi-anjiyogenez bağlamalar Optik Görüntüleme Kranial Kemik Otogreftlerin ve allogreft Entegrasyon değerlendirmek için

Bu iletişim kuralı tarafından far-red floresan intra artiküler (IA) enjeksiyon yoluyla bir sıçan diz osteoartrit (KOA) modelinde etiketleme hücre sebat ve biodistribution insan yağ elde edilen Mezenkimal kök hücrelerin (haMSCs) izlemek için etkili bir yöntem açıklanır.

Vivo İnsan yağ elde edilen Mezenkimal kök hücrelerin sıçan diz osteoartrit modelinde floresan lipofilik membran boya ile izleme

Bu çalışmada, Corti organını içeren koklear epitel ile eks vivo inkübasyon ile hasarlı dokuya doğru hareket eden hücreleri gözlemlemek için konfokal mikroskopi kullanarak gerçek zamanlı bir görüntüleme yöntemi sunuyoruz.

Corti Organına Doğru Hücre Göçünü Keşfetmek için Tüp Bebek Zaman Atlamalı Canlı Hücre Görüntüleme

Keşfedin farelerde CCL5 kaynaklı periosteal iskelet kök hücrelerinin gerçek zamanlı göçünü intravital mikroskopi ile izleme yöntemini. Bu protokol doku rejenerasyonu ve hücre davranışları araştırmalarında kullanılabilir.

Farelerde Periosteal İskelet Kök Hücrelerinin CCL5 Kaynaklı Göçünün Gerçek Zamanlı Görüntülenmesi

Daha fazla video keşfet