מודל מורין של חשיפה עוברית לדלקת אימהית כדי ללמוד את ההשפעות של Chorioamnionitis חריפה על התפתחות מעיים שזה עתה נולד

פרוטוקול FEMI זה מאפשר לחקור השפעות ארוכות טווח על יילודים בעקבות חשיפת העובר לדלקת אימהית. זה רלוונטי במיוחד להתפתחות של דלקת מעי נמקית, או NEC. טכניקה זו מחקה דלקת סטרילית הנראית לעתים קרובות בכוריואמניוניטיס, והיעדר חיידקים חיים יכול להיות בעל השפעות מבלבלות על מערכת העיכול המתפתחת ועל המיקרוביום.

השלב החשוב ביותר בפרוטוקול זה הוא הזרקת LPS כדי לגרום ל-FEMI. חשוב מאוד להשתמש במינון LPS מתאים ושההזרקה לא תגרום לטראומה תוך צפקית לעכבר הגרביד. התחל בדילול מלאי ה-LPS מ-1 ל-100 במי מלח סטריליים לריכוז עבודה של 20 מיקרוגרם למיליליטר.

להזריק סכרים בהריון ביום ההיריון E15. שקלו את העכברים מיד לפני ההזרקה כדי לקבוע את מינון ה-LPS המתאים, תוך שימוש בנפח שווה ערך של מי מלח רגילים עבור חיות ביקורת. מערבולת את תמיסת ה-LPS שלוש פעמים למשך 15 שניות בגובה.

ואז משוך אותו למזרק של מיליליטר. השתמש בטכניקת הקשקוש כדי לרסן את העכבר ההרה, והחזק אותו בתנוחת השכיבה הגבית. הכנס כרבע עד חצי ממט שיפוע של שמונה מילימטר בגודל 30 כלפי מעלה, מעל הרבע התחתון הימני של הבטן בזווית של 30 עד 40 מעלות.

משוך לאחור את בוכנת המזרק כדי להבטיח לחץ שלילי. לאחר מכן המשך בהזרקה אם קיים לחץ שלילי. עקבו אחר העכברים במשך כ-30 דקות, ולאחר מכן החזירו אותם לכלובים למשך שארית ההריון.

ללדת גורים באמצעות לידה נרתיקית ב-E20, ולאפשר להם להישאר עם האימהות, ולקבל הזנה אד-ליביטום. קצרו את המעיים ביום 14 לאחר הלידה. השתמש במספריים ובמלקחיים כדי לבצע חתך אנכי לאורך קו האמצע של הבטן, דרך העור והצפק, לכל אורך הבטן.

הוציאו את המעי הדק מהקיבה אל הצקום, והוציאו את המזנטריה. בודד את השליש הדיסטלי של המעי הדק, והשליך את המעי הדק הפרוקסימלי, הצקום והמעי הגס. מחלקים את חלק האילאום לשניים בעזרת מספריים.

לאחר מכן הנח את החצי הפרוקסימלי בתמיסת ייצוב RNA לכימות RNA ואת החצי הדיסטלי בפורמלין ניטרלי של 10% להכנת שקופיות. חתכו רקמה משובצת בפרפין לפרוסות בעובי חמישה מיקרומטר, והרכיבו אותן על שקופיות זכוכית. הסר את השקופיות, ואז הכתים קטעים בהמטוקסילין ואאוזין על פי נהלים סטנדרטיים.

השתמש במיקרוסקופ אור כדי להעריך פגיעה כללית במעי על ידי שני חוקרים עיוורים נפרדים בסולם של שלוש נקודות, להעריך את שלמות הווילוס וההפרדה מקרום הבסיס. הקצה ציון אפס לתיאור רירית תקינה. הקצה ציון של 1 לתיאור פציעה קלה, הכוללת התפתחות של מרחב גרונהגן תת-אפיתליאלי, ואקואוליזציה או הרמה תת-אפיתלית המוגבלת ללמינה פרופריה או לקצות הווילי.

הקצה ציון של 2 לתיאור פציעה חמורה, המסומנת על ידי הרמת אפיתל ווואקאוליזציה של יותר ממחצית הווילי, עיוות וילי או כיב רירי והתפוררות של הלמינה פרופריה. טבלו שקופיות בקסילן פעמיים למשך 10 דקות. לאחר מכן שטפו אותם עם 100% אתנול.

טבלו את השקופיות למשך שלוש דקות ב-100% אתנול, 90% אתנול, 70% אתנול ו-50% אתנול. לאחר מכן שטפו את המגלשות מתחת למים זורמים למשך חמש דקות, עם הפנים לחלק הרחק מהמים כדי למנוע אובדן דגימת רקמות. סנן תמיסת כתמים כחולים של Alcian עם פילטר קפה רגיל, והשתמש בו כדי להכתים את השקופיות למשך 15 דקות.

לאחר מכן שטפו אותם תחת מי ברז זורמים למשך שתי דקות. יש לדלל מיליגרם אחד של חומצה תקופתית ב -200 מיליליטר מים מזוקקים כפולים, ולטבול את השקופיות בתמיסה זו למשך חמש דקות. לאחר שטיפה של דקה מתחת למים זורמים, יש להכתים את השקופיות במגיב של שיף למשך 10 דקות, ולשטוף אותן שוב למשך חמש דקות.

לאחר מכן, יש להכתים אותם בהמטוקסילין למשך דקה אחת, ולשטוף במים למשך שתי דקות. טבלו אותם באלכוהול חומצי למשך דקה אחת, לאחר מכן במי הברז של סקוט למשך דקה אחת, ולאחר מכן שטיפה מתחת למי ברז זורמים למשך דקה. כדי לייבש את המגלשות, טבלו כל שקופית 10 פעמים ב-70% אתנול, 90% אתנול ולאחר מכן 100% אתנול.

טבלו את השקופיות ב-100% אתנול למשך 10 דקות, ולאחר מכן טבלו פעמיים בקסילן טרי למשך שלוש דקות בכל פעם. הניחו טיפה של אמצעי הרכבה על הדגימה וכיסוי מעל. ספרו תאי גביע מתחת למיקרוסקופ.

עבור כל פיסת רקמת מעי יש לספור את מספר תאי הגביע ו -500 תאי אפיתל. לאחר מכן מבטאים את תאי הגביע כיחס לכל 100 תאי אפיתל. ספור את תאי Paneth.

עבור כל פיסת רקמת מעיים, רשום את היחס בין תאי Paneth לקריפטה של המעי, וספירת 100 קריפטות מעיים עבור כל פיסת רקמת מעיים. חשיפת העובר לדלקת אימהית, או FEMI, ביום העוברי ה-15 מובילה לאובדן הריון תלוי מינון ולשיעור תלוי מינון של לידה מוקדמת. FEMI גורם לפגיעה משמעותית במעי בלידה ובשמונה שבועות לחיים.

פגיעה זו מתרחשת בהיעדר גירויים נוספים לבעלי החיים, מה שמרמז על כך ש-FEMI לבדו משבש את ההומאוסטזיס הרגיל של מערכת העיכול של העכברים שזה עתה נולדו. מספר תאי הגביע המייצרים מוצין ותאי Paneth המייצרים פפטידים אנטי-מיקרוביאליים בשליש הדיסטלי של מערכת העיכול הדק כומת. נמצא כי FEMI שיבש את ההרכב התקין של אפיתל המעי על ידי גרימת אובדן של שני סוגי התאים, בהשוואה לבעלי חיים ללא FEMI.

כדי לחקור את ההשפעות של FEMI על התגובה הדלקתית של היילודים, כומתו מגוון סמנים דלקתיים בסרום, כולל אינטרלוקין-1 בטא, אינטרלוקין-10, KCGRO ואינטרלוקין-6, מסרום של גורים עם ובלי FEMI. FEMI הגדיל משמעותית את מפל הדלקת עבור כל הציטוקינים ב-P0. מפל הדלקת בגילאים מאוחרים יותר השתנה בהתאם לנקודת הזמן ולציטוקין. מעניין לציין שהיו רמות דומות של IL6 ב-P7 עד P28 בקבוצות FEMI ו-smedia.

עם זאת, היו רמות גבוהות משמעותית בקבוצת ה-FEMI ב-P56, למרות שלא הייתה התערבות משנית. זה קריטי לבצע עקומת מינון LPS ראשונית, מכיוון שלמניות שונות של LPS יכולות להיות עוצמות שונות. מצאנו שתוצאות היילוד שלנו תלויות במינון ה-LPS המשמש לגרימת FEMI.