RNA 분석 및 대식세포 표현형에 적합한 인간 내장 지방 조직에서 생존 가능한 지방 세포 및 기질 혈관 분획 분리

이 프로토콜은 인간의 내장 지방에서 생존 가능한 지방 세포와 기질 혈관 분획 SVF 세포를 분리하고 연구할 수 있도록 합니다. 콜라겐분해효소를 사용한 효소 분해는 발현 분석에 적합한 microRNA를 포함하여 성숙한 지방세포로부터 total RNA의 높은 수율을 보장합니다. 동시에 이 방법은 유세포 분석으로 대식세포를 식별하도록 최적화되어 있습니다.

이 프로토콜은 단일 공정에서 인간 VAT 생검에서 생존 가능한 성숙한 지방 세포 및 SVF 세포를 쉽고 효율적으로 분리하기 위한 기본적인 문제 해결 지침을 제공합니다. 자궁 봉합과 지혈 후, 더 큰 망막을 확인하고 습식 압박으로 확장하십시오. 무혈관 영역을 식별하고 켈리 집게를 사용하여 내장 지방 조직(VAT)의 바깥쪽을 뚫습니다.

Ochsner 겸자를 사용하여 VAT가 뚫린 영역의 근위부와 원위부를 고정하고 Metzenbaum 가위를 사용하여 조직을 절단합니다. 큰 망막을 1번 검은색 실크로 묶은 다음 Ochsner 집게를 제거하고 지혈을 평가합니다. 효소 소화를 수행하려면 VAT 4g을 자르고 가위를 사용하여 해부 트레이에서 조직을 작은 조각으로 다집니다.

조각을 새 멸균 50ml 원심분리기 튜브에 옮기고 25ml의 소화 용액을 추가합니다. 섭씨 37도의 튜브를 125RPM의 오비탈 쉐이커에서 60분 동안 배양합니다. 그런 다음 소화된 조직을 세 겹의 거즈를 통해 새로운 멸균 50ml 원심분리기 튜브에 여과합니다.

튜브를 200G에서 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 두 단계가 보여야 합니다. 상부 단계는 성숙한 지방 세포에 해당하고 SVF 세포는 펠릿에 남아 있습니다.

성숙한 지방 세포를 튜브로 옮깁니다. 1000마이크로리터의 산-구아니디늄-페놀 기반 시약을 첨가하여 세포를 용해하고 P1000 마이크로피펫과 완전히 혼합하여 균질화합니다. 핵-단백질 복합체의 해리를 촉진하기 위해 실온에서 5분 동안 혼합물을 배양합니다.

12, 000 G에 5 분 동안 세포 용해물을 3개의 단계, adipocyte 지질에 대응하는 위 황색 단계, 핵산에 대응하는 중간 분홍색 단계 및 세포질 파편을 가진 펠릿을 얻기 위하여 원심 분리하십시오. P200 마이크로 피펫으로 지질층을 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 중간 단계를 새 2 밀리리터 튜브로 옮기고 다른 단계를 방해하지 않도록주의하십시오.

RNA를 정제하고 UV 가시광선 분광 광도계로 농도를 측정한 후 RNA 무결성 키트를 사용하여 RNA 무결성 수를 측정합니다. 그런 다음 small RNA kit를 사용하여 microRNA의 농도와 비율을 측정합니다. 클립을 바이오분석기에 넣습니다.

10마이크로리터의 SVF 세포 현탁액을 90마이크로리터의 0.4%트리판 블루 용액으로 희석하고 10마이크로리터를 표준 혈구계에 적용합니다. 죽은 세포를 제외한 생존 가능한 세포를 계수 챔버 모서리에 있는 4개의 사각형에서 주의 깊게 계수합니다. 유세포 분석을 위해 밀리리터당 총 100만 개의 SVF 세포를 5밀리리터의 둥근 바닥 폴리프로필렌 시험관으로 옮기고 섭씨 4도에서 5분 동안 800G에서 원심분리하여 세포를 펠릿

펠릿을 느슨하게 하고 100마이크로리터의 PBS에 세포를 다시 현탁시키기 위해 조심스럽게 와류를 치십시오. 세포 표면 항원에 특이적인 각 형광색소 접합 단일클론 항체의 사전 적정 최적 농도를 추가하고 부드럽게 혼합한 다음 어두운 곳에서 15분 동안 세포를 배양합니다. 차가운 PBS를 과도하게 추가하십시오.

그리고 SVF를 400G에서 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리합니다. 상등액을 디캔팅하고 펠릿을 방해하지 않도록 주의하십시오. 펠릿을 5ml의 칼집 유체에 재현탁시킵니다.

그런 다음 세 겹의 거즈를 통해 세포를 여과하여 새로운 5밀리리터 둥근 바닥 폴리프로필렌 시험관에 넣습니다. 분석 전에 각 튜브를 간단히 소용돌이치고 흐름 분석을 위해 최소 10, 000개의 이벤트를 계산합니다. 이 RNA 추출 프로토콜은 성숙한 지방 세포로부터 적절한 순도와 높은 무결성의 RNA 및 microRNA를 얻는 데 사용되었습니다.

RNA 무결성은 RNA 품질 관리 분석기에 의해 평가되었습니다. 6개의 핵세포에 대해 약 2.8 곱하기 10이 내장 지방 조직 1g당 존재했습니다. 기질 혈관 분획 세포는 형광 활성화 세포 분류 분석을 통해 18개의 대식세포를 식별하고 특성화하기 위해 형광단 접합 1차 항체로 표지되었습니다.

세포 응집체는 전방 산란 면적 대 전방 산란 높이를 표시하여 분석에서 제거되었습니다. 그런 다음 전방 산란 영역과 측면 산란 영역을 사용하여 올바른 크기와 복잡성에 따라 세포를 게이팅하여 세포 파편을 배제했습니다. 대식세포를 분석하기 위해 CD45 및 CD14 마커를 사용하여 단핵구 및 대식세포 계통 세포를 선택했습니다.

그 후, CD45-CD14 이중 양성 세포를 대식세포 마커 HLA-DR 발현에 따라 분리했습니다. 대식세포의 두 하위 집합이 확인되었습니다. 이 프로토콜은 새로운 세포 표현형을 식별하는 것 외에도 DNA 메틸화, 번역 후 변형 및 신호 경로와 같은 향후 분석을 위해 정제된 세포 집단을 사용할 수 있도록 합니다.