수면 의 아름다움 트랜스포슨 - 전염 인간 망막 안료 상피 세포에서 산화 스트레스의 유도 및 분석

과산화수소 모델은 노화 관련 황반 변성 또는 유사한 신경 퇴행성 질환을 치료하는 데 유용할 수 있는 인자의 항산화 효과를 평가하기 위한 간단하고 효과적인 접근 방식입니다. 산화제인 과산화수소는 단일 펄스로 전달되므로 과산화수소 처리를 며칠 동안 반복해야 하는 모델보다 더 빠르고 간단하게 수행할 수 있습니다. 파종된 세포의 수는 치료의 산화 효과에 영향을 미치기 때문에 배양 전에 세포를 주의 깊게 세는 것이 중요합니다.

이 절차를 시연하는 사람은 가브리엘 투만(Gabriele Thumann) 실험실의 박사 후 연구원인 타이스 바스쿠아스(Thais Bascuas)입니다. 컨디셔닝 배지 준비의 경우, PEDF, GM-CSF 또는 둘 다로 transfection한 후 28일 후에 완전 배지 농도의 밀리리터당 500,000개 세포에서 human ARPE-19 세포주 T-75 플라스크를 시딩합니다. 세포가 약 80% 포화도에 도달하면 상등액을 새로운 완전한 배지로 교체하고 24시간 후에 새로운 상등액을 수집합니다.

히스티딘 태그가 붙은 GM-CSF 및 PEDF 단백질을 정제하기 위해 상층액을 원심분리하여 잠재적인 잔여 세포를 제거하고 샘플을 따로 보관합니다. 다음으로, 30 밀리리터 튜브에 1.5 마이크로 리터의 니켈 NTA 용액을 추가합니다. 원심분리 후 니켈 NTA 플로우 스루를 버리고 세척당 200마이크로리터의 1X 배양 버퍼로 펠릿을 두 번 세척합니다.

두 번째 세척 후, 펠릿을 40마이크로리터의 4X 배양 완충액과 900마이크로리터의 원심분리된 컨디셔닝된 배지에 다시 현탁시킵니다. 컨디셔닝된 배지 용액을 실온에서 1시간 동안 분당 70회 회전하여 배양합니다. 배양이 끝나면 샘플을 원심분리하고 세척당 175마이크로리터의 1X 배양으로 펠릿을 두 번 세척합니다.

두 번째 세척 후 20마이크로리터의 용리 완충액을 추가하여 실온에서 분당 70회전으로 20분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 샘플을 원심분리합니다. 상층액을 따로 보관하고 표준 프로토콜에 따라 BCA 단백질 분석에 의해 용출된 총 단백질을 정량화합니다.

컨디셔닝 배지 및 과산화수소로 비형질 주입된 망막 색소 상피 세포를 처리하기 위해 세포 배양 인큐베이터에서 24시간 배양을 위해 200마이크로리터의 완전한 배지에 있는 3000개의 세포를 96웰 플레이트의 각 웰에 시딩합니다. 다음 날 아침, 상등액을 웰당 200마이크로리터의 컨디셔닝 배지로 교체하고 세포를 10일 동안 세포 배양 인큐베이터에 다시 넣습니다. 배양 11일째에 350마이크로몰의 과산화수소로 세포를 완전 배지에서 24시간 동안 처리합니다.

정제 또는 상용 PEDF 및/또는 GM-CSF로 transfection되지 않은 RPE 세포를 처리하기 위해, 세포 배양 인큐베이터에서 48시간 동안 배양하기 위해 재조합 PEDF의 밀리리터당 500나노그램 및/또는 웰당 GM-CSF로 재조합 밀리리터당 50나노그램이 보충된 완전한 배지의 200마이크로리터에 3000개의 세포를 시드합니다. 배양이 끝나면 상등액을 24시간 동안 350마이크로몰의 과산화수소와 PEDF 밀리리터당 500나노그램 및/또는 웰당 밀리리터당 50나노그램의 GM-CSF를 포함하는 완전한 배지로 교체합니다. 형질주입된 RPE 세포의 과산화수소 처리를 위해 세포 배양 인큐베이터에서 24시간 동안 웰당 200마이크로리터의 완전한 배지에 5, 000개의 형질주입된 세포를 배양한 후 350마이크로몰의 과산화수소로 세포를 처리합니다.

PEDF 및/또는 GM-CSF를 과발현하는 형질주입된 세포 또는 과산화수소 처리 후 성장 인자로 전처리된 형질주입되지 않은 세포에서 생성된 글루타치온 수치를 측정하기 위해, 각 웰의 상등액을 웰당 100마이크로리터의 새로 준비된 1X 시약 혼합물로 교체하고 안와 쉐이커에서 분당 500회전으로 14초 동안 세포를 시약 혼합물과 혼합합니다. 흔든 후 플레이트를 실온에서 30분 동안 배양한 후 각 웰에 100마이크로리터의 재구성된 루시페린 검출 시약을 추가합니다. 셰이커에서 용액을 15초 동안 혼합한 다음 실온에서 15분 동안 배양합니다.

배양이 끝나면 플레이트를 플레이트 리더에 로드하고 레이아웃 변경을 선택합니다. Basic Parameters 탭에서 96-well plate 및 Top optic을 선택하고 포지셔닝 지연을 0.1로, 측정 시작 시간을 0으로, 측정 간격 시간을 1로, 결과를 정규화하는 시간을 0으로 설정해야 합니다. 블랭크, 표준물질 및 샘플을 정의하고 Start measurement(측정 시작)를 클릭합니다.

그런 다음 데이터를 스프레드시트 파일로 내보내고 표준 곡선의 보간을 통해 각 샘플의 글루타치온 농도를 계산합니다. 세포 생존율을 측정하기 위해 각 웰의 상층액을 웰당 100%FBS가 보충된 100마이크로리터의 완전한 배지로 교체하고 분석이 진행될 때까지 세포를 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다. 배양물에서 처리되지 않은 ARPE-19 세포를 채취한 후, 1%FBS 농도가 보충된 DMEM Hams F-12 배지에서 밀리리터당 100, 000 세포로 세포를 다시 현탁시킵니다.

다음으로, 1% FBS가 보충된 200마이크로리터의 배지에 7개의 직렬 1:1 희석액을 준비하고, 각 표준물질 100마이크로리터를 96웰 플레이트의 적절한 웰에 복제하여 옮깁니다. 갓 준비한 시약 혼합물 50마이크로리터를 모든 웰에 추가하고 셰이커에서 15초 동안 혼합물과 세포를 혼합한 후 실온에서 15분 동안 플레이트를 배양합니다. 배양이 끝나면 설명된 대로 발광을 측정합니다.

측정값을 얻은 후 실온에서 15분 동안 배양하기 위해 각 웰에 50마이크로리터의 용해 시약을 추가한 다음 발광을 다시 측정하고 공식을 사용하여 생존 가능한 세포의 백분율을 계산합니다.50 및 100마이크로몰의 과산화수소로 24시간 처리해도 세포 내 글루타티온 생산에 영향을 미치지 않는 반면, 세포를 350-500 또는 700마이크로몰의 과산화수소로 처리하면 글루타티온의 현저한 감소가 관찰됩니다. 농도. 형태학적으로 과산화수소 처리된 세포는 화합물의 농도가 증가함에 따라 덜 퍼지고 더 둥글게 나타납니다.

이러한 효과는 과산화수소로 처리된 PEDF 및 GM-CSF-형질주입 세포에서는 덜 두드러졌습니다. 세포 수가 과산화수소 매개 산화 스트레스에 영향을 미친다는 점에 유의하는 것이 중요합니다., 글루타티온의 수치는 5, 000 개의 세포로 파종된 우물에서 과산화수소 처리 후 통계적으로 현저하게 감소했습니다. PEDF 및/또는 GM-CSF를 발현하기 위해 처리되거나 형질주입된 세포는 산화 조건에서 처리되지 않은 대조 세포에 비해 훨씬 더 많은 글루타티온을 생성합니다.

또한, 과산화수소 투여 후 PEDF 및 GM-CSF 형질주입 세포에서 UCP2 유전자 발현 수준이 증가하지만, 이러한 증가는 통계적으로 유의하지 않습니다. 과산화수소에 노출된 GM-CSF 형질 주입 세포의 용해물에서 인산화된 AKT의 웨스턴 블롯 분석은 처리되지 않은 대조 세포에 비해 인산화가 약간 감소하는 것으로 나타나며, 이는 GM-CSF가 산화 스트레스 손상으로부터 세포를 보호할 수 있음을 나타냅니다. 세포를 올바른 밀도로 파종하고, 신선한 과산화수소 용액을 사용하고, 배지에 새로운 단백질을 추가하는 것이 중요합니다.

과산화수소 모델을 사용하여 성장 인자의 항산화 효과가 확증되면 산화 스트레스 관련 안구 질환 모델에서 인자를 테스트할 수 있습니다. 현재의 과산화수소 산화 스트레스 모델은 다양한 요인이 가질 수 있는 항산화 효과를 평가할 수 있게 해주며, 따라서 새로운 유전자 치료법의 개발을 지원합니다.