סריקת בלוק-פנים טורית מיקרוסקופ אלקטרונים (SBF-SEM) של דגימות רקמה ביולוגית

מיקרוסקופ אלקטרונים סריקת פרצוף בלוק סדרתי מספק תצוגה חסרת תקדים של מבנים אולטרה רקמות תלת מימדיים, והוא יכול לענות על שורה של שאלות בעבר בלתי אפשרי או קשה מאוד לרדוף. טכניקה זו מאפשרת ייצור מהיר וניתן לשחזור של ערכות נתונים תלת מימדיות עם טעינת רקמות מינימלית וממצאים. וחשוב מכך, זה מאפשר לכידה אוטומטית של אלפי תמונות מדי יום.

מיקרוסקופ אלקטרוני שידור סטנדרטי מספק מבנה אולטרה תאי מעולה. עם זאת, תמונות אלה חסרות הקשר תלת מימדי, וקשה לפרש אותן. מיקרוסקופ אלקטרונים סריקת פרצוף בלוק טורי מספק הקשר תלת מימדי זה, ומאפשר פרשנות של תהליכים מורכבים.

בעוד פרוטוקול זה הוא אמין לשחזור, צעדים מסוימים דורשים דיוק והם חשובים ביותר להצלחת מתודולוגיה זו. סרטון וידאו זה ידגים שלבים קריטיים אלה בפירוט. לאחר תיקון דגימות 0.1 נתרן טוחנת מאגר cacodylate, המכיל 2.5% glutaraldehyde, ושני סידן כלורי מילימולארי, דגימות צריך להיות חתוך בלוקים לא יותר משני מילימטרים קוביות, ושטף עם 0.1 חוצץ נתרן cacodylate טוחנת המכיל שני סידן כלורי מילימולארי.

לאחר מכן הרקמה מוכתמת ברצף באוסמיום פרוציאניד, תיוקרבוהידראזיד ואוסמיום טטרוקסיד. לאחר דגירה אוסמיום טטרוקסיד, לטפל ברקמה עם 1%aqueous אורניל אצטט בארבע מעלות צלזיוס לילה. למחרת בבוקר, להמיס 0.066 גרם של חנקת עופרת ב 10 מיליליטר של 0.03 פתרון חומצה אספרטית טוחנת, ולהשתמש אחד הידרוקסיד אשלגן נורמלי כדי להתאים את ה- pH של פתרון אספרטט להוביל של וולטון ל 5.5.

לאחר חימום הפתרון בתנור, לשטוף את הרקמה חמש פעמים במשך שלוש דקות לכל לשטוף בטמפרטורת החדר, מים מזוקקים כפול, לפני העברת הרקמה לתוך 60 מעלות צלזיוס חימם את פתרון אספרטט להוביל של וולטון במשך 30 דקות ב 60 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, לשטוף את הרקמה לייבש אותו בסדרה עולה, קר כקרח אצטון, ואחריו דגירה של 10 דקות אצטון טמפרטורת החדר. לאחר מכן הניחו את הרקמה ביחס של 1:3 של שרף מעורב קשה באצטון במשך ארבע שעות של הסתננות על פלטפורמה מסתובבת, ואחריו חדירה של שמונה שעות או לילה ביחס של 1:1 של שרף לפתרון אצטון על פלטפורמה מסתובבת, ואז, חדירה לילה ביחס 3:1 של שרף לאצטון על הפלטפורמה המסתובבת.

למחרת בבוקר, לחדור את הרקמה טרי 100% שף במשך ארבע עד שמונה שעות, לילה אחד, וחדירה אחת של ארבע שעות בטמפרטורת החדר על פלטפורמה מסתובבת. למחרת בבוקר, להשתמש במקל עץ לערבב כמות קטנה של שרף עם אבקה שחורה פחמן עד שרף רווי עם האבקה, אבל הוא עדיין נוזל ולא הופך מגורען. המגורים צריכים להידמות דיו עבה, ולהיות מסוגל לאט לטפטף ללא גושים גלויים למקם את דגימת הרקמה בתבנית גומי סיליקון, וללכוד תמונה לעיון מאוחר יותר של כיוון המדגם בתוך בלוק הרזים.

כאשר המדגם נמצא במקום, לכסות את הרקמה שרף רווי שחור פחמן בקצה עובש הסיליקון, עם התווית המציינת את פרטי הניסוי והרקמות בתבנית בקצה הנגדי של שרף. לאחר מכן, מניחים את התבנית לתוך תנור 65 מעלות צלזיוס בשיפוע במשך כשעה. כאשר השרף חדורים שחור פחמן יש נרפא מספיק, להסיר את התבנית מהתנור, ומתחיל עם באר ריקה, למלא את שארית התבנית עם השרף ברור, דואג כי התווית נשארת גלויה.

כאשר המדגם כבר מכוסה שרף ברור, מניחים את עובש הסיליקון בחזרה לתוך תנור 65 מעלות צלזיוס, לא על שיפוע, במשך 48 שעות, ולאחר מכן להסיר את התבנית. כדי להכין את הבלוק להדמיה, הנח את הדגימה המוטבעת על צ'אק מיקרוטום עם הקצה המ מחודד דבק כחמישה עד שישה מילימטרים מתוך הצ'אק. נעל את הדגימה במקום עם בורג סט, והנח את הדגימה תחת מנורת חום.

לאחר מספר דקות, הניחו את הצ'אק במחזיק מיקרוסקופ סטריאו, והשתמשו בסכין גילוח חדש בעל קצוות כפולים כדי ליצור חלקים דקים במקביל לפני הבלוק עד שהרקמה תהיה גלויה, שתהיה פחות רפלקטיבית וגרגרית בהשוואה לחלקי שרף נטולי רקמות. לאבטח סיכת דגימת אלומיניום במחזיק סיכת גיזום, ולעשות כמה עמוק, שריטות חוצה מול הסיכה כדי לספק שטח פנים גדול יותר עבור הדבק המשמש להחזיק את הדגימה במקום. מניחים את הדגימה תחת מנורת חום, ולדחוף את סכין הגילוח אחד עד שני מילימטרים ישר לתוך בלוק שף לפני ביצוע חתך שני, בניצב של עומק שווה לתוך הבלוק, כדי לקצץ את עודף שרסן מדגם הרקמה, כך הבלוק הוא כשלושה מילימטרים קוטר על ידי שניים עד שלושה מילימטרים בגובה.

לאחר זמירה ראשונית זו, לחמם את הבלוק מתחת למנורה חום שוב, ולהשתמש חדש, סכין גילוח פיפיות כדי לחתוך את החלק העליון של בלוק שף בערך מילימטר אחד מתחת לחלק גזוז בחתך אחד, חלק. מניחים את מחזיק סיכת החיתוך, המכיל את סיכת האלומיניום החתוכה, בכלי הקיבול סטריאומיקרוסקופ, ומחילים שכבה דקה של דבק ציאנואקרילאט על פני הסיכה כך שהוא מכסה לחלוטין את הסיכה מבלי ליצור מניסקוס גלוי. השתמש מלקחיים ללחוץ על חתיכת גזוז של בלוק רקמה על מרכז פני סיכת הדגימה במשך כמה שניות, ולאפשר את הדבק להגדיר במשך כמה דקות.

כאשר הדבק התייבש ביסודיות, לאתר את הרקמה על החלק המוגבה של בלוק שף, ולהשתמש סכין גילוח פיפיות כדי לקצץ את החלק המוגבה של היצרן המכיל את דגימת הרקמה לאזור לא יותר ממילימטר מרובע אחד. לאט ובזהירות, להסיר כמו עודפי שריף ככל האפשר, משאיר את הבלוק קצת יותר בממד אחד, ולהשתמש בקובץ מתכת סופי כדי זווית עודף שריף באזור מחוץ לחלק המוגבה המכיל את דגימת הרקמה כלפי מטה לכיוון קצה הסיכה. הסר חלקיקי שף ואבק מהמדגם המוכן לפני החלת מעיל דק של צבע כסף זהב sputtering על פני השטח בלוק המדגם כולו.

לאחר הציפוי, לקצץ כל צבע כסף עודף ממשטחי הפנים בלוק, ומניחים את הבלוק רכוב וקצוץ בקצה בולבוסי של צינור פיפטה העברה בהתאמה אישית עם התווית המתאימה המצורפת. באמצעות הדמיית SBF-SEM, זוהתה רשת של חבילות מיקרופיבריל נטולות אלסטין בתוך הקרנית של העכבר הבוגר. רשת זו מאורגנת בשכבות נפרדות, עם הסיבים הקשורים קשר הדוק עם keratocytes, אפילו שוכב בתוך invaginations רדוד על פני השטח keratocyte.

יישום פרוטוקול זה הוביל לגילוי אוכלוסייה לא ידועה בעבר של עצבי קרנית מרכזיים המתמזגים עם תאי אפיתל בסיסיים בגבול הסטרומה-אפיתל. הדמיית SBF-SEM של הקרנית המרכזית חושפת את נוכחותם של כלי דם לימביים, חבילות עצבים ותאים נלווים שניתן לחלק באופן ידני לשחזור תלת-ממדי. כמה מכשולים של הליך הדמיה זה כוללים שימוש זמן שכן פיקסל ארוך מדי, אשר יכול לגרום לתמונות הבאות להיות גלי ומעוות, הפרשות קטנות של אלקטרונים מפני הבלוק, המוביל לשינויים ניגודיות מהירה בקווים, שריטות סכין על פני הבלוק עקב הצטברות סכין או פסולת פגומה על קצה הסכין חפצים מקרן אלקטרונים מורחבת מתמקדים בפני הבלוק בזמן שהמדגם עדיין בתא ההדמיה, קיבעון רקמות לא תקין, המוביל להפרדת מבנים תאיים ורקמת חיבור, ודילוג תמונה כתוצאה מכמות גדולה של טעינה בתוך בלוק הרקמה או השרף.

בעת חיתוך בלוק הרקמה, חשוב להבין היטב היכן הרקמה נמצאת בתוך הבלוק, כדי לא לחתוך בטעות את כל אזורי המדגם החשובים. אם תמונות ברזולוציה גבוהה יותר של מבנים סלולריים ספציפיים או אינטראקציות רצויות, ההדמיה יכולה להיעצר, הבלוק הוסר מהמיקרוסקופ, וחלקים לחתוך על ultramicrotome שבו הם יכולים להיות מוצגים במיקרוסקופ אלקטרונים שידור סידורי בלוק פנים סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים מאפשר תצוגה ייחודית לחלוטין של רקמות ביולוגיות. באמצעות פרוטוקול זה, הצלחנו לרכוש במהירות ערכות נתונים איכותיות, ולהרחיב את מגוון הרקמות שאנו יכולים לחקור.