Name: 시험관 내 전사 및 분자 계산을 위한 DNA 테더드 RNA 폴리머라제 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: 학습하세요 DNA 테더드 T7 RNA 폴리머라제를 이용한 시험관 내 전사 조절 방법을. 인공 핵산 전사 인자를 활용한 이 기술은 유전자 회로 설계와 분자 컴퓨팅에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

L.Y.T.C 연구 기금 탐사 (NFRF-E), 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 위원회 (NSERC) 디스커버리 그랜트, 캐나다 최초의 연구 우수 기금 (CFREF)의 자금을 받는 디자인 이니셔티브에 의한 토론토 대학의 의학에서 관대 한 지원을 인정합니다.

<ol><li>Cherry, K. M., Qian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaling+up+molecular+pattern+recognition+with+DNA-based+winner-take-all+neural+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Scaling up molecular pattern recognition with DNA-based winner-take-all neural networks.</a> Nature. 559 (7714), 370-376 (2018).</li>
<li>Qian, L., Winfree, E., Bruck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+network+computation+with+DNA+strand+displacement+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neural network computation with DNA strand displacement cascades.</a> Nature. 475 (7356), 368-372 (2011).</li>
<li>Chen, Y. -J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+chemical+controllers+made+from+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Programmable chemical controllers made from DNA.</a> Nature Nanotechnology. 8 (10), 755-762 (2013).</li>
<li>di Bernardo, D., Marucci, L., Menolascina, F., Siciliano, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+synthetic+gene+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Synthetic+Gene+Networks%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Predicting synthetic gene networks.</a> Synthetic Gene Networks: Methods and Protocols. 813, 57-81 (2012).</li>
<li>Xiang, Y., Dalchau, N., Wang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaling+up+genetic+circuit+design+for+cellular+computing%3A+advances+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Natural+Computing%22%5BJournal%5D)">Scaling up genetic circuit design for cellular computing: advances and prospects.</a> Natural Computing. 17 (4), 833-853 (2018).</li>
<li>Gould, N., Hendy, O., Papamichail, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+tools+and+algorithms+for+designing+customized+synthetic+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Computational tools and algorithms for designing customized synthetic genes.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 2, (2014).</li>
<li>MacDonald, J. T., Siciliano, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+sequence+design+with+R2oDNA+Designer%5BTitle%5D)+AND+%22Mammalian+Synthetic+Promoters%22%5BJournal%5D)">Computational sequence design with R2oDNA Designer.</a> Mammalian Synthetic Promoters. 1651, 249-262 (2017).</li>
<li>Cervantes-Salido, V. M., Jaime, O., Brizuela, C. A., Martínez-Pérez, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+design+of+sequences+for+DNA+computing%3A+A+multiobjective+evolutionary+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Soft+Computing%22%5BJournal%5D)">Improving the design of sequences for DNA computing: A multiobjective evolutionary approach.</a> Applied Soft Computing. 13 (12), 4594-4607 (2013).</li>
<li>Zadeh, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NUPACK%3A+Analysis+and+design+of+nucleic+acid+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Chemistry%22%5BJournal%5D)">NUPACK: Analysis and design of nucleic acid systems.</a> Journal of Computational Chemistry. 32 (1), 170-173 (2011).</li>
<li>Fornace, M. E., Porubsky, N. J., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unified+dynamic+programming+framework+for+the+analysis+of+interacting+nucleic+acid+strands%3A+enhanced+models%2C+scalability%2C+and+speed%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">A unified dynamic programming framework for the analysis of interacting nucleic acid strands: enhanced models, scalability, and speed.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2665-2678 (2020).</li>
<li>Wetterstrand, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequencing+costs%3A+Data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome.gov%22%5BJournal%5D)">DNA sequencing costs: Data.</a> Genome.gov. , (2020).</li>
<li>Lopez, R., Wang, R., Seelig, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+multi-gene+classifier+for+disease+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A molecular multi-gene classifier for disease diagnostics.</a> Nature Chemistry. 10 (7), 746-754 (2018).</li>
<li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((low-cost+detection+of+Zika+virus+using+programmable+biomolecular+components%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components.</a> Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).</li>
<li>Yurke, B., Turberfield, A. J., Mills, A. P., Simmel, F. C., Neumann, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA-fuelled+molecular+machine+made+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A DNA-fuelled molecular machine made of DNA.</a> Nature. 406 (6796), 605-608 (2000).</li>
<li>Lin, K. N., Volkel, K., Tuck, J. M., Keung, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+and+scalable+DNA-based+information+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Dynamic and scalable DNA-based information storage.</a> Nature Communications. 11 (1), 2981(2020).</li>
<li>Yurke, B., Mills, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+DNA+to+power+nanostructures%5BTitle%5D)+AND+%22Genetic+Programming+and+Evolvable+Machines%22%5BJournal%5D)">Using DNA to power nanostructures.</a> Genetic Programming and Evolvable Machines. 4 (2), 111-122 (2003).</li>
<li>Zhang, D. Y., Turberfield, A. J., Yurke, B., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+entropy-driven+reactions+and+networks+catalyzed+by+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Engineering entropy-driven reactions and networks catalyzed by DNA.</a> Science. 318 (5853), 1121-1125 (2007).</li>
<li>Wang, B., Thachuk, C., Ellington, A. D., Winfree, E., Soloveichik, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+design+principles+for+leakless+strand+displacement+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Effective design principles for leakless strand displacement systems.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (52), 12182-12191 (2018).</li>
<li>Machinek, R. R. F., Ouldridge, T. E., Haley, N. E. C., Bath, J., Turberfield, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+energy+landscapes+for+kinetic+control+of+DNA+strand+displacement%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Programmable energy landscapes for kinetic control of DNA strand displacement.</a> Nature Communications. 5 (1), 5324(2014).</li>
<li>Cabello-Garcia, J., Bae, W., Stan, G. -B. V., Ouldridge, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Handhold-mediated+strand+displacement%3A+a+nucleic+acid-based+mechanism+for+generating+far-from-equilibrium+assemblies+through+templated+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Handhold-mediated strand displacement: a nucleic acid-based mechanism for generating far-from-equilibrium assemblies through templated reactions.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Brophy, J. A. N., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+genetic+circuit+design%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Principles of genetic circuit design.</a> Nature Methods. 11 (5), 508-520 (2014).</li>
<li>Khalil, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+biology+framework+for+programming+eukaryotic+transcription+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A synthetic biology framework for programming eukaryotic transcription functions.</a> Cell. 150 (3), 647-658 (2012).</li>
<li>Swank, Z., Laohakunakorn, N., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+gene-regulatory+network+engineering+with+synthetic+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cell-free gene-regulatory network engineering with synthetic transcription factors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (13), 5892-5901 (2019).</li>
<li>Howland, S. W., Tsuji, T., Gnjatic, S., Ritter, G., Old, L. J., Wittrup, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducing+efficient+cross-priming+using+antigen-coated+yeast+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Inducing efficient cross-priming using antigen-coated yeast particles.</a> Journal of immunotherapy. 31 (7), 607(2008).</li>
<li>Abil, Z., Ellefson, J. W., Gollihar, J. D., Watkins, E., Ellington, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalized+partnered+replication+for+the+directed+evolution+of+genetic+parts+and+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Compartmentalized partnered replication for the directed evolution of genetic parts and circuits.</a> Nature Protocols. 12 (12), 2493-2512 (2017).</li>
<li>Baugh, C., Grate, D., Wilson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2.8+%C3%85+crystal+structure+of+the+malachite+green+aptamer11%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">2.8 Å crystal structure of the malachite green aptamer11.</a> Journal of Molecular Biology. Doudna, J. A. 301 (1), 117-128 (2000).</li>
<li>Chou, L. Y. T., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+transcriptional+regulation+via+nucleic+acid-based+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">In vitro transcriptional regulation via nucleic acid-based transcription factors.</a> ACS Synthetic Biology. 8 (11), 2558-2565 (2019).</li>
<li>Lykke-Andersen, J., Christiansen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C-terminal+carboxy+group+of+T7+RNA+polymerase+ensures+efficient+magnesium+ion-dependent+catalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The C-terminal carboxy group of T7 RNA polymerase ensures efficient magnesium ion-dependent catalysis.</a> Nucleic Acids Research. 26 (24), 5630-5635 (1998).</li>
<li>Pu, J., Disare, M., Dickinson, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+C-terminal+modification+tolerance+in+full-length+and+split+T7+RNA+Polymerase+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Evolution of C-terminal modification tolerance in full-length and split T7 RNA Polymerase biosensors.</a> Chembiochem. 20 (12), 1547-1553 (2019).</li>
<li>Gardner, L. P., Mookhtiar, K. A., Coleman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation%2C+elongation%2C+and+processivity+of+carboxyl-terminal+mutants+of+T7+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Initiation, elongation, and processivity of carboxyl-terminal mutants of T7 RNA polymerase.</a> Biochemistry. 36 (10), 2908-2918 (1997).</li>
<li>Yin, J., Lin, A. J., Golan, D. E., Walsh, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+protein+labeling+by+Sfp+phosphopantetheinyl+transferase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Site-specific protein labeling by Sfp phosphopantetheinyl transferase.</a> Nature Protocols. 1 (1), 280-285 (2006).</li>
<li>Warden-Rothman, R., Caturegli, I., Popik, V., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sortase-tag+expressed+protein+ligation%3A+combining+protein+purification+and+site-specific+bioconjugation+into+a+single+step%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Sortase-tag expressed protein ligation: combining protein purification and site-specific bioconjugation into a single step.</a> Analytical Chemistry. 85 (22), 11090-11097 (2013).</li>
<li>Zhang, W. -B., Sun, F., Tirrell, D. A., Arnold, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+macromolecular+topology+with+genetically+encoded+SpyTag-SpyCatcher+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Controlling macromolecular topology with genetically encoded SpyTag-SpyCatcher chemistry.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (37), 13988-13997 (2013).</li>
</ol>

저자중 누구도 선언할 경쟁적인 재정적 이해관계는 없습니다.

이 연구는 N-말단 태그 재조합 T7 RNAP를 BG 기능화 올리고뉴클레오티드와 공동으로 결합하여 T7 RNA 폴리머라제의 활성을 제어하는 DNA 나노 기술에서 영감을 얻은 접근법을 시연하며, 이는 이후 TMDSD 반응을 프로그래밍하는 데 사용되었습니다. 설계에 의하면, SNAP 태그는 폴리머라제의 N-종착체에 위치하였으며, 야생형 T7 RNAP의 C-종점은 단백질 구조 코어 내에 묻혀 DNA템플릿(28)과중요한 접촉을 한다. 폴리머라제 C-종체를 수정하려는 사전 시도는 다른 보상 돌연변이가 도입되지 않는 한 효소 활성의 완전한 손실을 초래했다. 29,30 대조적으로, T7 RNAP의 N 단말 융합은 잘 용납되지만, 융합 태그의 선택은 중합체 활성에 영향을 미칠 수 있다. 다른 태그가 RNAP 활동에 미치는 영향은 체계적으로 결정되지 않았습니다. SNAP 태그는 효율적이고 견고하기 ...

DNA 컴퓨팅은 계산을 위한 매체로 디자인된 올리고뉴클레오티드 세트를 사용합니다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 사용자 지정 논리에 따라 동적으로 조립하고 특정 핵산 입력에 반응하기 위해 서열로 프로그래밍됩니다. 개념 증명 연구에서, 계산의 출력은 전형적으로 겔 전기전도 또는 형광 판 판독기를 통해 검출될 수 있는 형광표형 올리고뉴클레오티드 세트로 구성됩니다. 지난 30년 동안 다양한 디지털 로직 캐스케이드, 화학 반응 네트워크 및 신경망1,2,3과같이 점점 더 복잡해지는 DNA 전산 회로가 입증되었습니다. 이러한 DNA 회로의 제조를 지원하기 위해, 수학적 모델은 합성 유전자 회로4,5의기능을 예측하는 데 사용되었으며, 직교 DNA 서열 설계6,7,8,9,10을 위해 전산 도구가 개발되었습니다. . 실리콘 기반 컴퓨터에 비해 DNA 컴퓨터의 장점은 생체 분자와 직접 인터페이스하고 전원 공급 장치가없는 상태에서 솔루션에서 작동하는 능력뿐만 아니라 전반적인 컴팩트함과 안정성을 포함합니다. 차세대 시퀀싱이 등장하면서 지난 2년간 DNA 컴퓨터 합성 비용은 무어의 법칙11보다빠른 속도로 감소하고 있습니다. 이러한 DNA 기반 컴퓨터의 응용프로그램은 이제 질병진단(12,13),분자 생물물리학(14)에 전력을 공급하고, 데이터 저장플랫폼(15)과같은 출현하기 시작했다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62073/62073fig01.jpg"> 그림 1: 발가락 매개 DNA 가닥 변위의 메커니즘. δ 발가락은 부분 이중에 무료, 언바운드 시퀀스입니다. 두 번째 가닥에 보완 도메인(δ*)이 도입되면 자유 δ 도메인은 혼성화를 위한 발판 역할을 하므로 나머지 가닥(ɑ*)이 가닥 마이그레이션이라고 하는 지퍼/압축 해제 가역 반응을 통해 경쟁업체를 천천히 대체할 수 있습니다. δ 길이가 증가함에 따라 전방 반응용 ΔG가 감소하고 변위가 더 쉽게 발생합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62073/62073fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
현재까지 DNA 컴퓨터의 대다수는 발가락 매개 DNA 가닥 변위(TMDSD, 도 1)16으로알려진 동적 DNA 나노 기술 분야에서 잘 확립된 모티프를 활용한다. 이 모티프는 짧은 "발가락"오버행 (즉, 7- 10 뉴클레오티드 (nt)를 표시하는 부분적으로 이중 좌초 DNA (dsDNA) 이중으로 구성된다. 핵산 "입력" 가닥은 발가락을 통해 부분 이중과 상호 작용할 수 있다. 이것은 부분 이중에서 가닥 중 하나의 변위로 이어지며, 이 해방된 가닥은 다운스트림 부분 이중에 대한 입력역할을 할 수 있습니다. 따라서 TMDSD는 신호 계단식 및 정보 처리를 가능하게 합니다. 원칙적으로 직교 TMDSD 모티프는 솔루션에서 독립적으로 작동하여 병렬 정보 처리를 가능하게 합니다. TMDSD 반응에 대한 다양한 변형이 있었다, 발가락 매개 DNA 가닥 교환 (TMDSE)(17),이중 긴 영역을 가진 "누출없는"발가락 홀드(18),서열 불일치 발가락19,및 "손잡이"매개 가닥 변위(20)등이 있었다. 이러한 혁신적인 설계 원칙을 통해 DNA 컴퓨팅 성능을 개선하기 위해 TMDSD의 에너지와 역학을 보다 세밀하게 조정할 수 있습니다.
전사 유전자 회로와 같은 합성 유전자 회로도 계산21,22,23을계산할 수 있다. 이 회로는 특정 조절 DNA 요소에 결합하여 유전자의 전사를 활성화하거나 억압하는 단백질 전사 인자에 의해 조절됩니다. DNA 기반 회로에 비해 전사 회로는 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, 효소 전사는 기존 촉매 DNA 회로보다 훨씬 높은 회전율을 가지므로 입력의 단일 사본당 더 많은 출력 사본을 생성하고 보다 효율적인 신호 증폭 수단을 제공합니다. 또한, 전사 회로는 치료 단백질에 대한 aptamers 또는 메신저 RNA(mRNA) 인코딩과 같은 상이한 기능성 분자를 생성할 수 있으며, 이는 다른 용도에 대해 악용될 수 있는 계산 출력으로. 그러나, 현재 전사 회로의 주요 한계는 확장성의 그들의 부족입니다. 이는 직교 단백질 기반 전사 인자의 매우 제한된 세트가 있기 때문에 새로운 단백질 전사 인자의 de novo 디자인은 기술적으로 도전적이고 시간이 많이 소요됩니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62073/62073fig02.jpg"> 도 2: "밧줄"과 "케이지"폴리머라제 복합체의 추상화 및 메커니즘. (A 및 B)올리고뉴클레오티드 테더는 SNAP 태그 반응을 통해 T7 폴리머라아제로 효소로 표시된다. 테더-프로모터가 있는 "가짜" T7 프로모터로 구성된 케이지를 사용하면 테더에 혼성화하고 전사 활동을 차단할 수 있습니다. (C)작업자(a*b*)가존재할 때, 올리고뉴클레오티드테더(ab)에발가락에 결합하고 케이지의 b* 영역을 변위시켜 전사가 발생할 수 있도록 한다. 이 수치는 추와 시27에서수정되었습니다. 약어 : RNAP = RNA 폴리머 라제. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62073/62073fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
이 논문은 전사 회로의 기능과 DNA 기반 회로의 확장성을 결합한 분자 컴퓨팅을 위한 새로운 빌딩 블록을 소개합니다. 이 빌딩 블록은 단일 좌초 DNA 테더(도2A)와함께 공동으로 부착된 T7 RNAP이다. 이 DNA 테더드 T7 RNAP를 합성하기 위해 폴리머라제는 N 단자 SNAP태그(24)에 융합되고 에슈리치아 대장균에서재조합되었다. SNAP 태그는 BG 기판으로 기능화된 올리고뉴클레오티드로 반응했다. 올리고뉴클레오티드 테더는 DNA 혼성화를 통해 폴리머라제에 근접하여 분자 손님의 위치를 지정할 수 있게 한다. 이러한 손님 중 하나는 "케이지"라고 불리는 경쟁 전사 차단제였으며, 이는 유전자 다운스트림이없는 "가짜"T7 프로모터 DNA 듀플렉스(그림 2B)로구성됩니다. 올리고뉴클레오티드 밧줄을 통해 RNAP에 구속될 때, 케이지는 RNAP 결합을 위한 다른 DNA 템플릿을 능가하여 중합체 활성을 노점으로 하여 RNAP상태를 "OFF"상태(도 2C)로렌더링한다.
"ON" 상태로 중합효소를 활성화하기 위해, 유전자의 T7 프로모터의 상류에 단일 좌초 "연산자" 도메인을 가진 T7 DNA 템플릿이 설계되었다. 연산자 도메인(즉, 도메인 a*b* 도 2C)은TMDSD를 통해 RNAP에서 케이지를 대체하고 RNAP 근위를 유전자의 T7 프로모터에 배치하여 전사를 시동하도록 설계될 수 있다. 대안적으로, DNA 템플릿은 또한 운영자 서열이 "인공 전사 인자"(즉, 도 3A에서TFA 및 TFB 가닥)로 지칭되는 보조 핵산 가닥에 보완된 곳에서 설계되었다. 두 가닥이 반응에 도입되면 운영자 사이트에서 어셈블하여 새로운 의사 연속 도메인 a*b*를만듭니다. 그런 다음 이 도메인은 TMDSD를 통해 케이지를 변위하여전사(그림 3B)를시작할 수 있습니다. 이러한 가닥은 외인성 또는 생산될 수 있다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62073/62073fig03.jpg"> 그림 3: 3성분 스위치 활성제를 통한 폴리머라제 활성의 선택적 프로그래밍. (A)전사 인자(TFA 및 TFB)가존재할 때, 그들은 프로모터의 연산도메인 상류에 결합하여, 포홀드 중재된 DNA 변위를 통해 케이지를 변위시킬 수 있는 의사 단일 가닥 시퀀스(a*b*)를 형성한다. (B)이 a*b* 도메인은 TMDSD를 통해 케이지를 변위하여 전사를 시작할 수 있습니다. 이 수치는 추와 시27에서수정되었습니다. 약어: TF = 전사 인자; RNAP = RNA 중합체; TMDSD = 발가락 매개 DNA 가닥 변위. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62073/62073fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
체외 전사 조절을 위한 핵산 계전사 인자의 사용은 디지털 논리, 피드백 및 신호 계단식과 같은 정교한 회로 동작의 확장 가능한 구현을 가능하게 합니다. 예를 들어, 상류 유전자의 전사체가 다운스트림 유전자를 활성화하는 핵산 서열을 설계함으로써 논리 게이트 캐스케이드를 구축할 수 있다. 이 제안된 기술로 이루어진 계단식 및 멀티플렉스를 활용하는 한 가지 응용 분야는 휴대용 진단 및 분자 데이터 처리를 위한 보다 정교한 분자 컴퓨팅 회로를 개발하는 것입니다. 또한, 분자 컴퓨팅 및 드 노보 RNA 합성 기능을 통합하면 새로운 응용 프로그램이 가능해질 수 있다. 예를 들어, 분자 회로는 사용자 정의 RNA 중 하나 또는 조합을 입력 및 출력 치료 RNA 또는 mRNA로 검출하도록 설계되어 기능성 펩티드 또는 단백질을 치료 시점 의료 응용 분야에 대한 암호화할 수 있다.

<table><tbody><tr><td>0.5% 폴리소르베이트 20(TWEEN 20)</td><td>BioShop</td><td>TWN510.5</td><td></td></tr><tr><td>0.5M 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)</td><td>바이오 베이직</td><td>SD8135</td><td></td></tr><tr><td>10mM 인산나트륨 완충액(pH 7)</td><td>10mM 완충액을 만드는 데 사용되는</td> <td>바이오 베이직</td><td>PD0435</td> 정제</tr><tr><td>10% 과황산암모늄(APS)</td><td>시그마 알드리치</td><td>A3678-100G</td><td></td></tr><tr><td>100kDa 아미콘 울트라-15 원심 분리기 필터 유닛</td><td>Fisher Scientific</td><td>UFC910008</td><td></td></tr><tr><td>100% 아세톤</td><td>Fisher Chemical</td><td>A18P4</td><td></td></tr><tr><td>100% 에탄올 (EtOH)</td><td>하우스 브랜드</td><td>39752-P016-EAAN</td><td></td></tr><tr><td>10x 체외 전사(IVT) 완충액</td><td>New England Biolabs</td><td>B9012</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris-Borate-EDTA (TBE) 완충액</td><td>Bio Basic</td><td>A0026</td><td></td></tr><tr><td>1M 이소프로필 &베타;- d-1-티오갈락토피라노시드(IPTG)</td><td>시그마 알드리치</td><td>I5502-1G</td><td></td></tr><tr><td>1M 중탄산나트륨 완충액</td><td>시그마 알드리치</td><td>S6014-500G</td><td></td></tr><tr><td>1M 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(트리스)</td><td>시그마 알드리치</td><td>648311-1KG</td><td></td></tr><tr><td>1X 트리스-EDTA(TE) 버퍼</td><td>ThermoFisher</td><td>12090015</td><td></td></tr><tr><td>2M 이미다졸</td><td>시그마 알드리치</td><td>56750-100G</td><td></td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올(BME)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>3M 아세트산나트륨</td><td>바이오 베이직</td><td>SRB1611</td><td></td></tr><tr><td>40% 아크릴아미드(19:1)</td><td>바이오 베이직</td><td>A00062</td><td></td></tr><tr><td>4x LDS 단백질 샘플 로딩 버퍼</td><td>Fisher Scientific</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>5M 염화나트륨(NaCl)</td><td>바이오 베이직</td><td>DB0483</td><td></td></tr><tr><td>5mM 디티오트레이톨(DTT)</td><td>시그마 알드리치</td><td>43815-1G</td><td></td></tr><tr><td>6x 겔 로딩 염료</td><td>뉴잉글랜드 바이오랩스</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>아가로스 B 분말</td><td>바이오 베이직</td><td>AB0014</td><td></td></tr><tr><td>BG-GLA-NHS</td><td>뉴잉글랜드 바이오랩스</td><td>S9151S</td><td></td></tr><tr><td>BL21 유능한 대장균</td><td>애드진</td><td>C2530H</td><td></td></tr><tr><td>BLUeye prestained protein ladder</td><td>FroggaBio</td><td>PM007-0500</td><td></td></tr><tr><td>브로모페놀 블루</td><td>바이오 베이직</td><td>BDB0001</td><td></td></tr><tr><td>쿠마시 블루(SimplyBlue SafeStain)</td><td>ThermoFisher</td><td>LC6060</td><td></td></tr><tr><td>시아닌 염료(SYBR 골드 핵산 겔 염색)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>시아닌 염료(SYBR 안전 핵산 겔 염색)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>건조 디메틸 설폭사이드 (디엠소)</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>포름아미드</td><td>시그마 알드리치</td><td>F9037-100ML</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>바이오 베이직</td><td>GB0232</td><td></td></tr><tr><td>카나마이신 설페이트</td><td>BioShop</td><td>KAN201.5</td><td></td></tr><tr><td>용해 육수</td><td>시그마 알드리치</td><td>L2542-500ML</td><td></td></tr><tr><td>공작석 그린 옥살레이트</td><td>시그마 알드리치</td><td>2437-29-8</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N'-테트라메틸에탄-1,2-디아민(TEMED)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281-25ML</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS 러닝 버퍼(20x)</td><td>Fisher Scientific</td><td>LSNP0002</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris gel 1.0 mm 12-well</td><td>Life Technologies</td><td>NP0322BOX</td><td></td></tr><tr><td>올리고뉴클레오티드(케이지 안티센스)</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>TATAGTGAGTCGTATTAATTTG</td></tr><tr><td>올리고뉴클레오티드( 케이지 센스)</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>TCAGTCACCTATCTGTTTCAAA TTAATACGACTCACTATA</td></tr><tr><td>올리고뉴클레오티드 (공작석 그린 압타머 안티센스)</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>GGATCCATTCGTTACCTGGCT CTCGCCAGTCGGGATCCTATA GTGAGTCGTATTACAGTTCCAT TATCGCCGTAGTTGGTGTACT</td></tr><tr><td>올리고뉴클레오티드(말라카이트 그린 압타머 센스)</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>TAATACGACTCACTATAGGATC CCGACTGGCGAGAGCCAGGT AACGAATGGATCC</td></tr><tr><td>올리고뉴클레오티드(전사 인자 A)</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>AGTACACCAACTACGAGTGAG</td></tr><tr><td>올리고뉴클레오티드(전사 인자 B)</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>TCAGTCACCTATCTGGCGATAA TGGAACTG</td></tr><tr><td>올리고뉴클레오티드 3' 아민 변형(테더)</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>GCTACTCACTCAGATAGGTGAC TGA/3AmMO/</td></tr><tr><td>Pierce strong ion exchange spin columns</td><td>Fisher Scientific</td><td>90008</td><td></td></tr><tr><td>플라스미드 인코딩 SNAP T7 RNAP 및 kanamycin resistance genes</td><td>Genscript</td><td>N/A</td><td>custom gene insert</td></tr><tr><td>protein purification column (HisPur Ni-NTA spin column)</td><td>Fisher Scientific</td><td>88226</td><td></td></tr><tr><td>rNTP 믹스</td><td>New England Biolabs</td><td>N0466S</td><td></td></tr><tr><td>Roche 미니 퀵 DNA 스핀 컬럼</td><td>시그마 알드리치</td><td>11814419001</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>시그마 알드리치</td><td>T8787-100ML</td><td></td></tr><tr><td>초저 범위 DNA 사다리</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>10597012</td><td></td></tr><tr><td>요소</td><td>BioShop</td><td>URE001.1</td><td></td></tr></tbody></table>

시험관 내 전사 및 분자 계산을 위한 dna 테더드 rna 폴리머라제

DNA-Tethered RNA Polymerase for Programmable In vitro Transcription and Molecular Computation

DNA 나노 기술은 다양한 응용 프로그램에 대한 사용자 처방 모양과 역학으로 핵산의 프로그래밍 가능한 자체 조립을 가능하게합니다. 이 연구는 DNA 나노 기술의 개념이 파지 유래 T7 RNA 폴리머라제(RNAP)의 효소 활성을 프로그래밍하고 확장 가능한 합성 유전자 조절 네트워크를 구축하는 데 사용될 수 있음을 보여줍니다. 첫째, 올리고뉴클레오티드 테더드 T7 RNAP는 N단말 스냅 태그 RNAP의 발현과 SNAP 태그의 후속 화학 결합을 벤질구아닌(BG)-변형 올리고뉴클레오티드와 결합하여 설계된다. 다음으로, 핵산 가닥 변위는 주문형 폴리머라제 전사를 프로그래밍하는 데 사용된다. 또한, 보조 핵산 어셈블리는 DNA 템플릿을 사용하여 DNA 프로그래밍된 T7 RNAP 간의 상호 작용을 조절하기 위해 "인공 전사 인자"로 사용될 수 있다. 이 시험관 내 전사 규제 메커니즘은 디지털 논리, 피드백, 계단식 및 멀티플렉스와 같은 다양한 회로 동작을 구현할 수 있습니다. 이 유전자 규제 아키텍처의 컴포지토리는 설계 추상화, 표준화 및 확장을 용이하게 합니다. 이러한 기능은 생체 감지, 질병 검출 및 데이터 저장과 같은 응용 분야에 대한 시험관 내 유전 장치의 신속한 프로토타이핑을 가능하게 합니다.

<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62073/62073fig05.jpg"> 그림 5: SNAP T7 RNAP 발현 및 체외 전사 분석의 SDS-PAGE 분석. (A)SNAP T7 RNAP 단백질 정제 분석, SNAP T7 RNAP 분자량: 119.4kDa. FT = 컬럼에서 의 흐름을 통해, W1 = 용출 분획불을 포함하는 세척 버퍼, 정제 된 제품을 포함하는 E1-3 = 용출 분획, 및 DE = 10 배 희석 총 탈염 용출. 4-12% 프리캐스트 비스-트리스 단백질 젤, 스테인: 쿠마시 블루, 러닝 버퍼: MES 버퍼, 조건: 200 V 35 분 동안 .(B)시험관 내 전사 분석은 시간이 지남에 따라 형광 압태의 생산을 측정하여 SNAP T7 RNAP...

우리는 시험관 내 전사 반응을 조절하기 위해 새로운 DNA 테더T7 RNA 폴리머라제의 엔지니어링을 설명합니다. 우리는 단백질 합성 및 특성화를 위한 단계를 논의하고, 개념 증명 전사 적 조절을 검증하며, 분자 컴퓨팅, 진단 및 분자 정보 처리에 대한 응용 분야에 대해 논의합니다.

시험관 내 전사 및 분자 계산을 위한 DNA 테더드 RNA 폴리머라제

DNA nanotechnology enables programmable self-assembly of nucleic acids into user-prescribed shapes and dynamics for diverse applications. This work ...

인공 핵산 전사인자를 이용한 중합효소 활성조절방안을 제안한다. 이 유전자 규제 아키텍처는 체외 유전 적 장치를 위한 미래 를 위한 빌딩 블록역할을 할 수 있습니다. DNA 결합 도메인을 T7 RNA 폴리머라아제에 스테더링하여, 이 기술은 DNA 기반 회로의 확장성과 전사 회로의 기능을 결합합니다.테이블에 표시된 바와 같이, 5에서 1 대 5 비율로, 이중 증류수의 50 마이크로 리터의 최종 부피에 단일 좌초 BG 올리고 뉴클레오티드의 9 희석을 함으로써 시작합니다. BG 올리고뉴클레오티드 의 4개의 마이크로리터와 SNAP 버퍼의 2개의 마이크로리터, 그리고 SNAP T7 RNAP의 4개의 마이크로리터를 혼합해서 각 희석에 대하여 1개의 반응 혼합물을 준비합니다. 올리고뉴클레오티드를 이중 증류수로 대체하여 RNAP 제어를 준비하고, SNAP T7 RNAP를 이중 증류수로 대체하여 DNA 제어를 준비합니다.각 샘플의 마이크로리터 2개와 SNAP 버퍼 4개 소리터, 샘플당 단백질 로딩 염료 2개에 첨가하여 11개의 반응을 설정합니다. 70도에서 10분 동안 반응을 가열한 후 각 샘플의 마이크로리터 2개를 4~12%의 유리체 단백질 젤에 적재하여 200볼트의 얼음에 젤 전기포아를 35분간 적재합니다. 실행이 끝나면 세척당 적어도 10 분 동안 셰이커에 3 개의 물 교환으로 젤을 씻고 핵산이 15 분 동안 시아닌 염료로 염색합니다.적절한 젤 이미징 시스템에서 젤을 이미지화하고 쿠마시 블루의 20 밀리리터로 젤을 다시 얼룩지게 합니다. 1 시간 후, 다시 젤을 이미징하기 전에 적어도 한 시간 동안 이중 증류수로 얼룩을 해제합니다. 올리고뉴클레오티드 테더드 SNAP T7 정제의 경우, 먼저, 1개의 어형량 50마이크로리터를 5개의 어금니 나트륨 염화나트륨 100마이크로리터와 850마이크로리터의 이중 증류수와 혼합하여 용출 완충제를 준비한다.다음으로, 샘플당 1개의 이온 교환 컬럼을 개별 2밀리리터 원심분리기 튜브에 넣고, 각 열에서 모든 버퍼가 출동될 때까지 원심분리로 매립 버퍼로 컬럼을 세척한다. 각 샘플을 3 내지 1정정제 버퍼에서 샘플 비율로 희석하고 400마이크로리터의 샘플을 각 컬럼에 로드합니다. 모든 버퍼가 설명된 대로 용출된 경우 각 샘플에 대해 흐름을 수집하고 레이블을 지정합니다.모든 버퍼가 세척당 용출될 때까지 세척당 400 마이크로리터의 정제 버퍼로 컬럼을 세 번 세척하여 흐름 스루를 적절히 수집하고 라벨

dna-tethered-rna-polymerase-for-programmable-vitro-transcription

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 작품은 염색체 수준에서 RNA / DNA 복합체를 형성하고 효모 세포의 게놈 DNA와 RNA의 유전 정보의 전송을 공개하는 방법을 보여줍니다.

RNA 함유 Oligonucleotides를 사용하여 변환하여 게놈 DNA에서 RNA / DNA 하이브리드의 생성

박테리아와 Archaea의 CRISPR / 카스 시스템 중재 적응 면역. 많은 카스 단백질은 길이를 변화의 crRNA의 전구체에 작용 endoribonucleases 역할을 제안하고 있습니다. 여기 카스의 endonuclease 활동의 생화학 분석을위한 사전 c​​rRNA 기판을 생성하는 세 가지 방법을 설명합니다.

CRISPR / 카스 시스템의 Endonucleases을위한 기판 생성

아연 핑거 뉴 클레아 제 (ZFNs) 및 전사 활성제와 같은 이펙터 클레아 제 (TALENs)와 같은 디자이너 클레아는 ​​동종 최종 합류 (NHEJ)과 상동 재조합 (HR) 경로 모두를 트리거하여 마우스의 착상 전 배아의 게놈을 수정하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 진보는 정확한 유전자 변형 생쥐의 신속한 생성을 가능하게한다.

디자이너 클레아 제를 사용하여 마우스 게놈 엔지니어링

광학 핀셋은 5' 및 3' 말단에서 개별 분자를 늘려 RNA 접힘을 연구하는 데 사용되었습니다. 여기에서는 핀셋을 위한 RNA 분자를 합성하고, 기기를 보정하고, 단일 분자를 조작하는 방법을 설명하는 일반적인 절차에 대해 설명합니다.

광 핀셋으로 단일 RNA 분자의 Nanomanipulation

이 프로토콜은 플라스미드에서 DNA 가닥 변위 게이트를 유도하고 형광 역학 측정을 사용하여 테스트하는 방법을 설명합니다. 게이트는 공식 화학 반응 네트워크(CRN)의 동작을 근사화하기 위해 다중 구성 요소 시스템으로 모듈식으로 구성될 수 있으며, 이는 분자 프로그래밍 언어로서 CRN의 새로운 용도를 보여줍니다.

플라스미드 유래 구현 화학 반응 네트워크 용 DNA 가닥 변위 게이츠

이 원고에서는 세균 전사를 표적으로 하는 항균제의 전사 및 억제 활성을 기능적으로 검사하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

시험 관내 전사 분석 실험 및 약물 발견에의 응용

여기서, 우리는 짧은 합성 DNA 및 RNA 올리고뉴클레오티드 및 정제된 Pol II를 필요로 하는 RNA 폴리머라제 II(Pol II) 신장 복합체의 조립을 기술한다. 이들 복합체는 Pol II 신장 복합체와 관련된 전사체의 기본 공동 전사 처리를 연구하는 데 유용하다.

인공 RNA 폴리머라제 II 연신복합체 해부 공동 전사 RNA 처리 이벤트

RNA 간섭은 특정 발달 단계에서 유전자 발현을 조작하기 위한 널리 적용가능하고 강력한 기술입니다. 여기서, 우리는 수중 다이빙 딱정벌레 Thermonectus marmoratus에서이 기술을 구현하기 위한 필요한 단계를 기술합니다, 구조 또는 행동에 영향을 미치는 유전자의 녹다운에 유전자 의 취득에서.

특정 발달 시점에서 유전자 발현을 조작하기 위한 강력한 도구로 수생 딱정벌레의 RNA 간섭

우리는 13C/ 15N 라벨 및 1 H R1θ  이완 분산 핵 자기 공명 (NMR) 분광기로 표시되지 않은 RNA에 마이크로 밀리초 역학을 측정하는 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜의 초점은 NMR 실험의 고순도 샘플 준비 및 설정에 있습니다.

RNA의 1 H R 1θ 이완 분산 실험의 샘플 준비 및 설치의 실제적인 양상

잘 특성화 된 유전 부분은 새로운 유전 회로의 설계에 필요합니다. 여기에서는 유전 부분을 신속하게 특성화하기 위한 비용 효율적이고 처리량이 높은 방법을 설명합니다. 당사의 방법은 무세포 용해물, 복제를 방지하기 위한 선형 DNA, 처리량을 늘리고 반응량을 줄이기 위한 음향 액체 처리를 결합하여 비용과 시간을 줄입니다.

무세포 시스템을 사용한 유전 부분의 신속한 특성 분석

우리는 구성 DNA 올리고뉴클레오티드에서 시작하여 양친매성 DNA 나노스타로 구성된 합성 생체 분자 응축물을 제조하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 응축물은 단일 nanostar 구성 요소 또는 두 가지 구성 요소로 생성되며 내장된 DNA 템플릿에서 RNA의 시험관 내 전사를 유지하도록 변형됩니다.

양친매성 DNA 나노 구조의 합성 응축물 및 세포와 같은 구조

학습하세요 DNA 테더드 T7 RNA 폴리머라제를 이용한 시험관 내 전사 조절 방법을. 인공 핵산 전사 인자를 활용한 이 기술은 유전자 회로 설계와 분자 컴퓨팅에 활용됩니다.

시험관 내 전사 및 분자 계산을 위한 DNA 테더드 RNA 폴리머라제

더 많은 동영상 탐색