تلطيخ وتصوير عالي الدقة لنماذج عضوية وكروية ثلاثية الأبعاد

يعد توصيف نموذج 3D في المختبر بدقة خلوية ودون خلوية أمرا بالغ الأهمية للاستغلال الكامل ، ولكنه قد يكون صعبا. لذلك ، قدمنا بروتوكولا مجانيا للتصوير الملطخ والدقة تحت الخلوية لنماذج 3D الثابتة في المختبر التي تتراوح من 100 ميكرومتر إلى عدة ملليمترات. هياكل 3D شعاعية ، ويجب التلاعب بها بعناية.

قبل سحب العينات ، تحقق من موقع هياكل 3D الخاصة بك داخل الأنبوب لتجنب أي طموح. نظرا لأننا قمنا بتكييف التقنيات الكلاسيكية لتضمين الهياكل الصغيرة مثل الكائنات العضوية أو الكروية ، يمكن أن تساعد التعليمات المرئية المستخدمين لأول مرة على أداء المهمة بسهولة أكبر. ستوضح الإجراء معي لورا فرانكولز ، وهي تقنية معملية من منصة أبحاث علم الأمراض.

لتحضير عينات لتلطيخ التثبيت الكامل ثلاثي الأبعاد ، استخدم طرف ماصة واحد ملليلتر مشفر مسبقا باستخدام BSA لإضافة تعليق هيكل ثلاثي الأبعاد ملليلتر واحد إلى أنبوب سعة 500 ميكرولتر من PBS. عندما تستقر الهياكل ثلاثية الأبعاد في قاع الأنبوب ، استبدل PBS بعناية ب 500 ميكرولتر من محلول منع النفاذية لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع تحريض أفقي لطيف بمعدل 30 إلى 50 دورة في الدقيقة. في نهاية الحضانة ، اسمح للهياكل ثلاثية الأبعاد بالرواسب مرة أخرى قبل غسل الهياكل ثلاثية الأبعاد بعناية مرتين في ملليلتر واحد من 0.1٪ PBS مع BSA لمدة ثلاث دقائق لكل غسلة.

بعد الغسيل الأخير ، قم بتسمية الهياكل ثلاثية الأبعاد ب 250 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية في PBS لمدة يومين إلى ثلاثة أيام مع تحريض أفقي لطيف عند أربع درجات مئوية. في نهاية الحضانة ، اغسل العينة بخمس غسلات لمدة ثلاث دقائق وغسلتين لمدة 15 دقيقة في ملليلتر واحد من 0.1٪ PBS BSA لكل غسلة. بعد الغسيل الأخير ، قم بتسمية الهياكل ثلاثية الأبعاد ب 250 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المناسب في PBS لمدة 24 ساعة عند أربع درجات مئوية مع تحريض أفقي لطيف محمي من الضوء.

في اليوم التالي ، قم بتسمية الهياكل ثلاثية الأبعاد ب 250 ميكرولتر من التركيز المناسب ل Hoechst 3342 لمدة ساعتين عند أربع درجات مئوية مع تحريض أفقي لطيف. في نهاية الحضانة ، اغسل الهياكل ثلاثية الأبعاد خمس مرات لمدة ثلاث دقائق ومرتين لمدة 15 دقيقة في ملليلتر واحد من PBS لكل غسلة كما هو موضح. بعد الغسيل الأخير ، انقل هياكل 3D إلى صفيحة دقيقة من البوليسترين الأسود 96 جيدا ، وأضف برفق 200 ميكرولتر من محلول التطهير على الهياكل ، وتجنب الفقاعات.

ثم ضع اللوحة مغطاة بورق الألمنيوم عند أربع درجات مئوية لمدة 48 ساعة على الأقل. لتضمين نماذج زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد الكبيرة ، استخدم طرف ماصة واحد ملليلتر مطلي ب BSA لنقل الهياكل ثلاثية الأبعاد بعناية إلى أنبوب زجاجي مسطح القاع مع غطاء زجاجة مبطن ب PTFE. بعد استقرار الهياكل ، استبدل PBS بعناية بنسبة 70٪ من الإيثانول لحضانة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

في نهاية الحضانة ، استبدل 70٪ من الإيثانول بملليلتر واحد من محلول eosin Y الجاهز للاستخدام. نفض الغبار عن الأنبوب وتلطيخ الهياكل لمدة 30 دقيقة على الأقل. في نهاية الحضانة ، قم بتجفيف الهياكل بثلاث غسلات متتالية لمدة 30 دقيقة في ملليلتر واحد من الإيثانول بنسبة 100٪ لكل غسلة.

بعد الجفاف الأخير ، قم بمسح الهياكل ثلاثية الأبعاد بثلاث غسلات متتالية لمدة 30 دقيقة في ملليلتر واحد من الزيلين لكل غسلة تحت غطاء كيميائي. بعد الغمر الأخير بالزيلين ، ضع قطعة من وسادة الخزعة المنقوعة بالزيلين في حجرة واحدة من شريط نسيج microtwin أبيض ، واستخدم ماصة باستور بلاستيكية مطلية ب BSA بسعة 2 ملليلتر لنقل هياكل 3D إلى الوسادة. قم بتغطية الهياكل ثلاثية الأبعاد بوسادة خزعة أخرى مبللة بالزيلين لتثبيت الهياكل ثلاثية الأبعاد في مكانها وإغلاق الكاسيت.

عندما يتم نقل جميع العينات ، ضع الكاسيتات في حمام بارافين 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل وضع الكاسيت في حمام بارافين طازج 65 درجة مئوية طوال الليل. في صباح اليوم التالي ، أضف البارافين السائل إلى قالب تضمين دافئ واحد 65 درجة مئوية لكل عينة ، وضع عينة واحدة مدمجة من البارافين في كل قالب. حرك القوالب برفق حتى تسقط جميع الهياكل ثلاثية الأبعاد إلى القيعان ، واستخدم ملقط ناعم دافئ 65 درجة مئوية لوضع الهياكل ثلاثية الأبعاد في وسط كل قالب.

قم بتبريد القالب حتى يشكل البارافين طبقة صلبة رقيقة ، مما يثبت بنية 3D في مكانها. ضع شريط مناديل وأضف البارافين الساخن فوق القالب. قم بإزالة القالب عندما يصلب البارافين تماما.

لتضمين نماذج زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد الصغيرة ، اغسل الهياكل ثلاثية الأبعاد برفق ثلاث مرات في ملليلتر واحد من TBS لكل غسلة. بعد الغسيل الأخير ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من TBS دون لمس الهياكل ، وأضف قطرتين من الكاشف الثاني من مجموعة تضمين البارافين التجارية. امزج بلطف عن طريق النقر ، وأضف قطرتين من الكاشف مع النقر حتى يصلب الجل.

استخدم ملقط ناعم لنقل الجل من بئر الكاسيت المجمع مسبقا من المجموعة ، وقم بتجفيف عينة الجل المدمجة بحضانة الإيثانول والزيلين الصاعدة لمدة 30 دقيقة في غطاء الدخان كما هو موضح. بعد غمر الزيلين الأخير ، ضع الكاسيت في حمام بارافين 65 درجة مئوية طوال الليل قبل استخدام ملقط ناعم لنقل عينة البارافين المضمنة إلى وسط قالب تضمين سائل محمل بالبارافين 65 درجة مئوية. ثم قم بتأمين بنية ثلاثية الأبعاد بطبقة أخرى من البارافين كما هو موضح في نماذج زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد الكبيرة.

يوفر تلطيخ جبل كامل ثلاثي الأبعاد والمجهر متحد البؤر معلومات مرئية حول التركيب الخلوي والموقع المكاني لنماذج الثقافة ثلاثية الأبعاد إلى مجال عمق يصل إلى 200 ميكرون. تسمح الدقة العالية التي يمكن الحصول عليها لهياكل 3D باستخدام هذا البروتوكول بتطبيق خوارزميات التجزئة الخلوية ودون الخلوية لتحديد عدد الخلية والكشف عن علامات الخلايا المختلفة داخل أنواع فرعية مختلفة من الخلايا. يمكن تطبيق تحليل حوامل كاملة 3D على الخلايا المرئية التي يصل عمقها إلى 200 ميكرون ، بغض النظر عن الهياكل بأكملها.

على العكس من ذلك ، يمكن أن يوفر تحليل قسم 2D نظرة ثاقبة للخلايا من أي حجم.