낮은 종양 함량 조직에서 종양 농축을 위한 자동화된 해부 프로토콜

FFPE 또는 신선한 냉동 물질로부터 관심의 작은 분산 영역의 분리 또는 농축은 전통적인 방법보다 더 빠르고 효율적으로 자동화 된 해부로 달성 될 수 있습니다. FFPE 또는 신선한 냉동 조직에서 게놈 물질을 추출하는 것은 많은 임상 및 번역 연구 실험실의 요구 사항입니다. 자동 해부는 매크로 해부와 레이저 캡처 마이크로 해부 사이의 상당한 간격을 채 웁니다.

시작하려면 공급업체에서 제공하는 보기 플랫폼 또는 오픈 소스 뷰어를 사용하여 관심 있는 종양 영역에 대해 스캔한 슬라이드 이미지에 주석을 추가합니다. 염색되지 않은 샘플 조직 슬라이드를 디지털 슬라이드 레퍼런스를 사용할 때 첫 번째 및 네 번째 슬라이드 위치의 스테이지 상에 놓습니다. 작업 목록을 열어 자동화된 조직 분리 소프트웨어를 사용하여 밀링 작업을 만든 다음 새 작업 만들기를 선택하고 케이스 ID와 이름을 입력하여 작업 이름을 입력합니다.

두께로 이동하고 위쪽 또는 아래쪽 화살표 탭을 사용하여 단면 두께를 선택합니다. 그런 다음 조직 준비로 이동하여 파라핀화 또는 파라핀화를 선택하십시오. 참조 이미지"파일에서 이미지를 선택하고 이미지 가져오기를 선택합니다.

그런 다음 드롭다운에서 디지털 참조로 가져올 파일을 선택합니다. 오른쪽 하단의 Scan stage"버튼을 선택하여 스테이지를 스캔하여 첫 번째부터 네 번째 위치까지 각 샘플 조직 슬라이드를 캡처합니다. 스테이지 참조의 경우 상자를 드래그하여 조직 위에 직사각형 영역을 만들고 직사각형 영역 아래의 원형 거품을 선택하여 스테이지 참조 이미지를 캡처합니다.

참조 이미지의 오른쪽 위 모서리에 있는 복사 옵션을 선택하여 이 사각형 필드를 두 번째부터 네 번째 슬라이드 위치까지의 나머지 샘플 조직 슬라이드에 복사합니다. 그런 다음 필요에 따라 정렬하고 크기를 조정합니다. 디지털 참조 이미지의 경우 선택한 직사각형 영역에 이미지를 오버레이합니다.

그런 다음 디지털 기준의 크기를 조정하고 전체적으로 조정하여 물론 확대 / 축소하여 샘플 조직 위의 크기와 위치에 가장 잘 맞 춥니 다. 참조 이미지의 오른쪽 위 모서리에 있는 복사 옵션을 선택하여 이 사각형 필드를 두 번째부터 네 번째 슬라이드 위치까지의 나머지 샘플 조직 슬라이드에 복사합니다. 그런 다음 필요에 따라 정렬하고 크기를 조정합니다.

오른쪽 하단에있는 스캔 단계"버튼을 선택하여 미세 조정 단계로 이동하십시오. 첫 번째 단계 위치와 오른쪽 도구 모음에서 변형 도구 아이콘을 선택하여 참조의 미세 정렬 및 확대/축소 조정을 수행하여 샘플 슬라이드 오버레이와 가장 잘 일치하도록 합니다. 참조물을 사용하여 화면 하단의 샘플 슬라이딩 바를 사용하여 참조 이미지와 샘플 이미지 사이를 전환합니다.

확대 및 축소 기능을 사용하여 각 슬라이드 위치의 정렬을 조정하고 달성합니다. 최적의 샘플 오버레이가 달성되면 오른쪽 도구 모음에서 색상 선택기 도구 아이콘을 선택하여 마스크된 참조 이미지의 색상 부분에 밀링 경로 지정을 그립니다. 화면의 오른쪽 아래 모서리에 있는 주석 가져오기" 단추를 선택하여 샘플 슬라이드에 밀링 경로를 그립니다.

밀링 경로가 계산될 때 네 개 이하의 밀링 팁으로 주석이 달린 관심 영역을 캡처하고 수집합니다. 왼쪽 위 모서리의 밀링 팁 사용량은 커버된 영역과 선택한 팁 크기를 기준으로 계산됩니다. 팁 크기는 밀링 팁 화살표 아래에서 변경할 수 있으며 팁 사용량은 다시 계산됩니다.

첫 번째 슬라이드 위치에서 밀링 경로를 선택하면 나머지 슬라이드 위치에 밀링 경로가 복사됩니다. 화면의 오른쪽 하단에있는 설정 단계"버튼을 선택하여 컬렉션 튜브에서 밀링 팁을 무대에서 올바르게 지정하여 신속하게 적재하십시오. 저장고를 조직 유형 및 하류 핵산 추출을 위해 세 밀리리터의 적절한 해부 완충액으로 채운다.

그런 다음 화면의 오른쪽 하단에있는 해부"버튼을 선택하십시오. 자동 해부 후, 수집 튜브와 해부된 샘플 슬라이드를 스테이지에서 제거합니다. 수집 튜브를 튜브 랙에 놓고 슬라이드를 슬라이드 랙에 놓습니다.

H&E 염색된 포르말린, 고정된 파라핀 임베디드, 및 이종이식편에서 전이성 결장직장암을 함유하는 신선한 냉동 마우스 간 절편을 20x 배율로 전체 슬라이드 이미저에서 스캔하고, 기준 슬라이드로 사용하였다. H&E 염색된 기준 슬라이드에 주석을 달고 해부 및 핵산 추출을 위해 종양 영역에 대해 디지털 마스크로 마스킹하였다. 해부된 후 샘플 슬라이드를 H&E 염색하여 10마이크로미터 및 20마이크로미터 슬라이드에서 해부 영역을 확인하였다.

캡처된 메트릭은 자동화된 해부 및 핵산 추출의 성공을 입증했습니다. 이 프로토콜을 시도할 때는 얼룩지지 않은 슬라이드에 주석을 비교적 정확하게 오버레이하는 것이 관심 영역을 격리하는 데 중요하다는 점을 명심하십시오.