Name: הפקת קופקטור F420 לניתוח אורך זנב פוליגלוטאמט מתרבויות טהורות מתנוגניות ודגימות סביבתיות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 32 s
Description: למדו שיטה מותאמת להפקת קופקטור F420 מדגימות סביבתיות ומתרבויות טהורות. הפרוטוקול משלב כרומטוגרפיה נוזלית וניתוח אורך זנב לחקר מטבוליזם פרוקריוטי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים להכרת תודה לפרופ' קולין ג'קסון על התמיכה ב-F420 המטוהר. מחקר זה נתמך על ידי קרן המדע טירולי (TWF) ואוניברסיטת Innsbruck (Publikationsfonds). אנו מכירים מאוד בתמיכתם של GPS, HK, SB, GG ו- HB.

הערה: מיצוי וניתוח של קופקטור F420 הוא תהליך בן שלושה שלבים כולל תמוגה לדוגמה, טיהור מראש קופקטור באמצעות מיצוי שלב מוצק (SPE), וזיהוי קופקטור באמצעות יון-מזווג-RP-HPLC (IP-RP-HPLC) עם זיהוי פלואורסצנטיות. לפני תחילת, הכינו את החומרים והריגנטים כאמור בטבלה 1.
1. תמיסת דגימה
<ol><li>הוסף עד 5 גרם של מדגם צינורות מתאימים (למשל, 50 mL צינורות חרוט).</li>
	<li>הוסף 5 מ"ל של מאגר תמה (פתרון מלאי 2x, טבלה 1) לדגימות.</li>
	<li>להביא לנפח סופי של 10 מ"ל עם מים מזוקקים כדי להגיע לריכוז הסופי של 0.5 g·mL-1.</li>
	<li>מערבולת הדגימות המדוללות ל-20 מעלות.</li>
	<li>כלave אוטומטית במשך 30 דקות ב 121 °C (70 °F).</li>
	<li>עבור דגימות יבשות כמו אדמת יער, להביא לנפח סופי של 20 מ"ל עם מים מזוקקים לאחר autoclaving ומערבולת המדגם המדולל. זהירות: עליית הטמפרטורה במהלך השעבוד האוטומטי עלולה לגרום לצינורות להתפוצץ.</li>
</ol>2. טיהור מראש של קופקטור F 420 באמצעות מיצוי שלב מוצק (SPE)
הערה: כל שלבי SPE מתבצעים בטמפרטורת החדר
<ol><li>מצננים את הדגימות לטמפרטורת החדר.</li>
	<li>צנטריפוגה הדגימות autoclaved במשך 5 דקות ב 11,000 x g.</li>
	<li>הכן 5 מ"ל עמודות SPE מלאות 100 מ"ג של סורבט פולימרי מעורב אניון חלש.</li>
	<li>התנה את מחליף האניון עם 3 מ"ל של מתנול (פתרון תנאי, טבלה 1).</li>
	<li>ישיחל את מחליף האניון עם 3 מ"ל של מים מזוקקים (פתרון שאיון, טבלה 1).</li>
	<li>טען עד 9.0 מ"ל של supernatant מן lysate צנטריפוגות על עמודת SPE.</li>
	<li>לשטוף זיהומים עם 5 מ"ל של 25 mM אמוניום אצטט (פתרון שטיפת SPE 1, טבלה 1).</li>
	<li>לשטוף זיהומים עם 5 מ"ל של מתנול (פתרון שטיפת SPE 2, טבלה 1).</li>
	<li>האלגנטי את ה-F420 הגורף ב- 1.0 מ"ל של חיץ אילוטיון (טבלה 1). הערה: הכן מאגר חמקמקות טרי. בשל הוואקום המיושם ולחץ האדים הגבוה של מאגר ההבעה, נפחי ההבעה עשויים להיות שונים מדגם לדגימה. על מנת להבטיח את אותו נפח סופי בכל הדגימות, מומלץ לשקול את כלי האיסוף לפני ואחרי ההתחמקות ולחשב את נפח ההתחמקות האפקטיבי. לאזן את ההבדלים על ידי תוספת של חוצץ elution.</li>
</ol>3. איתור קופקטור F420
<ol><li>הגדר את התנור ל 40 °C (70 °F) גלאי פלואורסצנטיות 420 ננומטר אורך גל הכחדה ו 470 ננומטר אורך גל פליטה. השג הפרדה באמצעות מצב מעבר צבע באמצעות שלבים ניידים A ו- B (טבלה 1): 0-3 דקות: 26% B; 3-24 דקות: 26%-50% B; 24-25 דקות: 50% B; 25-27 דקות: 50%-26% B; 27-35 דקות: 26% B בקצב זרימה של 0.75 מ"ל-1. הערה: להבטיח שיווי משקל של תנאי עמודה לפני הזרקת דוגמאות על ידי ריקון העמודה לפחות עם 3 אמצעי אחסון של 74% שלב נייד A ו 26% שלב נייד B (טבלה 1).<ol>
<li>סנן את הדגימות הנבהרות מה- SPE לבקבוקונים של HPLC באמצעות מסנן PTFE בגודל נקבובית של 0.22 מיקרומטר. הערה: מומלץ לסנני PTFE בגודל נקבובית של 0.22 מיקרומטר.</li>
		<li>הזרק 50 μL של המדגם eluted על מערכת HPLC כדי לנתח את הרכב F420 קופקטור וריכוז. הערה: מכיוון שלא נעשה שימוש בתקן כמותי בפרוטוקול זה, יש להשוות דוגמאות ווריאנטים לפי אזור שיא.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Greening, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology%2C+biochemistry%2C+and+applications+of+F420-+and+Fo-dependent+redox+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%3A+MMBR%22%5BJournal%5D)">Physiology, biochemistry, and applications of F420- and Fo-dependent redox reactions.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 80 (2), 451-493 (2016).</li>
<li>Bashiri, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+revised+biosynthetic+pathway+for+the+cofactor+F420+in+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A revised biosynthetic pathway for the cofactor F420 in prokaryotes.</a> Nature Communications. 10 (1), 451(2019).</li>
<li>Grinter, R., Greening, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofactor+F420%3A+an+expanded+view+of+its+distribution%2C+biosynthesis%2C+and+roles+in+bacteria+and+archaea%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cofactor F420: an expanded view of its distribution, biosynthesis, and roles in bacteria and archaea.</a> FEMS Microbiology Reviews. , (2021).</li>
<li>Eirich, L. D., Vogels, G. D., Wolfe, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proposed+structure+for+coenzyme+F+420+from+methanobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Proposed structure for coenzyme F 420 from methanobacterium.</a> Biochemistry. 17 (22), 4583-4593 (1978).</li>
<li>Ney, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+methanogenic+redox+cofactor+F420+is+widely+synthesized+by+aerobic+soil+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">The methanogenic redox cofactor F420 is widely synthesized by aerobic soil bacteria.</a> The ISME Journal. 11 (1), 125-137 (2017).</li>
<li>Braga, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+pathway+rerouting+in+Paraburkholderia+rhizoxinica+evolved+long-overlooked+derivatives+of+coenzyme+F420%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Metabolic pathway rerouting in Paraburkholderia rhizoxinica evolved long-overlooked derivatives of coenzyme F420.</a> ACS Chemical Biology. 14 (9), 2088-2094 (2019).</li>
<li>Eirich, L. D., Vogels, G. D., Wolfe, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+coenzyme+F420+and+properties+of+its+hydrolytic+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Distribution of coenzyme F420 and properties of its hydrolytic fragments.</a> Journal of Bacteriology. 140 (1), 20-27 (1979).</li>
<li>Michaelis, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+reefs+in+the+Black+Sea+fueled+by+anaerobic+oxidation+of+methane%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microbial reefs in the Black Sea fueled by anaerobic oxidation of methane.</a> Science. 297 (5583), 1013-1015 (2002).</li>
<li>Knittel, K., Lösekann, T., Boetius, A., Kort, R., Amann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+distribution+of+methanotrophic+archaea+at+cold+seeps%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Diversity and distribution of methanotrophic archaea at cold seeps.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71 (1), 467-479 (2005).</li>
<li>Lin, X. -L., White, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence+of+Coenzyme+F420+and+Its+y-Monoglutamyl+derivative+in+nonmethanogenic+archaebacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Occurrence of Coenzyme F420 and Its y-Monoglutamyl derivative in nonmethanogenic archaebacteria.</a> Journal of Bacteriology. 168 (1), 444-448 (1986).</li>
<li>Spang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+of+the+ammonia-oxidizing+Candidatus+Nitrososphaera+gargensis%3A+insights+into+metabolic+versatility+and+environmental+adaptations%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The genome of the ammonia-oxidizing Candidatus Nitrososphaera gargensis: insights into metabolic versatility and environmental adaptations.</a> Environmental Microbiology. 14 (12), 3122-3145 (2012).</li>
<li>Mand, T. D., Metcalf, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+conservation+and+hydrogenase+function+in+methanogenic+archaea%2C+in+particular+the+genus+Methanosarcina%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%3A+MMBR%22%5BJournal%5D)">Energy conservation and hydrogenase function in methanogenic archaea, in particular the genus Methanosarcina.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 83 (4), (2019).</li>
<li>Lupa, B., Hendrickson, E. L., Leigh, J. A., Whitman, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formate-dependent+H2+production+by+the+mesophilic+methanogen+Methanococcus+maripaludis%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Formate-dependent H2 production by the mesophilic methanogen Methanococcus maripaludis.</a> Applied and Environmental Microbiology. 74 (21), 6584-6590 (2008).</li>
<li>Kulkarni, G., Mand, T. D., Metcalf, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+conservation+via+hydrogen+cycling+in+the+methanogenic+archaeon+Methanosarcina+barkeri%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Energy conservation via hydrogen cycling in the methanogenic archaeon Methanosarcina barkeri.</a> mBio. 9 (4), (2018).</li>
<li>Purwantini, E., Gillis, T. P., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+F420-dependent+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+in+Mycobacterium+and+Nocardia+species%2C+but+absence+from+Streptomyces+and+Corynebacterium+species+and+methanogenic+Archaea%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Presence of F420-dependent glucose-6-phosphate dehydrogenase in Mycobacterium and Nocardia species, but absence from Streptomyces and Corynebacterium species and methanogenic Archaea.</a> FEMS Microbiology Letters. 146 (1), 129-134 (1997).</li>
<li>Purwantini, E., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+a+novel+coenzyme+F420-dependent+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+from+Mycobacterium+smegmatis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Purification of a novel coenzyme F420-dependent glucose-6-phosphate dehydrogenase from Mycobacterium smegmatis.</a> Journal of Bacteriology. 178 (10), 2861-2866 (1996).</li>
<li>McCormick, J. R. D., Morton, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identity+of+cosynthetic+factor+I+of+Streptomyces+aureofaciens+and+fragment+FO+from+coenzyme+F420+of+Methanobacterium+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Identity of cosynthetic factor I of Streptomyces aureofaciens and fragment FO from coenzyme F420 of Methanobacterium species.</a> Journal of the American Chemical Society. 104 (14), 4014-4015 (1982).</li>
<li>Coats, J. H., Li, G. P., Kuo, M. -S. T., Yurek, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery%2C+production%2C+and+biological+assay+of+an+unusual+flavenoid+cofactor+involved+in+lincomycin+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Antibiotics%22%5BJournal%5D)">Discovery, production, and biological assay of an unusual flavenoid cofactor involved in lincomycin biosynthesis.</a> The Journal of Antibiotics. 42 (3), 472-474 (1989).</li>
<li>Bown, L., Altowairish, M. S., Fyans, J. K., Bignell, D. R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+the+Streptomyces+scabies+coronafacoyl+phytotoxins+involves+a+novel+biosynthetic+pathway+with+an+F420+-dependent+oxidoreductase+and+a+short-chain+dehydrogenase%2Freductase%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Production of the Streptomyces scabies coronafacoyl phytotoxins involves a novel biosynthetic pathway with an F420 -dependent oxidoreductase and a short-chain dehydrogenase/reductase.</a> Molecular Microbiology. 101 (1), 122-135 (2016).</li>
<li>Gurumurthy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+F%28420%29+-dependent+anti-oxidant+mechanism+protects+Mycobacterium+tuberculosis+against+oxidative+stress+and+bactericidal+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+microbiology%22%5BJournal%5D)">A novel F(420) -dependent anti-oxidant mechanism protects Mycobacterium tuberculosis against oxidative stress and bactericidal agents.</a> Molecular microbiology. 87 (4), 744-755 (2013).</li>
<li>Greening, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterial+F420H2-dependent+reductases+promiscuously+reduce+diverse+compounds+through+a+common+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Mycobacterial F420H2-dependent reductases promiscuously reduce diverse compounds through a common mechanism.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1000(2017).</li>
<li>Mathew, S., Trajkovic, M., Kumar, H., Nguyen, Q. -T., Fraaije, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enantio-+and+regioselective+ene-reductions+using+F420H2-dependent+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Enantio- and regioselective ene-reductions using F420H2-dependent enzymes.</a> Chemical Communications. 54 (79), Cambridge, England. 11208-11211 (2018).</li>
<li>Ney, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofactor+tail+length+modulates+catalysis+of+bacterial+F420-dependent+oxidoreductases%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cofactor tail length modulates catalysis of bacterial F420-dependent oxidoreductases.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1902(2017).</li>
<li>Grinter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+structural+basis+of+synthesis+of+the+unique+intermediate+dehydro-F420-0+in+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22mSystems%22%5BJournal%5D)">Cellular and structural basis of synthesis of the unique intermediate dehydro-F420-0 in mycobacteria.</a> mSystems. 5 (3), (2020).</li>
<li>Peck, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+concentrations+of+coenzyme+F420+analogs+during+batch+growth+of+Methanosarcina+barkeri+and+Methanosarcina+mazei%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Changes in concentrations of coenzyme F420 analogs during batch growth of Methanosarcina barkeri and Methanosarcina mazei.</a> Applied and Environmental Microbiology. 55 (4), (1989).</li>
<li>Gorris, L. G., vander Drift, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofactor+contents+of+methanogenic+bacteria+reviewed%5BTitle%5D)+AND+%22BioFactors%22%5BJournal%5D)">Cofactor contents of methanogenic bacteria reviewed.</a> BioFactors. 4 (3-4), Oxford, England. 139-145 (1994).</li>
<li>Bair, T. B., Isabelle, D. W., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+coenzyme+F%28420%29+in+Mycobacterium+species%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Structures of coenzyme F(420) in Mycobacterium species.</a> Archives of Microbiology. 176 (1-2), 37-43 (2001).</li>
<li>Portillo, M. C., Gonzalez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moonmilk+deposits+originate+from+specific+bacterial+communities+in+Altamira+Cave+%28Spain%29%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Moonmilk deposits originate from specific bacterial communities in Altamira Cave (Spain).</a> Microbial Ecology. 61, (2011).</li>
<li>Wagner, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medium+preparation+for+the+cultivation+of+microorganisms+under+strictly+anaerobic%2Fanoxic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Medium preparation for the cultivation of microorganisms under strictly anaerobic/anoxic conditions.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e60155(2019).</li>
<li>Lackner, N., Hintersonnleitner, A., Wagner, A. O., Illmer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogenotrophic+methanogenesis+and+autotrophic+growth+of+Methanosarcina+thermophila%5BTitle%5D)+AND+%22Archaea%22%5BJournal%5D)">Hydrogenotrophic methanogenesis and autotrophic growth of Methanosarcina thermophila.</a> Archaea. 2018 (5), 1-7 (2018).</li>
<li>Wagner, A. O., Reitschuler, C., Illmer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+different+acetate%3A+Propionate+ratios+on+the+methanogenic+community+during+thermophilic+anaerobic+digestion+in+batch+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Engineering+Journal%22%5BJournal%5D)">Effect of different acetate: Propionate ratios on the methanogenic community during thermophilic anaerobic digestion in batch experiments.</a> Biochemical Engineering Journal. 90, 154-161 (2014).</li>
<li>Wagner, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+preparation%2C+preservation%2C+and+storage+for+volatile+fatty+acid+quantification+in+biogas+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Engineering+in+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Sample preparation, preservation, and storage for volatile fatty acid quantification in biogas plants.</a> Engineering in Life Sciences. 17 (2), 132-139 (2017).</li>
<li>Bashiri, G., Rehan, A. M., Greenwood, D. R., Dickson, J. M. J., Baker, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+engineering+of+cofactor+F420+production+in+Mycobacterium+smegmatis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Metabolic engineering of cofactor F420 production in Mycobacterium smegmatis.</a> PloS one. 5 (12), 15803(2010).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

להערכת קופקטור F420 מתרביות טהורות מתנוגניות, ניתן לבצע הערכה מיקרוסקופית כדי לדמיין את הצמיחה והפעילות (מיקרוסקופיה פלואורסצנטית) של המיקרואורגניזמים המעורבים (איור 1). עבור דגימות הנובעות מסביבות טבעיות, השימוש במיקרוסקופיה כדי לזהות או לכמת F420 מוגבל עקב הפרעות עם מיקרואורגניזמים פלואורסצנטיים אחרים, חלקיקים אורגניים ולא אורגניים. בהקשר זה, מיצוי F420 וניתוח פלואורומטרי לאחר מכן באמצעות HPLC, כפי שתואר קודם לכן5, יכול לא רק לספק מי...

F420 הוא קופקטור נפוץ אך מוזנח לעתים קרובות, המתפקד כנשא הידריד דו-אלקטרוני מחייב בתהליכים מטבוליים ראשוניים ומשניים של ארכיאה וחיידק1,2. F420 הוא 5-דיזפלבין ודומה מבחינה מבנית flavins, לפי תכונותיו הכימיות והביולוגיות דומים יותר עם אלה של NAD + או NADP +. בשל החלפת חנקן עם פחמן במיקום 5 של טבעת isoalloxazine, הוא רדויטנט חזק, ובכך מציג פוטנציאל redox סטנדרטי נמוך של -340 mV1,3. F420 כולל טבעת 5-דיזפלבין ומקשר 2-phospho-L-לקטט (F420-0). זנב אוליגלוטאמט המכיל n+1 מונומרים גלוטמט יכול להיות מחובר למולקולה (F420-n +1)4.
במשך זמן רב, F420 קופקטור היה קשור אך ורק עם ארכאיה ו Actinobacteria. זה התהפך ברובו. ניתוחים אחרונים גילו כי F420 מופץ בין אורגניזמים אנאירוביים ואירוביים מגוונים של פילה פרוטאובקטריה, כלורופלקסי, וייתכן ש- Firmicutes המאכלסים מספר עצום של בתי גידול כמו קרקעות, אגמים, והמעיים האנושיים1,5. בשנת 2019, בראגה ואח'6, הראו כי פרוטאובקטריום Paraburkholderia rhizoxinica מייצר נגזרת F420 ייחודית, המכילה 3-פוספוגליצרט במקום זנב 2-פוספט, אשר עשוי להיות נפוץ בבתי גידול שונים. בתוך התחום Archaea, F420 נמצא במספר שושלות, כולל methanogenic7, מתאנוטרופיק8,9, והזמנות להפחתת גופרית10, והוא אמור להיות מיוצר Thaumarchaeota11. F420 ידוע בעיקר בשם קואנזים אדום חיוני במתנוגנזה מינוטרופית ומתילוטרופית. הצורה המופחתת של F420 (F420H2) מתפקדת כתורמת אלקטרונים להפחתת מתילנטרהידרומתנופטרין (מתילן-H4MPT, מר) ומתניל-H4MPT12,13. זה יכול לשמש גם כנשא אלקטרונים במסלולי הובלת אלקטרונים עצמאיים H2 של מתנוגנים המכילים ציטוכרום12,14. יתר על כן, הצורה החמצונית של F420 יש פלואורסצנטיות כחולה-ירוקה אופיינית עם עירור ב 420 ננומטר, אשר מאפשר זיהוי של מתנוגנים מיקרוסקופיים (איור 1). בשל פוטנציאל redox הנמוך שלה, F420 מאפשר (i) הפחתה אקסוגנית של ספקטרום רחב של תרכובות אורגניות סרבנות או רעילות אחרת, (ii) סינתזה של טטרציקלין ואנטיביוטיקה לינקוסמיד או פיטוטוקסינים בסטרפטומיאצטים (פילום אקטינובקטריה), ו -(iii) עמידות ללחץ חמצוני או ניטרוסטיבי או תנאים שליליים אחרים במיקובקטריה (פילום אקטינובקטריה)1,5,15, 16,17,18,19,20,21,22. כתוצאה מכך, חמצון תלוי F420 הם biocatalysts מבטיחים למטרות תעשייתיות ותרופות, כמו גם עבור תיווך ביולוגי של סביבות מזוהמות1,23. למרות הממצאים האחרונים, התפקידים המדויקים של F420 קופקטור עדיין ידועים בשוליים Actinobacteria או פילה חיידקי אחר.
ישנם לפחות שלושה מסלולים לביוסינתזה F4202,6,24. בהתחלה, מסלול הביוסינתזה מחולק לביוסינתזה של 5-דיזפלבין וענף חילוף חומרים של 2-פוספולקטאט. החלק הריאקטיבי של מולקולת F420 מסונתז באמצעות FO-סינתאז באמצעות טירוזין המצע ו 5-אמינו-6-ribitylamino-2,4(1H, 3H)-pyrimidinedione. התוצאה היא רמת הריבופלבין כרומופור FO. בתוך ענף חילוף החומרים לקטט המקובל כיום, L-לקטט הוא זרחן 2-phospho-L-לקטט על ידי קינאז L-לקטט (CofB); 2-פוספו-L-לקטט, בתורו, הוא guanylated ל L-לקטיל-2-דיפוספו-5'-גואנוסין על ידי 2-פוספו-L-לקטט guanylyltransferase (CofC). בשלב הבא, L-לקטיל-2-דיפוספו-5'-גואנוסין מקושר ל- FO על ידי טרנספראז 2-phospho-L-לקטט (CofD) ליצירת F420-02. לבסוף, האנזים F420-0:ɣ-גלוטמיל ליגאז (CofE) ליגאטות גלוטמט מונומרים ל- F420-0, ויוצר את קופקטור הסופי6 במספרים משתנים23,25. אורגניזמים שונים מראים דפוסים שונים במספר שאריות גלוטמט מחוברות, עם זנבות קצרים יותר שנמצאו עבור מתנוגנים מאשר mycobacteria2,25,26. בדרך כלל, מתנוגנים מראים אורך זנב משניים עד שלושה, עם עד חמישה מתנוגן אצטוקלסטי, מתנוזרצ'ינה sp., בעוד אורכי הזנב שנמצאו Mycobacterium sp. נע בין חמישה לשבע שאריות גלוטמט2,25,26,27. עם זאת, הממצאים האחרונים הראו כי F420 ארוך שרשרת נקשר חמצון תלוי F420 עם זיקה גבוהה יותר מאשר F420 קצר שרשרת; יתר על כן, F420 קשור שרשרת ארוכה מגביר את הזיקה מצע אבל מקטין את שיעור המחזור של אנזימים בהתאמה23.
זיהוי של קופקטור F420 מבוסס לעתים קרובות על הפלואורסצנטיות שלו. ובכך, נגזרי הגלוטמט אוליגו שלה הופרדו באמצעות שלב הפוך (RP)-HPLC27,28. לאחרונה, Ney ואח ' השתמש tetrabutylammonium הידרוקסיד כמו ריאגנט זיווג יונים עבור זנב גלוטמט טעון שלילי כדי לשפר את ההפרדה על RP-HLPC בהצלחה5. כאן, אנו מציגים שיטה להכנת דגימות, תמוגה לאחר מכן, מיצוי, טיהור, הפרדה וכימות של קופקטור F420 לא רק מתרבויות טהורות אלא גם מדגימות סביבתיות שונות (כלומר, קרקעות בוצה מעכל).

<table><tbody><tr><td>מערכת HPLC אוטוקלאב ביו-תואמת מצוידת במודול שיפוע, תנור וגלאי פלואורסצנטי</td><td>מערכת Shimadzu</td><td></td><td>HPLC</td></tr><tr><td></td> צנטריפוגה ורוטור ל-50 מ"ל "<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> בז" צינורות (11.000 rcf) וצינורות</td><td></td><td></td><td></td>מתאימים</tr><tr><td>עמוד HPLC: Gemini NX C18, 5 &mu; m, 150 x 3 מ"מ</td><td>Phenomenex</td><td></td><td>HPLC עמודה</td></tr><tr><td>PTFE מסנן PTFE (גודל נקבוביות 0.22 ומיקרו; m) להסרת חלקיקים לפני ניתוח</td><td></td><td></td><td></td>HPLC</tr><tr><td>שרף עבור SPE: Strata-X-AW 33 &mu; m כאניון חלש במצב מעורב סופג פולימרי</td><td>Phenomenex</td><td></td><td>אניון חלש במצב מעורב סעפת</td></tr><tr><td>ואקום עבור SPE וצינורות</td><td></td><td></td> איסוף מתאימים <td>ציוד SPE</td></tr><tr><td>מערבל</td><td></td><td></td><td></td> מערבולת</tr></tbody></table>

הפקת קופקטור f420 לניתוח אורך זנב פוליגלוטאמט מתרבויות טהורות מתנוגניות ודגימות סביבתיות

Extraction of Cofactor F420 for Analysis of Polyglutamate Tail Length from Methanogenic Pure Cultures and Environmental Samples

ה- F420 של קופקטור ממלא תפקיד מרכזי כנשא הידריד בחילוף החומרים העיקרי והמשני של מסה חיידקית וארכאלית רבים. קופקטור ידוע בעיקר בשל תפקידו במתנוגנזה, שם הוא מקל על תגובות קשות תרמודינמית. כמו הזנב polyglutamate משתנה באורך בין אורגניזמים שונים, ניתוחי פרופיל אורך עשוי להיות כלי רב עוצמה להבחנה ואפיון קבוצות שונות מסלולים בבתי גידול שונים. כאן, הפרוטוקול מתאר את החילוץ והאופטימיזציה של זיהוי F420 קופקטור על ידי החלת מיצוי שלב מוצק בשילוב עם ניתוח כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים ללא תלות בגישות ביולוגיות תרבותיות או מולקולריות. השיטה יושמה כדי לקבל מידע נוסף על הביטוי של קופקטור F420 מקהילות מיקרוביות בקרקעות, בוצה אנאירובית, ותרבויות טהורות, והוערכה על ידי ניסויים spiking. ובכך, המחקר הצליח לייצר פרופילים שונים באורך הזנב F420 עבור מתנוגנים מימנוטרופיים ואצטוקלסטיים בתרבויות טהורות מתנוגניות מבוקרות, כמו גם מדגימות סביבתיות כגון בוצה מעכל אנאירובי ואדמה.

תרבויות טהורות של מתנוזרצ'ינה תרמופילה ומתנוקולאוס תרמופילוס, שתיהן ארכאה מתנוגניות תרמופיליות, גדלו בתקשורת המתאימה כפי שתואר קודם לכן 29,30. עבור מתנוצרצ'ינה תרמופילה, מתנול שימש כמקור אנרגיה, ואילו Methanoculleus תרמופילוס גדל על H2 / CO2. הצמיחה נבדקה על ידי הערכה מיקרוסקופית, בעוד הפעילות נבדקה באמצעות מדידה של מתאן (CH4) על ידי כרומטוגרפיה גז כפי שתואר קודם לכן31...

שיטה להפקת קופקטור F420 מתרבויות טהורות הייתה מותאמת להפרדה וניתוח כרומטוגרפי נוזלי של אורך הזנב F420 בתרבות טהורה ודגימות סביבתיות.

הפקת קופקטור F420 לניתוח אורך זנב פוליגלוטאמט מתרבויות טהורות מתנוגניות ודגימות סביבתיות

The cofactor F420 plays a central role as a hydride carrier in the primary and secondary metabolism of many bacterial and archaeal taxa. The cofactor is ...

F420 קופקטור ממלא תפקיד חשוב בחילוף החומרים העיקרי והמשני של פרוקריוטים רבים. מדידת מולקולה זו בדגימות סביבתיות מאפשרת הבנה עמוקה יותר של שכיחותה ותפקודה. טכניקה זו מאפשרת ניתוח של קופקטור בחומרי מדגם קשים כגון בוצה ואדמה.ובכך התמוגה של החומר וטיהור מראש לפני הניתוח הם הצעדים המרכזיים. הפרוטוקול כולל שלבים שונים במהלך הכנת המדגם. שלבים אלה חייבים להיות מתוכננים ומוכנים היטב לפני שמתחילים בעיבוד לדוגמה.לדוגמה, הכנת מאגרים טריים חשובה. כדי להתחיל את תמיסת המדגם, למקם חמישה גרם של המדגם בצינור חרוט 50 מיליליטר. לאחר מכן להוסיף חמישה מיליליטר של 2X חיץ תמה לדגימות, ולהביא את הנפח ל 10 מיליליטר עם מים מזוקקים כדי להגיע לריכוז הסופי של 0.5 גרם למיליליטר.מערבולת הדגימות המדוללות במשך 20 שניות ואחריהן פירוק אוטומטי במשך 30 דקות ב-121 מעלות צלזיוס. עבור דגימות יבשות כמו אדמת יער, להביא לנפח סופי של 20 מיליליטר עם מים מזוקקים לאחר autoclaving, ואת מערבולת המדגם המדולל שוב במשך 20 שניות כפי שהוכח. ברגע שהדגימות מתקררות, צנטריפוגות הדגימה ליסאט במשך חמש דקות ב 11, 000 x g, ולאסוף את supernatant.הכן מיצוי שלב מוצק חמישה מיליליטר או עמוד SPE מלא 100 מיליגרם של אניון חלש במצב מעורב סורבט סורבט במצב מעורב מיזוג מחליף אניון עם שלושה מיליליטר של מתנול. לאחר מכן, ישיחל את מחליף האניון עם שלושה מיליליטר של מים מזוקקים. העמיסו עד תשעה מיליליטרים של הסופר-טבעי מהליסאט הצנטריפוגות אל עמוד ה-SPE.לשטוף ברצף את זיהומים מן הטור עם חמישה מיליליטר של אצטט אמוניה 25 מילימולר וחמישה מיליליטר של מתנול. לאחר הכביסה, לחמוק F420 קופקטור עם מיליליטר אחד של חוצץ elution. קבעו מראש את התנור ל-40 מעלות צלזיוס, והגדירו את גלאי הפלואורסצנטיות לאורך גל של 420 ננומטר ואורך גל פליטה של 470 ננומטר.לאחר מכן, סנן את הדגימה הנבהלת מה- SPE לבקבוקונים של HPLC באמצעות מסנן PTFE בגודל נקבובית של 0.22 מיקרון. הזרק 50 מיקרוליטרים של המדגם המסונן למערכת HPLC, והפרד את ה-F420 של קופקטור באמצעות מצב הדרגתי באמצעות שילוב של שלבים ניידים כמתואר בכתב היד. לנתח את קומפוזיציה F420 קופקטור וריכוז.הצמיחה של תרביות טהורות של מתנוגנים אומתה על ידי מיקרוסקופיה. במיקרוסקופיה של ניגוד פאזה, ניתן לראות אגלומרטים של מתנוגנים, הפולטים אור כחלחל כאשר קופקטור F420 מתרגש מאור אולטרה סגול. אזור השיא של קופקטור התאושש F420 לאחר SPE עם כרכים שונים של תרמופילוס Methanoculleus נותח.אסטרטגיית התפוררות האוטו-שעבוד השיגה את אזור השיא הגבוה ביותר, והגיעו ליעילות מיצוי מרבית באמצעות טיפול בטמפרטורת לחץ. ניתוח התפלגות אורך הזנב חשף את ההבדלים בריכוז הכולל של קופקטור F420 ואת התפלגות אורך הזנב F420 של תרביות מתנוגניות טהורות בדגימות סביבתיות. בעת החלת הליך זה, שים לב לאסוף לחלוטין את הנפח הכולל של מאגר ההתחמקות או להקליט את הנפח המדויק של זרימה דרך.טכניקה זו סוללת את הדרך לחקר קופקטור F420 בדגימות מורכבות יותר כמו קרקעות בוצה ומאפשרת תובנות עמוקות יותר על ההשפעה האקולוגית של מולקולה זו.

extraction-cofactor-f420-for-analysis-polyglutamate-tail-length-from

Research

JoVE Journal

Environment

סביבה

מיצוי חלבון עבור ניתוחים proteomic במינים פטרייתי דורש רמה גבוהה של סטנדרטיזציה כדי להתבצע על פי מידע המינימום על ניסוי (MIAPE) הנחיות proteomic. אנו מציגים וידאו פרוטוקול הכולל הליך מזעור הטיה במהלך הניסוי אינדוקציה רעלן והוצאה חלבון...

רעלן אינדוקציה ואת מיצוי חלבון מן Fusarium Spp. תרבויות ללימודי proteomic

תרכובות לכידת הם מולקולות קטנות trifunctional כדי להפחית את המורכבות של proteome על ידי תפקודית אינטראקציה הפיך מולקולות חלבון קטן ואחריו crosslinking-צילום טיהור. כאן אנו משתמשים מתחם לכידת...

פרופיל של Methyltransferases ועל אחרים S-Adenosyl- L-הומוציסטאין מחייב חלבונים על ידי ספקטרומטריית מתחם המיסה לכידה (CCMS)

DNA וחלבונים-במיוחד רצף שכותרתו עם זיקה או קבוצות כתב ניאון באמצעות methyltransferases DNA או חלבון ואנלוגים cofactor סינטטיים. בהתאם לסגולי כקו-הפקטורים של האנזימים, aziridine או אנלוגים cofactor מופעלים כפולים מועסקים תיוג אחת או שני שלבים.

תיוג רצף ספציפי של חומצות גרעין וחלבונים עם Methyltransferases ואנלוגים כקו-פקטורים

חומצות שומן פוספוליפידים לספק מידע על המבנה של קהילות חיידקי אדמה. אנו מציגים שיטות חילוץ מתוך דגימות קרקע בתערובת כלורופורם חד פאזיים, חלוקה של שומני חילוץ באמצעות עמודות מיצוי שלב מוצק, methanolysis לייצר אסטרים מתיל חומצות שומן, אשר מנותחים על ידי גז כרומטוגרפיה נימים.

הפקה וניתוח של פוספוליפידים מיקרוביאלית חומצות שומן בקרקעות

המאמר מתאר שיטה מגדילה את התפוקה תוך איזון המאמץ והדיוק של מיצוי שומנים מתוך קרום התא של מיקרואורגניזמים לשימוש באפיון שתי ליפידים סה"כ ואת השפע היחסי של שומנים מחוון כדי לקבוע מבנה הקהילה מיקרוביאלית הקרקע במחקרים עם דוגמאות רבות.

ליפיד הפקת וניתוח שיטה לאפיון קרקע חיידקים בניסויים עם דוגמאות רבות

פרוטוקול זה מתאר תהליך ניסוי לחקור באופן כמותי ומקיף על חילוף החומרים של מקורות מזון רבים. זרימת עבודה זו, המבוססת על שילוב של ניסויים מעקב איזוטרופי שגרת אנליטית, מאפשר את גורלו של חומרים מזינים נצרך המקור מטבולית של מולקולות synthetized על-ידי מיקרואורגניזמים נקבע.

זרימת עבודה המבוסס על השילוב של מעקב איזוטרופי ניסויים כדי לחקור את חילוף החומרים מיקרוביאלית של מקורות מזון רבים

פרוטוקול מוצג עבור חילוץ מטבוליטים, חלבונים ושומנים דגימת אדמה אחד בו זמנית, המאפשר דגימת מופחתת הכנה פעמים ולאפשר מולטי-omic ניתוחים ספקטרומטר מסה של דגימות עם כמויות מוגבלות.

פרוטוקול MPLEx עבור ניתוחים מולטי-omic של דגימות אדמה

פרוטוקול זה מתאר תפוקת יחיד של שיטות אנליטיות, טכנולוגיות משלימים לשיאה אפיון מלא-זוגי של חומר אורגני טבעי, פרוטאומיקס מיקרוביאלית של מערכות אקולוגיות. גישה זו מאפשרת השוואות חזקים לזיהוי מסלולים מטבוליים והעתקות חשוב המתאר הפקת גז חממה, חיזוי תגובות השינוי הסביבתי.

יחיד-תפוקה משלימים שיטות אנליטיות ברזולוציה גבוהה עבור אפיון תערובות מורכבות חומר אורגני טבעי

ביטוי וטיהור של הידרוקלז בתחום ההידרולז-מחשבים המכילים חלבונים מתוארים עם דוגמאות (ביטוי ב -E. coli, fplc). חלבונים מטוהרים משמשים התגבשות והפקת נוגדנים מועסקים עבור assays האנזים. התצוגה הנפתחת הנבחרת מוצגת כדי להציג את הפונקציונליות הרב של FAHD1 כמו הידרולואצטט decarboxylase ו acylpy, ההידרולז.

ביטוי, טיהור, התגבשות ואנזים אנזימים המכילים חלבונים בתחום הידרוקלז

הפרוטוקול הנוכחי מתאר מיצוי של חומצות אמינו שאינן חלבוניות ממטריצות ביולוגיות באמצעות משקעי חלבון חומצה טריכלורואצטית (TCA) והידרוליזה חומצית לפני ניתוח באמצעות ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה נוזלית-טנדם.

מיצוי חומצות אמינו שאינן חלבוניות מציאנובקטריה לכרומטוגרפיה נוזלית-ניתוח ספקטרומטריית מסה טנדם

פרוטוקול זה מתאר שיטת חילוץ חומצה-ממס דו-פאזית לבידוד חומצות שומן קצרות שרשרת מדגימות צואה עכבריות בעלות קלט נמוך ללא גזירה.

הפקת חומצות שומן קצרות שרשרת מצואת עכברים באמצעות שיטת חומצה-ממס דו-פאזית

למדו שיטה מותאמת להפקת קופקטור F420 מדגימות סביבתיות ומתרבויות טהורות. הפרוטוקול משלב כרומטוגרפיה נוזלית וניתוח אורך זנב לחקר מטבוליזם פרוקריוטי.

הפקת קופקטור _F420 לניתוח אורך זנב פוליגלוטאמט מתרבויות טהורות מתנוגניות ודגימות סביבתיות

גלה סרטונים נוספים