改进酶保护测定法研究 金黄色葡萄球菌 内化和抗菌化合物的细胞内效

酶保护测定能够研究金黄色葡萄球菌内化的程度及其在贴壁细胞内存活的能力，以及抗菌化合物的功效。改进的酶保护测定大大简化了技术处理，并能够从弱贴壁细胞和悬浮细胞中回收内化细菌。演示该程序的将是Josselin Rigaill，我实验室的医学博士和博士生。

在感染测定前两天，以2.0倍于24孔板每孔孔每孔10至第五个细胞的密度接种A549上皮细胞，并在5%二氧化碳中以36摄氏度孵育细胞48小时，直到它们达到100%汇合。在测定当天，从专用于计数A549细胞的三个孔中取出并丢弃用过的培养基，并加入一毫升完整感染培养基，每毫升含有5微克Hoechst 33342和每毫升碘化丙啶一微克。将细胞孵育30分钟，然后使用宽视场荧光显微镜计数细胞数量并计算细胞活力。

为了准备细菌悬浮液，在管中分配25毫升完整的感染培养基，并在36摄氏度下预热。接下来，使用细胞密度计将金黄色葡萄球菌悬浮液调节到完整感染培养基中的OD为0.5，然后通过在整个感染培养基中稀释培养物来制备20毫升用于细胞接种的细菌悬浮液，以根据每孔的细胞数达到1的MOI。接下来，使用自动螺旋压板机，确定用于细胞接种步骤的稀释细菌悬浮液的金黄色葡萄球菌负荷，并在36摄氏度下孵育琼脂平板18至24小时。

第二天，用菌落计数器计算菌落的数量，以计算每个测试菌株的准确MOI。在细胞接种之前，通过低倍显微镜观察24孔板的每个孔，以确保细胞健康并按预期生长，然后从24孔板中取出并丢弃用过的细胞培养基，并向每个含有100%汇合细胞的孔中加入500微升细菌悬浮液。将细胞在36摄氏度下在5%二氧化碳中孵育两个小时。

为了使用改进的酶保护测定法定量细胞内细菌，如文本手稿中提到的，在工作溶液中制备4x裂解缓冲液，2%Triton X-100，胰蛋白酶-EDTA和溶菌素原液。接下来，通过将6毫升完全感染培养基加入250微升溶菌素工作溶液来制备6.25毫升补充有溶菌素的完整感染培养基。然后，将250微升补充有溶菌素的完整感染培养基加入每个孔中，并通过用手旋转板轻轻搅拌板。

为了使溶菌素杀死细胞外细菌，将细胞在36摄氏度下在5%二氧化碳中孵育一小时，然后通过向每个孔中加入10微升每毫升20微克的蛋白酶K并在室温下孵育细胞两分钟来灭活溶溶脂素。接下来，加入250微升4x裂解缓冲液，通过渗透性休克裂解细胞，并在36摄氏度下孵育细胞10分钟。孵育后，将细胞裂解物上下移液几次，以确保细胞完全裂解和匀浆，然后使用自动螺旋压板机确定每个孔的金黄色葡萄球菌负荷，并在36摄氏度下孵育琼脂平板18至24小时。

第二天，用菌落计数器计算菌落的数量，以计算每个孔的细胞内金黄色葡萄球菌负荷。这里描述了A549上皮细胞对金黄色葡萄球菌的两种菌株的内化。使用包括洗涤以去除溶菌素的酶保护测定法，SF8300野生型和缺乏fnbA和B基因的等基因突变体的平均细胞内载量分别为每毫升4.46和0.49 log cfu。

使用使用蛋白酶K灭活溶菌素的改进酶保护测定法，负载分别为每毫升4.53和0.56 log cfu。这里描述了使用酶保护测定法测量的万古霉素，利福平和左氧氟沙星对金黄色葡萄球菌的细胞内活性。对照的平均细胞内载量为每毫升4.57 log cfu，万古霉素为4.51，利福平为3.03，左氧氟沙星为2.91。

强化洗涤以去除酶往往会分离感染最多的细胞，这可能会产生不准确的结果并支持使用改进的方案。改进的酶保护测定法使研究金黄色葡萄球菌内化与类器官更容易，并且可以很容易地适应高内涵筛选系统，该系统通过放置