通过胸腺肾包膜移植、CD34+ 细胞注射及细胞因子递送制备人源化小鼠

摘要

人源化小鼠模型能够更准确地模拟人类免疫微环境。本文描述了通过移植人类胸腺组织、注射人类CD34⁺细胞，并靶向递送人类细胞因子转基因以促进CD34⁺细胞增殖与分化的途径来构建此类模型的过程。

摘要

动物模型为转化研究提供了至关重要的桥梁 体外 和 体内 生物医学研究。人源化小鼠模型为人源系统的表征提供了桥梁，从而能够更准确地研究发病机制、生物标志物以及许多其他科学问题。在本方法中，将免疫缺陷型 NOD-scid IL2Rγnull（NSG）小鼠植入自体胸腺，并注射肝脏来源的 CD34⁺ 细胞，随后通过一系列注射递送细胞因子。与其他类似模型相比，本模型通过AAV8或基于DNA的pMV101载体编码的转基因递送细胞因子和生长因子，促进了免疫细胞更佳的重建效果。此外，该模型具有长期稳定性，经重建的小鼠在CD34⁺ 注射。通过该模型，我们希望提供一种稳定且具有显著效果的方法，用于在小鼠模型中研究免疫治疗和人类疾病，从而表明对可预测性临床前模型的需求。

引言

尽管动物模型加深了人们对细胞和分子系统的理解，但在阐明物种特异性系统（如免疫、生理学及其他病理学领域）的复杂性方面，挑战依然存在。历史上，非人灵长类动物（NHP），如黑猩猩，曾被用于弥补模型研究中的不足；然而，NHP 模型成本高昂且难以获取，尤其是在欧洲已禁止使用这类动物的情况下¹。

在成功进行移植手术后，小鼠系统可重建人类免疫系统，这一点已通过淋巴器官的细胞重聚现象得到证实。具有功能性人类免疫系统的小鼠的开发，为在多种情境下开展人类免疫学的转化研究提供了机会。通过将人类细胞和组织移植到免疫缺陷小鼠体内，可成功重建具有功能的人类免疫系统，从而促进对造血作用、免疫学、基因治疗²、传染病³、癌症⁴以及再生医学⁵的研究。我们课题组及部分合作者已发表利用该模型开展的研究成果，建立了皮肤黑色素瘤的临床前模型⁶。该模型具有高度的通用性，可广泛应用于黑色素瘤及免疫治疗研究之外的众多研究领域。

外周血单个核细胞（PBMCs）常用于人源化，因其可有效重建在免疫耐受中具有明确作用的T细胞；然而，由于PBMCs自我更新能力较低且含有大量已定向分化的成熟细胞系，....

方案

所有涉及动物使用的实验方案均受到威尔斯塔研究所机构动物护理与使用委员会（IACUC）的严格监督。本实验室遵循该委员会及驻场兽医制定的指导方针，以确保所用动物的健康、安全与福利。在实施本方案之前，必须获得兽医和IACUC的批准；根据上述动物福利相关方的建议，操作人员在具体手术技术和动物操作方面可对本方案进行适当调整。

注意：组织样本可冷冻保存，直至准备使用。此外，CD34⁺ 分离可在肾移植手术当天或次日进行。此信息将决定白消安的注射时间：若计划在分离当天进行手术，则应在接收组织前预先注射白消安以作准备。对30只5至7周龄的雌性NSG小鼠进行处理，每只注射30 mg/kg（100 µL，1x PBS）新鲜配制的骨髓清除药物白消安，腹腔注射，于手术前24小时给予。

1. CD34⁺ 细胞的分离

1. 通过将 100 mg 胶原酶/分散酶溶解于 50 mL RPMI1640 中来制备消化液。使用 0.22 µm 真空滤器对消化液进行灭菌。
2. 将胎肝（>20 周龄）置于 50 mL RPMI1640 培养基中。吸除并弃去培养基，仅在含有肝脏的试管中保留 10 mL。
3. 在 50 mL 锥形管中，用含 100 µg/mL 抗生素 Primocin 的 RPMI1640 溶液洗涤组织两次，每次洗涤后抽吸去除培养基。抽吸前务必让组织....

结果

在成功手术及适当的术后注射后，CD34⁺ 可通过流式细胞术确认分化情况。手术后约8周，对小鼠进行采血以准备进行FACS检测，此后每2周重复一次，直至人源免疫细胞达到此前所述的特定阈值¹⁰简而言之，使用涂有锂和肝素的采血管收集100 mL血液。采用ACK裂解缓冲液裂解红细胞后，细胞用FACS缓冲液（磷酸盐缓冲液、2% FBS和0.1%叠氮化钠）洗涤并离心。将细胞沉淀重悬于100 mL FACS缓冲液中，随后与一组抗体（抗小鼠CD45、抗人CD45、抗CD3、抗CD4、抗CD8和抗CD20）孵育。为区分活细胞与死细胞，使用DAPI对细胞进行染色，并根据FSC-A和SSC-A参数设门圈选淋巴细胞。首先设门筛选活细胞，再从中选择单细胞。在该单细胞活淋巴细胞群体中，我们首先区分人源与小鼠源CD45⁺ 细胞。CD20⁺ 和 CD3⁺ 细胞从人 CD45 中鉴定得出⁺ 细胞，最后是 CD4⁺ 和 CD8⁺ 细胞从 CD3 中被鉴定出来⁺

讨论

本文描述了通过将人胎儿胸腺移植至肾包膜下，并随后注射CD34⁺细胞，以重建人免疫系统，从而制备人源化小鼠的方法。

尽管该实验方案旨在构建最佳模型，但某些步骤对实验成功至关重要。例如，在CD34⁺细胞分离过程中，操作者必须能够在显微镜下准确识别CD34⁺细胞。尽管这看似多余，但由于这些细胞的形态特征，自动计数仪并不总能正确识别它们，仪器本身还可能将碎片误判为阳性细胞。因此，手动识别这些细胞至关重要。此外，在肾包膜移植手术中，必须确认胸腺组织确实已进入肾包膜。这一过程可通过视觉观察或触诊来判断：术者应能感觉到胸腺组织片已进入肾脏包膜内。

值得注意的是，该过程存在一些需要注意的事项，这些事项可能决定模型的成败。首先，必须对胎儿组织的质量进行个体化评估，以确定分离出的细胞是否可能对小鼠产生毒性。例如，孕龄超过20周的组织通常质地更坚实，在制备过程中切割更为精确，且降解程度通常较低。这些特征是一般意义上组织质量更优的指标。该技术的第二个注意事项涉及CD34⁺

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ACK 裂解缓冲液	Life Technologies Corporation
BD 微量采血管	BD		血液采集管
白消安	Sigma	B2635-25g	照射药物；对光敏感
CD34 磁珠	Miltenyi Biotec	130-046-702	抗体磁珠试剂盒；储存于 4 °C
CKIT	Aldevron	custom	细胞因子；储存于 -20 °C
胶原酶/分散酶	Roche Diagnostics	11097113001	储存于 4 °C
FcR 封闭试剂	Miltenyi Biotec	130-046-702	抗体磁珠试剂盒；储存于 4 °C
胎儿组织（肝脏和胸腺）	Advanced Bioscience Resources		当日或次日送达
菲可（Ficoll）	GE Healthcare	17-1440-03	室温储存
FLT3	Aldevron	125964	细胞因子；储存于 -20 °C
镊子	Various	Various
Hamilton 注射器针头	Various	Various	22 G；三点式；2" 长度
止血钳	Various	Various
MS 柱	Miltenyi Biotec	130-042-201	磁性分离柱
PBS	Gibco	14190-136	室温储存
普利霉素	Invivogen	amt-pm1	抗生素；储存于 4 °C
RPMI 培养基	Corning	10-040-CM	储存于 4 °C
SCF	Aldevron	125962	细胞因子；储存于 -20 °C
手术剪	Various	Various
THPO	Aldevron	125963	细胞因子；储存于 -20 °C
组织处理用培养皿	Corning	430167
VetBond 粘合剂	3M	1469SB	粘合剂
Visorb 可吸收缝线	Stoelting Co	5046	可吸收缝线，4 号，19 mm 切割针