Een high-yield streptomyces transcriptie-vertaling toolkit voor synthetische biologie en natuurlijke producttoepassingen

Ons protocol biedt een vereenvoudigde workflow voor Streptomyces venezuelae celvrije transcriptie-vertaling. Ons systeem maakt gebruik van de metabole enzymen en routes van dit niet-modelorganisme. De belangrijkste voordelen zijn de heterologe expressie van genen met een hoog GC-gehalte, het verstrekken van een gunstige eiwitdoorstuuromgeving en een open systeem voor het finetunen van biosynthetische routes.

Onze methode zal nieuwe mogelijkheden bieden voor het bestuderen van Streptomyces en gerelateerde hoge GC-bacteriën. Het maakt het mogelijk om enzymen en genexpressie in deze bacteriën te bestuderen. Deze techniek is ontwikkeld voor eenvoudige implementatie door nieuwe gebruikers.

De enige stap die voorafgaande ervaring of vertrouwdheid vereist, is ultrasoonapparaat om zeer actieve ruwe extracten te produceren. Om te beginnen met het oogsten van de voorgekweekte cellen op de derde dag, verdunt u de nachtcultuur in de verhouding van één op 10 met een vers GYN-medium voor de optische dichtheid of OD-meting bij 600 nanometer. Als de OD van de cultuur op 600 nanometer minder dan 0,3 is, verhoog dan de schudsnelheid tot 250 tot 300 rotaties per minuut en groei totdat een OD 0,3 bereikt.

Groei niet langer dan twee uur extra. Als de OD groter is dan 0,3, breng de culturen dan over in centrifugatiecontainers en koel snel af op nat ijs gedurende 30 minuten. Terwijl u wacht tot de celcultuur is afgekoeld, bereidt u vier milliliter verse één molaire dithiothreitol, S30A en S30B buffers voor en houdt u ze op ijs.

Na het wegen van een lege centrifugebuis van 50 milliliter, koelt u deze voor bij min 20 graden Celsius. Voeg twee milliliter van één molaire dithiothreitol toe aan een liter S30A-buffer op ijs en meng goed. Centrifugeer de cellen op 6.000 keer G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius.

Nadat u het supernatant in een snelle beweging hebt weggegooid, voegt u 250 milliliter S30A-buffer toe en resuspendeert u de cellen door de centrifugatieflessen krachtig te schudden totdat de celklonten homogeen zijn gedispergeerd. Centrifugeer de cellen vervolgens opnieuw gedurende zes minuten. Gooi na het centrifugeren het supernatant weg en herhaal de toevoeging van de S30A-buffer, gevolgd door centrifugering zoals aangetoond.

Voeg vervolgens twee milliliter van één kies DTT toe aan een liter S30B-buffer op ijs en meng goed. Voeg 250 milliliter S30B-buffer toe aan de cellen en herhaal de centrifugatie. Resuspend de celkorrel in 10 milliliter S30B-buffer en breng de celsuspensie over naar de voorgewogen voorgekoelde centrifugebuis van 50 milliliter.

Breng indien nodig de restcellen over met nog eens vijf tot 10 milliliter S30B-buffer en vul de buis tot 50 milliliter volume met S30B. Centrifugeer de cellen gedurende 10 minuten. Gooi het supernatant weg en herhaal de centrifugering bij eerdere instellingen zoals gedemonstreerd.

Na het weggooien van het supernatant, aspiraleer je het resterende S30B-supernatant met een pipet van 100 tot 200 microliter en weeg je de natte celkorrel. Voeg voor elke gram natte cellen 0,9 milliliter S30B-buffer toe. Resuspend de cellen met behulp van een Pasteur pipet of vortex.

Centrifugeer kort gedurende ongeveer 10 seconden tot 500 G om de cellen te bezinken. Laat de sonicatorpunt in de celsuspensie zakken totdat de punt zich ongeveer een centimeter onder het vloeistofoppervlak bevindt. Voer verschillende parameters in de sonicatorinstellingen in.

Stel de frequentie in op 20 kilohertz, amplitude op 65% puls aan en uit tijd tot 10 seconden en totale ultrasoonapparaattijd op één minuut. Begin met ultrasoonapparaat en beweeg de buis omhoog of omlaag en zijwaarts tijdens de eerste twee rustcycli om ervoor te zorgen dat de cellen gelijkmatig worden gesoniseerd. Als de cellen niet volledig zijn gelyseerd, keert u de buis twee tot drie keer om en herhaalt u de ultrasoonapparaat voor nog een of twee cycli van 10 seconden met frequent mengen totdat de cellen volledig zijn verstoord.

Centrifugeer de geloot cellen om het celafval te verwijderen en breng het supernatant vervolgens over in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter als aliquot van één milliliter. Voor de afvloeiingsreactie van de celextracten, incubeer de cel met het celextract bij 30 graden Celsius gedurende 60 minuten op een warmteblok of in de incubator zonder een shaker. Ontdooi voor de transcriptie-translatiereactie het celextract SMM of MES-oplossing en plasmide-DNA op ijs.

Pre-chill een 384-well plaat bij min 20 graden Celsius. Stel de transcriptie-translatiereactie in op het ijs, waarbij 25% van het volume plasmide-DNA is, 33,33% celextract en 41,67% SMM-oplossing. Vortex het mengsel voorzichtig gedurende ongeveer vijf seconden op een lage snelheidsinstelling om ervoor te zorgen dat de oplossing homogeen is en vermijd schuimvorming of bubbelvorming.

Breng drie aliquots van 10 microliter over in drie putten van een 384-putplaat als een technisch drievoud zonder luchtbellen te introduceren. Nadat u de plaat met een transparante afdekking hebt afgedicht, draait u de plaat gedurende vijf seconden op 400 maal G en incubeert u de reactie bij 28 graden Celsius in een incubator of een plaatlezer zonder te schudden. Streptomyces venezuelae celvrije transcriptie-translatie werd geoptimaliseerd voor high yield expressie van fluorescerende eiwitten uit het pTU1-A-SP44 standaard plasmide, evenals biosynthetische enzymen gedetecteerd door gel elektroforese.

De expressie van het pTU1-A-SP44-mScarlet-I standaard plasmide werd gemeten met behulp van verschillende methoden. De real-time fluorescentiemetingen van mRNA met behulp van het dBroccoli RNA aptamer, onrijp mScarlet-I eiwit met behulp van het FlAsH tag systeem en volwassen mScarlet-I eiwit werden uitgevoerd. De in-gel fluorescentiekleuring van mScarlet-I met behulp van FlAsH-tag werd uitgevoerd naast de Coomassie Blue-kleuring van het totale celvrije eiwit.

Na deze procedure kunnen activiteitstests worden uitgevoerd om enzymen en routes te bestuderen die uitdagend zijn met behulp van standaardmethoden. Het strekt zich ook uit tot opgeschaalde biosynthese en genexpressie met hoge doorvoer. We ontwikkelen deze techniek om metabole enzymen van bacteriën met een hoog GC-gehalte te bestuderen.

We hebben het potentieel van ons systeem aangetoond om opgeschaalde biosynthese in celvrije reacties te bestuderen.