Name: Chemilumineszenz-basierte Assays zum Nachweis von Stickstoffmonoxid und seinen Derivaten aus Autoxidation und nitrosierten Verbindungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie chemilumineszenzbasierte Assays zur hochempfindlichen Detektion von Stickstoffmonoxid und seinen Metaboliten in biologischen Proben einsetzen. Diese Methode ermöglicht präzise Messungen für therapeutische Forschung.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Die in diesem Manuskript berichteten Protokolle wurden durch die gesammelten Beiträge früherer Stipendiaten von Dr. Warren Zapols Labor für Anästhesieforschung in der Intensivmedizin, Abteilung für Anästhesie am Massachusetts General Hospital, ermöglicht. Wir danken Dr. Akito Nakagawa, Dr. Francesco Zadek, Dr. Emanuele Vassena, Dr. Chong Lei, Dr. Yasuko Nagasaka, Dr. Ester Spagnolli und Dr. Emanuele Rezoagli.

L.B. erhält Gehaltsunterstützung von K23 HL128882/NHLBI NIH als Principal Investigator für seine Arbeit an Hämolyse und Stickoxid. LB erhält Zuschüsse von "Fast Grants for COVID-19 research" am Mercatus Center der George Mason University und von iNO Therapeutics LLC. B.Y. wird durch Zuschüsse von einem NHLBI/#R21HL130956 und DOD/The Geneva Foundation (W81XWH-19-S-CCC1, Log DM190244) unterstützt. B.Y. erhielt bei MGH Patente auf die elektrische Erzeugung von Stickstoffmonoxid.
L.B. und B.Y. haben eine Patentanmeldung für NO delivery bei COVID-19-Krankheit eingereicht PCT-Anmeldenummer: PCT/US2021/036269 eingereicht am 7. Juni 2021. RWC erhält Gehaltsunterstützung von Unitaid als Hauptprüfer für die Technologieentwicklung zur dezentralen Diagnose von Tuberkulose bei Kindern in ressourcenarmen Umgebungen.

Aufgrund der hohen Sensitivität haben Chemilumineszenz-basierte Assays zur Bestimmung von NO und verwandten Verbindungen ein hohes Risiko einerNO2-Kontamination. Jedes Reagenz (insbesondere die NO-2-Blockierungslösung) und jedes Verdünnungsmittel (einschließlich ddH 2 O), das im Experiment verwendet wird, sollte auf seinenNO-2-Gehaltgetestet werden, um das Hintergrundsignal zu korrigieren. Nitrit ist extrem reaktiv mit einer Halbwertszeit im Vol...

<table><tbody><tr><td>Essigsäure</td><td>Sigma</td><td>45754</td><td>500 mL - flüssig</td></tr><tr><td>Antifoam B Emulsion</td><td>Sigma</td><td>A5757</td><td>250 mL - flüssig</td></tr><tr><td>DETA NONOate</td><td>Cayman</td><td>82120</td><td>10 mg</td></tr><tr><td>Gibco DPBS (1x) kein Calcium, kein Magnesium</td><td>ThermoFisher</td><td>14190144</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Salzsäure 37% (1 M)</td><td>Sigma</td><td>258148</td><td>500 mL - flüssig</td></tr><tr><td>Jod</td><td>SAFC</td><td>207772</td><td>100 g - fest</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimtech</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Quecksilber (II) Chlorid ACS Reagenz> 99,5%</td><td>Sigma</td><td>215465</td><td>100 g - fest (in Wasser löslich)</td></tr><tr><td>Mili-Q Wasseraufbereitungssystem</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Modell 705 RN 50 &mu; L Spritze</td><td>Hamilton</td><td>80530</td><td>Mikroliter Spritze</td></tr><tr><td>Modell 802 N 25 &mu; L Spritze</td><td>Hamilton</td><td>84854</td><td>Mikroliter-Spritze</td></tr><tr><td>N-Ethylmaleimid</td><td>Sigma</td><td>4260</td><td>25 g - kristalliner</td></tr><tr><td>Stickstoffmonoxid-Analysator + Bundle Software - Spülgefäß</td><td>Zysense</td><td>NOA 280i</td><td>Chemilumineszenz-Detektor</td></tr><tr><td>Nonidet p-40&nbsp; (NP-40)</td><td>ThermoFisher</td><td>85125</td><td>10% - 500 mL</td></tr><tr><td>Kaliumhexacyanoferrat (III) ACS Reagenz > 99%</td><td>Sigma</td><td>244023</td><td>100 g - Pulver</td></tr><tr><td>Kaliumiodid ACS Reagenz> 99%</td><td>Sigma</td><td>221945</td><td>100 g - festes</td></tr><tr><td>Kaliumnitrit-Kristall. Für die Analyse: EMSURE ACS</td><td>Supelco</td><td>105067</td><td>250 g - kristallin</td></tr><tr><td>PowerGen 125</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-359-251</td><td>Mechanischer Homogenisator</td></tr><tr><td>RV3 Zweistufige Drehschieberpumpe</td><td>Edwards</td><td>A65201906</td><td>Vakuumpumpe - Gebündelt mit Analysator</td></tr><tr><td>Natrium-Heparin - BD Hemogard Clo</td><td>BD Biosciences</td><td>BD367871 75 USP-Einheiten</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid wasserfreies ACS-Reagenz &ge; 97%</td><td>Sigma</td><td>795429</td><td>1 kg - Pellets</td></tr><tr><td>Natriumnitrat ACS Reagenz > 99%</td><td>Sigma</td><td>221341</td><td>500 g - Pulver</td></tr><tr><td>Natriumnitrit > 99%</td><td>Sigma</td><td>S2252</td><td>500 g - kristallines</td></tr><tr><td>Sulfanilamid > 98%</td><td>Sigma</td><td>S9251</td><td>100 g - fest</td></tr><tr><td>Vanadium (III) Chlorid</td><td>Sigma</td><td>112393</td><td>25 g - fest - Achtung (exotherm)</td></tr><tr><td>Whatman 1 Filterpapier</td><td>Sigma</td><td>WHA10010155</td><td></td></tr></tbody></table>

chemilumineszenz-basierte assays zum nachweis von stickstoffmonoxid und seinen derivaten aus autoxidation und nitrosierten verbindungen

Chemiluminescence-based Assays for Detection of Nitric Oxide and its Derivatives from Autoxidation and Nitrosated Compounds

Die Aktivität von Stickstoffmonoxid (NO) in vivo ist das kombinierte Ergebnis seiner direkten Wirkungen, der Wirkung seiner Derivate, die durch NO-Autoxidation erzeugt werden, und der Wirkung von nitrosierten Verbindungen. Die Messung von NO-Metaboliten ist für die Untersuchung der NO-Aktivität sowohl auf Gefäßebene als auch in anderen Geweben unerlässlich, insbesondere in den experimentellen Umgebungen, in denen exogenes NO verabreicht wird. Ozonbasierte Chemilumineszenz-Assays ermöglichen präzise Messungen von NO- und NO-Metaboliten sowohl in Flüssigkeiten (einschließlich Plasma, Gewebehomogenaten, Zellkulturen) als auch in Gasgemischen (z. B. ausgeatmeter Atem). NO reagiert mit Ozon, um Stickstoffdioxid in einem angeregten Zustand zu erzeugen. Die daraus resultierende Lichtemission ermöglicht die Photodetektion und die Erzeugung eines elektrischen Signals, das den NO-Gehalt der Probe reflektiert. Aliquots aus derselben Probe können verwendet werden, um spezifische NO-Metaboliten wie Nitrat, Nitrit, S-Nitrosothiole und Eisen-Nitrosyl-Komplexe zu messen. Darüber hinaus wird NO, das von zellfreiem Hämoglobin verbraucht wird, auch mit der Chemilumineszenzanalyse quantifiziert. Eine Illustration all dieser Techniken wird zur Verfügung gestellt.

Der NO-Verbrauch durch zellfreien Hb-Assay wurde in Proben verwendet, die bekannte Konzentrationen von zellfreiem oxyHb enthielten (Abbildung 4). Da ein Häm von oxyHb stöchiometrisch ein NO-Molekül im Assay freisetzt, wird gereinigtes zellfreies oxyHb verwendet, um die Kalibrierkurve für den Assay zu erstellen (Ergänzende Abbildung 3).
Die Dosis-Wirkungs-Beziehung zwischen zellfreiem Hb (gemessen mit einem kolorimetrischen Assay) und NO-Verbrauch ...

Hier stellen wir Protokolle zum Nachweis von Stickstoffmonoxid und seinen biologisch relevanten Derivaten mittels Chemilumineszenz-basierter Assays mit hoher Sensitivität vor.

Chemilumineszenz-basierte Assays zum Nachweis von Stickstoffmonoxid und seinen Derivaten aus Autoxidation und nitrosierten Verbindungen

Nitric oxide (NO) activity in vivo is the combined results of its direct effects, the action of its derivatives generated from NO autoxidation, and the ...

Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern, einen Chemilumineszenzdetektor für die Messung von Stickstoffmonoxidmetaboliten kompetent zu verwenden, ohne die Anleitung oder die Kosten für die Beschäftigung von engagiertem Personal vor Ort. Der Chemilumineszenz-basierte Assay ist die empfindlichste Methode, um minimale Veränderungen der Stickoxidspiegel und seiner Metaboliten in einer bestimmten biologischen Probe nachzuweisen. Inhaliertes Stickstoffmonoxid ist ein therapeutisches Gas, das für eine Vielzahl von Krankheiten verwendet wird.Es ist von entscheidender Bedeutung, dass das Fortschreiten und die Genesung der Krankheit genau mit den Stickoxid-Metabolitenspiegeln korreliert werden. Inhalatives Stickstoffmonoxid, ein antimikrobielles Mittel, ist vielversprechend bei der Behandlung von Patienten mit Atemwegsinfektionserkrankungen. Die Chemilumineszenzmethode liefert Einblicke in die Korrelation der Stickstoffmonoxiddosis und ihrer Metaboliten mit mikrobiologischen und pathophysiologischen Veränderungen.Um die DETA-NONOat-Lösung herzustellen, fügen Sie 10 Milligramm DETA-NONOat zu 610 Mikrolitern 10-Millimolar Natriumhydroxid in PBS mit einem pH-Wert von 7,4 hinzu, um 100 Millimolar DETA-NONOate zu erzeugen und es auf Eis zu halten. Um fortzufahren, schließen Sie die Sauerstoffleitung an den Chemilumineszenzdetektor an und öffnen Sie den Sauerstofftank mit einem Druck gemäß den Anweisungen des Herstellers im Text. Schließen Sie dann die dielektrische Intensivfeldfilterleitung an den Chemilumineszenzdetektor an.Starten Sie an der Schnittstelle des Chemilumineszenzdetektors das Detektionsprogramm für Flüssigphasenassays, um sicherzustellen, dass die Sauerstoffversorgung ausreichend ist, und der Detektor beginnt mit der Probenahme, was die Erkennung durch Signal in Millivolt anzeigt und andernfalls ein negatives Diagnosesignal auslöst. Um das Spülschiff vorzubereiten, schließen Sie das Spülgefäß an allen drei Anschlüssen, indem Sie das Nadelventil vollständig nach rechts schrauben und die Einlass- und Auslassbremshähne schließen. Entfernen Sie die Kappe vom Spülgefäß.Fügen Sie der Reaktionskammer eine ausreichende Menge des für den geplanten Assay spezifischen Reagenzes hinzu, damit die zur Injektion der Proben verwendete Spritzennadel die Flüssigkeitssäule erreichen kann, während das Vorhandensein einer stabilen, gewünschten Baseline überprüft wird. Um den Spülgasfluss zu starten, stellen Sie sicher, dass der Inertgastank mit einem zweistufigen Regler ausgestattet ist, und verbinden Sie den Inertgastank mit dem Gaseinlass des Schiffes. Öffnen Sie dann den Auslass des Spülbehälters und öffnen Sie das Gas mit einem Ausgangsdruck am Regler von ein bis fünf Pfund pro Quadratzoll.Öffnen Sie dann den Einlass des Spülbehälters und öffnen Sie langsam das Nadelventil des Spülbehälters, um den Zufluss von Gas zu ermöglichen und das Blubbern im Spülbehälter zu überprüfen. Um den Gasfluss einzustellen, zeichnen Sie den vom Chemilumineszenzdetektor gemessenen Zelldruck mit der dielektrischen Intensivfeldfilterleitung auf, die Umgebungsluft abtastet. Positionieren Sie die Kappe auf dem Spülbehälter neu und schließen Sie die dielektrische Intensivfeldfilterleitung an das Spülgefäß an.Verwenden Sie das Nadelventil, um den gleichen Zelldruck auf der Ebene des Chemilumineszenzdetektors zu erreichen, der in der Umgebungsluft aufgezeichnet wird. Um das Chemilumineszenz-Signalerfassungsprogramm zu starten, schließen Sie die serielle Schnittstelle des Chemilumineszenzdetektors an die serielle Schnittstelle des Computers an, in der das Erfassungsprogramm installiert wurde. Führen Sie dann das Analyseprogramm aus.Klicken Sie auf Erwerben, wählen Sie dann den Ordner aus, in dem die Datendatei gespeichert werden soll, geben Sie den Dateinamen ein und klicken Sie auf Speichern. Passen Sie während der Vorbereitung der Probeninjektion die Spannungsskala auf dem Bildschirm so an, dass sie die Kontrolle über die angestrebte Baseline hat, indem Sie auf die Schaltflächen Minimum und / oder Maximum klicken und dann den gewünschten Wert eingeben. Um die Probeninjektion durchzuführen, spülen Sie die Spritze mindestens zweimal oder länger mit entionisiertem und destilliertem Wasser ab, bevor Sie jede Probe entnehmen, und stellen Sie einen ungehinderten Wasserauswurf auf einem Aufgabentuch sicher.Setzen Sie dann die Spritze in das Probenröhrchen ein, während Sie sowohl die Spritze als auch das Röhrchen in einem engen Abstand halten, und ziehen Sie den Kolben auf das gewünschte Volumen hoch, während Sie sicherstellen, dass keine Luftblase oder nicht homogenisierte feste Teile eingeschlossen werden. Reinigen Sie die Spitze der Spritze mit einem Aufgabenwischer und setzen Sie die Spritze am Einspritzanschluss in die Setterkappe ein. Nachdem Sie sich vergewissert haben, dass sich die Spitze der Spritze in der flüssigen Phase befindet, injizieren Sie die Probe in die Reaktionskammer.Um die Injektion im Softwareprogramm zu markieren, geben Sie den Probennamen ein, indem Sie auf das graue Feld unter Probennamen klicken, klicken Sie dann auf Injektion markieren, während Sie überprüfen, ob die Injektion eine Veränderung des Signals nach oben oder nach unten im Stickoxidverbrauch durch zellfreien Hämoglobin-Assay verursacht. Die Dosis-Wirkungs-Beziehung zwischen zellfreiem Hämoglobin und Stickstoffmonoxidverbrauch wurde durch Chemilumineszenz nach kardiopulmonalem Bypass gemessen. Es ist davon auszugehen, dass es im oxidierten Status eine hohe Konzentration von Hämgruppen gibt, die Stickstoffmonoxid abfangen.Bei Patienten, die während des kardiopulmonalen Bypasses Stickoxid erhalten, ist die Mehrheit der Hämgruppen reduziert und verbraucht kein Stickstoffmonoxid. Messungen der zellfreien Hämoglobinkonzentration zeigten eine langsame Elimination aus dem Plasma innerhalb von 12 Stunden nach dem kardiopulmonalen Bypass. Der Stickoxidverbrauch erreichte jedoch mit 15 Minuten seinen Höhepunkt und spiegelte nicht die Eliminierung von zellfreiem Hämoglobin wider.Die linearen Regressionskurven des Stickstoffmonoxidverbrauchs durch zellfreies Hämoglobin zeigten eine Prävalenz von oxidiertem und stickoxidverbrauchendem Hämoglobin nach 15 Minuten, im Gegensatz zu einem stärker reduzierten Hämoglobin zu Studienbeginn von 4 Stunden und 12 Stunden nach dem kardiopulmonalen Bypass. Die Auswirkungen der Verabreichung von Stickoxidgas auf den Stickoxidverbrauch wurden überwacht. Wenn Patienten intra- und postoperativ mit Stickstoffmonoxidgas behandelt wurden, war der beobachtete Anstieg des freien Hämoglobins nach dem kardiopulmonalen Bypass nicht mit einem Anstieg des Stickoxidverbrauchs verbunden.Die Ergebnisse zeigten, dass exogen verabreichtes Stickstoffmonoxid den größten Teil des freien Hämoglobins reduzierte und das Abfangen von Stickoxid verhinderte. Das Experiment ist nur gültig, wenn alle Bedingungen gleich bleiben. Wenn die Höhe des Flüssigkeitsstandes die Reaktionssäule überschreitet, müssen wir anhalten und eine neue Kalibrierung durchführen.

chemiluminescence-based-assays-for-detection-nitric-oxide-its

Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Hier schlagen wir einfache Methoden zu testen und auszuwerten Anwesenheit von reaktiven Sauerstoffspezies in den Zellen.

Produktion und Nachweis von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in Cancers

Die endogene Produktion von Stickstoffmonoxid (NO) reguliert eine Vielzahl von biologischen Funktionen. Es wird zunehmend klar, dass Störungen oder Fehlregulation der NO-basierter Signalisierung in vielen menschlichen Krankheiten beteiligt ist. Methoden zur Quantifizierung relevanter keine Metaboliten können neue diagnostische oder prognostische Biomarker für Erkrankungen des Menschen bieten.

Analytische Verfahren zur Bestimmung von Stickoxid Bioaktivität

NADPH-Oxidase ist die wichtigste Quelle von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in Phagozyten. Aufgrund der Kurzlebigkeit von ROS, ist es schwierig zu messen und zu überwachen ROS Ebenen in lebenden Tieren. Ein minimal invasives Verfahren zur seriellen Quantifizierung von ROS in lebenden Mäusen beschrieben.

Biolumineszenz Imaging von NADPH-Oxidase-Aktivität in verschiedenen Tiermodellen

In diesem Artikel beschreiben wir eine angepasste relativ einfache Methode der Fluoreszenzfarbstoff Diaminofluorescein-2 - diacetat (DAF-2DA) und Dihydroethidium (DHE) für en face simultane Detektion und Visualisierung von intrazellulären Stickstoffmonoxid (NO) und Superoxid - Anion mit (O 2 .- ) jeweils in frisch intakten Aorten von einer Adipositas-Maus-Modell isoliert.

En Gesichtserkennung von Stickstoffmonoxid und Superoxid in Endothelschicht Intact Arterien

Dieses Protokoll beschreibt eine neue intraoperative Bildgebungstechnik, die einen Rutheniumkomplex als Quelle für Chemilumineszenz-Lichtemission verwendet und dadurch hohe Signal-Rausch-Verhältnisse während der in vivo-Bildgebung erzeugt. Die intraoperative Bildgebung ist ein expandierendes Gebiet, das die Art und Weise, wie chirurgische Eingriffe durchgeführt werden, revolutionieren könnte.

Eine neue Technik zur Erzeugung und Observing Chemilumineszenz in einem biologischen Rahmen

Stickstoffmonoxid (NO) ist ein wichtiges Signalmolekül in der vaskulären Homöostase. NEIN, die Produktion in vivo ist zu gering für eine direkte Messung. Die Chemilumineszenz bietet nützliche Einblicke in den NO-Zyklus durch die Messung seiner Vorläufer und Oxidationsprodukte, Nitrit und Nitrat. Die Nitrit-/Nitratbestimmung in Körpergeweben und -flüssigkeiten wird erläutert.

Mess Nitrit und Nitrat, Metabolite in der Stickoxid-Bahn, in biologischen Materialien der Chemilumineszenz-Methode unter Verwendung von

Dieses Manuskript präsentiert Protokolle für die Anwendung neuartiger genetisch kodierter Stickstoffmonoxid (NO•)-Sonden (geNOps) zur Überwachung von NO•-Fluktuationen einzelner Zellen in Echtzeit mittels Fluoreszenzmikroskopie. Die Ca2+-getriggerte NO•-Bildung auf der Ebene einzelner Endothelzellen wurde durch die Kombination von geNOps mit einem chemischen Ca2+-Sensor sichtbar gemacht.

Die Anwendung von genetisch kodierter Fluorescent Stickstoffmonoxid (NO) • Sonden, die geNOps, für Echtzeit-Imaging von NO • Signale in Einzelzellen

Wir präsentieren Protokolle für drei verschiedene Methoden zur Homogenisierung von vier verschiedenen Muskelgruppen von Ratten-Skelettmuskelgewebe, um die Nitrat- und Nitritwerte zu messen und zu vergleichen. Darüber hinaus vergleichen wir verschiedene Probengewichte, um zu untersuchen, ob die Gewebeprobengröße die Ergebnisse der Homogenisierung beeinflusst.

Herstellung von Ratten-Skelettmuskelhomogenaten für Nitrat- und Nitritmessungen

Die Erfassung dynamischer Veränderungen in der Proteinaktivierung entkernter roter Blutkörperchen stellt methodische Herausforderungen dar, wie z.B. die Konservierung dynamischer Veränderungen akuter Stimuli für eine spätere Bewertung. Das vorgestellte Protokoll beschreibt Probenvorbereitungs- und Färbetechniken, die die Konservierung und Analyse relevanter Proteinveränderungen und den anschließenden Nachweis ermöglichen.

Immunfärbungsbasierter Nachweis dynamischer Veränderungen in Erythrozytenproteinen

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Quantifizierung der Produktion von Stickstoffmonoxid (NO) in den Apithelkulturen der Luftwege, die an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche (ALI) differenziert sind, indem Nitrit in apikalen Sekreten mittels eines triiodidbasierten chemilumineszenzbasierten Assays gemessen wird.

Messung der Stickstoffmonoxidproduktion in Maus-Tracheal-Epithelzellkulturen, die an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche differenziert wurden

Erfahren Sie, wie Sie chemilumineszenzbasierte Assays zur hochempfindlichen Detektion von Stickstoffmonoxid und seinen Metaboliten in biologischen Proben einsetzen. Diese Methode ermöglicht präzise Messungen für therapeutische Forschung.

Chemilumineszenz-basierte Assays zum Nachweis von Stickstoffmonoxid und seinen Derivaten aus Autoxidation und nitrosierten Verbindungen (Video) | JoVE Journal

Chemilumineszenz-basierte Assays zum Nachweis von Stickstoffmonoxid und seinen Derivaten aus Autoxidation und nitrosierten Verbindungen

Weitere Videos entdecken