Name: Colacium sp.nin Bağlı Aşamasının Fotofizyolojisinin Küvet Tipi Hızlı Tekrarlama Hızı Florometresi ile Ölçülmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Keşfedin, küvet tipi hızlı tekrarlama hızı florometresi ile plankton üzerine yapışık Colacium sp.'nin fotosistem II fotofizyolojisini gerçek zamanlı ölçme yöntemini. Bu protokol, su ekosistemlerinde alg verimliliğini anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Çalışma, Japonya Çevre Bakanlığı'nın Japon Bölgesel Canlandırma Hibesi ve Çevre Araştırma ve Teknoloji Geliştirme Fonu (No. 5-1607) kapsamında Shiga Vilayeti'nden "Su ortamının sağlamlığının korunması için su kalitesi ve göl tabanı ortamı üzerine çalışma" başlıklı İşbirlikçi Araştırma Fonu tarafından desteklenmiştir. https://www.kantei.go.jp/jp/singi/tiiki/tiikisaisei/souseikoufukin.html. Yazarlar, İngilizce dil incelemesi için Enago'ya (www.enago.jp) teşekkür eder.

1. Örnekleme
<ol><li>Göl suyunu yüzeyden bir kova ile toplayın. S. mucronata'ya bağlı Colacium sp.'yi hedeflemek için (Şekil 1A-C) 100 μm naylon ağ kullanarak 0.5-10 L göl suyunu filtreleyin52. NOT: S. mucronata genellikle sazlık (fragmitler) alanlar arasında olduğu gibi sığ, ötrofik, çamurlu sularda yoğun bir şekilde toplanır.</li>
	<li>Konsantre numuneleri 500 mL plastik şişelerde 350 mL göl suyu ile saklayın. Karanlık koşullarda saklayın.</li>
	<li>Laboratuvarda, numune suyunu 500 mL'lik bir beherin içine dökün ve birkaç dakika bekletin.</li>
	<li>Göl suyunu 0,2 μm gözenek boyutunda bir filtreden süzün.</li>
	<li>Al S. 100x büyütmede optik mikroskop altında pipet kullanan mucronata bireyleri. Błędzki ve Rybak53'e göre tür tanımlaması yapın.</li>
	<li>Bunları bir cam slayt üzerine yerleştirilmiş 0,2-μm filtrelenmiş göl suyuna (FLW) aktarın. NOT: S. mucronata yüzeye yüzebilir veya beher duvarına yapışabilir.</li>
	<li>Kontrol S. ışık mikroskobu altında mukronata.</li>
	<li>Yıkama S. Diğer organizmalardan kontaminasyonu önlemek için FLW (3 damla veya daha fazla) kullanan mucronata bireyleri (Şekil 2).</li>
	<li>S. 40 μmol foton · m − 2 · s − 1 altındaki bir büyüme odasında in situ sıcaklıkta mukronata.</li>
</ol>2. S'nin Etkileri . temel floresan üzerinde mucronata
<ol><li>
S. mucronata yetiştiriciliği<ol>
<li>S. mucronata bireylerini optik mikroskop altında pipet kullanarak 100x büyütmede alın ve adım 1.8'de olduğu gibi FLW kullanarak yıkayın.</li>
		<li>Musluk suyunu elektrikli hava pompası kullanarak bir hava taşı aracılığıyla en az 1 hafta boyunca havalandırın. 300 mL havalandırılmış musluk suyunu 350 mL'lik bir cam kavanoza dökün.</li>
		<li> Chlorella'yı (1 mg C·L−1) besleyin ve bir büyüme odasında 40 μmol foton·m−2·s−1'in altında 20 °C'de tutun.</li>
		<li>Yaklaşık 14 gün sonra, 100x büyütmede optik mikroskop altında bir pipet kullanarak 5-30 kişiyi toplayın ve ortamı taze tutmak için 300 mL temiz, havalandırılmış musluk suyuna aşılayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>FRRf'yi ayarlama<ol>
<li>Act2Run yazılımını başlatın.</li>
		<li>Seçenekler sekmesine tıklayın ve aktinik LED'lerin rengini ayarlamak için Çalışma Modu'nda Act2 FLC (beyaz LED'ler) seçeneğini belirleyin.</li>
		<li>Ana penceredeki floresan-ışık eğrisinin ayarlarının 1. adımındaki Koyu değerine tıklayın ve karanlık dönemin süresini ayarlamak için 30 yazın (Şekil 3A).</li>
		<li>Yeşil ve turuncu LED'leri kapatmak için B, C ve D LED kombinasyonuna tıklayın (Şekil 3C).</li>
		<li>Sat altındaki Fets ve Pitch değerine tıklayın ve doygunluk aşamasındaki flaşletin sayısını ve perdesini ayarlamak için sırasıyla 100 ve 2 yazın (Şekil 3D).</li>
		<li>Rel altındaki Fets ve Pitch değerine tıklayın ve gevşeme aşamasındaki flaşletin sayısını ve perdesini ayarlamak için sırasıyla 40 ve 60 yazın (Şekil 3E).</li>
		<li>Ölçüm sırasında numune sıcaklığını kontrol etmek için FLC Sırasında (Şekil 3F) üzerine tıklayarak su ceketi pompasını etkinleştirin.</li>
		<li>Otomatik LED ve Otomatik PMT'ye tıklayarak etkinleştirin (Şekil 3F).</li>
		<li>FRRf-Act2'yi bağlamak için Senkronize Et'e tıklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>FRRf ölçümleri<ol>
<li>Zooplankton bireylerin temel floresan üzerindeki etkilerini incelemek için, yetişkin S'yi hazırlayın. mucronata (vücut büyüklüğü 400-650 μm), herhangi bir bağlı organizma olmadan 2.1.1-2.1.4 adımlarında kültürden.</li>
		<li>Bağırsak içeriğinden floresan önlemek için, FLW'deki bireyleri 20 ° C'de en az 90 dakika boyunca aç bırakın.</li>
		<li>Bir küvete 1,5 mL FLW dökün. 0, 1, 5 ve 10 S. mucronata bireylerini optik mikroskop altında 100x büyütmede bir pipet kullanarak alın.</li>
		<li>Transfer S. mucronata bireyleri küvetin içine girer ve numuneyi 2 mL'ye çıkarmak için FLW ekleyin.</li>
		<li>FRRf ölçümünden 15 dakika önce 20 ° C'de düşük ışık altında (1-10 μmol foton · m − 2 · s − 1) iklimlendirin.</li>
		<li>Ölçümü başlatmak için Act2 Run'a tıklayın. Ölçümleri numune başına >3 kez tekrarlayın.</li>
		<li>Sonuç grafiğinden Fo değerini okuyun (Şekil 4).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Substrat organizmasının Chl-a floresan üzerine etkileri 
<ol><li>
Colacium sp. yetiştiriciliği<ol>
<li>FLW ve AF-6 medium54'ü yetiştirme için hazırlayın (Tablo 2).</li>
		<li>Adım 1.1 ve 1.2'de olduğu gibi S. mucronata'ya bağlı Colacium sp.'yi toplayın ve bir büyüme odasında yerinde sıcaklıkta tutun.</li>
		<li>Colacium sp.'yi erimiş bir kabukla (Şekil 1D) optik mikroskop altında 100x büyütmede bir pipet kullanarak alın. Adım 1.8'de olduğu gibi FLW ile yıkayın.</li>
		<li>Colacium sp. ve AF-6 ortamını temiz bir tezgahta 10 mL'lik bir cam tüpte aseptik olarak aşılayın.</li>
		<li>Kültürü, bir büyüme odasında 200 μmol foton · m − 2 · s − 1 altında in situ sıcaklıkta tutun. Hücre yerleşimini önlemek için cam tüpü günde en az bir kez elle hafifçe sallayın. NOT: Toplanmış kolonilerin zayıflama etkisini mümkün olduğunca düşük tutmak için, FRRf ölçümünden önce kolonileri mikroskop altında kontrol edin. Hücre agregasyonu yoğun kolonilere neden olabilir ve alg fotofizyolojisini etkileyebilir55.</li>
	</ol>
</li>
	<li>FRRf ölçümleri<ol>
<li>Zooplankton bireylerinin Colacium sp.'den Chl-a floresan üzerindeki etkilerini incelemek için yetişkin S. hazırlayın. herhangi bir bağlı organizma olmadan mucronata (vücut büyüklüğü 400-650 μm).</li>
		<li>Bağırsak içeriğinden floresan önlemek için, FLW'deki bireyleri en az 90 dakika aç bırakın.</li>
		<li>Küvet tipi hızlı tekrarlama hızı florometresi (FRRf) kurun.</li>
		<li>Önceden kültürlenmiş Colacium sp.'nin 1,5 mL'lik bir alt örneğini bir küvete dökün. 0, 5, 10 ve 15 S aktarın. mucronata bireyleri bu küvetlere girer ve numuneyi 2 mL'ye çıkarmak için 2 μm filtrelenmiş ortam ekler.</li>
		<li>FRRf ölçümünü almadan önce 15 dakika boyunca 20 ° C'de düşük ışık altında (1-10 μmol foton · m − 2 · s − 1) iklimlendirin. NOT: Ölçümler sırasında numuneleri inkübasyon sıcaklığında tutun</li>
		<li>Ölçümü başlatmak için Act2 Run'a tıklayın. Ölçümleri numune başına >3 kez tekrarlayın.</li>
		<li>Sonuç grafiğinden FO ve Fm değerlerini okuyun (Şekil 4). NOT: PSII parametrelerini doğru tahmin etmek için LED gücünün en uygun aralıkta olup olmadığını gösteren RσPSII değerini (Tablo 1) kontrol edin. Otomatik LED etkinleştirildiğinde, Act2run sistemi optimum RσPSII aralığı (0,042-0,064) elde etmek için LED gücünü kontrol eder. Deneysel RσPSII kesme değeri, önceki bir çalışmada 0.03 ve 0.08 olarak tanımlanmıştır48.</li>
		<li>Temel floresansı22 düzeltmek için, kültür ortamını 0,2 μm gözenek boyutunda bir filtre kullanarak filtreleyin ve floresanı ölçün. Temel numunenin FO'sunu Colacium sp.'nin FO ve Fm'sinden çıkarın veya Seçenekler sekmesindeki Ayarlar'da Boş düzeltme değerini değiştirin. </li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Colacium sp. fotofizyolojisi (ekli aşama)
<ol><li>S. mucronata bireylerini optik mikroskop altında bir pipet kullanarak Colacium sp. ile izole edin.</li>
	<li>Yıkama S. adım 1.8'de olduğu gibi FLW kullanan mucronata .</li>
	<li>Transfer S. mucronata 100 mL'lik bir FLW'ye dönüşür. Açlık için, karanlık koşullar altında 90 dakika boyunca in situ sıcaklıkta tutun.</li>
	<li>Bir küvete 1,5 mL FLW dökün.</li>
	<li>~10 S. Colacium sp. ile mucronata bireyleri bir küvet içine. Ölçümler için, 2 mL başına 100'den fazla Colacium hücresine ihtiyaç vardır. Numuneyi 2 mL'ye çıkarmak için FLW ekleyin.</li>
	<li>Düşük ışık altında (1-10 μmol foton·m−2·s−1) 15 dakika boyunca in situ sıcaklıkta iklimlendirin. 3.2.6-3.2.8 adımlarında olduğu gibi Chl-a floresansını ölçün.</li>
	<li>Bağlı hücrelerin sayısını numaralandırmak için, FRRf ölçümünü aldıktan sonra numuneyi glutaraldehit (% 2 son hacim) ile sabitleyin. S'nin çeşitli odak derinliklerinde ve konumlarında fotoğraf çekin. ışık mikroskobu altında mucronata .</li>
</ol>5. Colacium sp. fotofizyolojisi (planktonik aşama)
<ol><li>Numune alınan Colacium sp.'yi AF-6 ortamında, 3.1.1-3.1.5 adımlarında olduğu gibi in situ sıcaklıkta yetiştirin.</li>
	<li>Sabit faz için, 2 mL kültürlü Colacium sp. alın ve bir küvete dökün.</li>
	<li>Düşük ışık altında (1-10 μmol foton·m−2·s−1) 15 dakika boyunca in situ sıcaklıkta iklimlendirin. 3.2.6-3.2.8 adımlarında olduğu gibi Chl-a floresansını ölçün.</li>
</ol>6. Ca ve Mn ilavesinin Colacium sp. fotofizyolojisine etkileri
<ol><li>Ekli aşama üzerindeki etkileri<ol>
<li>S. mucronata bireylerini optik mikroskop altında bir pipet kullanarak Colacium sp. ile izole edin. Adım 1.8'de olduğu gibi FLW kullanarak yıkayın.</li>
		<li>Her biri altı kişiyi 30 mL FLW ile 12 cam beherlere aktarın. Her kabın >100 Colacium sp. hücresi içerdiğinden emin olun.</li>
		<li>200 μmol· ekleyin L−1 CaCl2· H2O (Ca tedavisi), 40 μmol· L−1 MnCl4 (Mn arıtma) veya her bir beher için ultra saf su (kontrol). Numuneleri bir büyüme odasında in situ sıcaklıkta 200 μmol foton · m − 2 · s − 1 altında inkübe edin.</li>
		<li>3 saat ve 21 saatte, tüm bireyleri ve erimiş derileri 2 mL'lik bir küvete aktarın.</li>
		<li>Artan ışığa hızlı tepkiyi incelemek için, 8 aktinik ışık adımının periyotlarının Yukarı'sına tıklayın ve her adımın süresini 20 sn olarak ayarlamak için 20 (Şekil 3A) yazın. Adım adım aktinik ışığı 0, 11, 25, 44, 68, 101, 144 ve 200 μmol foton·m−2·s−1 olarak ayarlamak için, Yüksek E ve Step Up'a tıklayın ve değerleri sırasıyla 200 ve 34 olarak değiştirin (Şekil 3B).</li>
		<li>15 dakikalık karanlık iklimlendirmeden sonra, 3.2.6-3.2.8 adımlarına benzer şekilde her numunenin Chl-a floresansını ölçün. NOT: RσPSII ve RσPSII değerlerinin en uygun aralıkta (0,03-0,08)48 olduğunu doğrulayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Planktonik aşamaya etkileri<ol>
<li>Numune alınan Colacium sp.'yi AF-6 ortamında, 3.1.1-3.1.5 adımlarında olduğu gibi in situ sıcaklıkta yetiştirin.</li>
		<li>Kültürlenmiş Colacium sp.'yi FLW'ye aktarın ve 3 gün boyunca 200 μmol foton · m − 2 · s − 1'den daha düşük in situ sıcaklıkta iklimlendirin.</li>
		<li>Alışmış numunelerin 1 mL'sini, 10 mL FLW ile üç cam şişeye aktarın.</li>
		<li>200 μmol· ekleyin L−1 CaCl2· H2O (Ca tedavisi), 40 μmol· L−1 MnCl3 (Mn arıtma) veya şişelere ultra saf su (kontrol). Numuneleri bir büyüme odasında in situ sıcaklıkta 200 μmol foton · m − m − 2 · s − 1 altında inkübe edin.</li>
		<li>3 saat ve 21 saatte, 3.2.6-3.2.8 numaralı adımlarda olduğu gibi her numunenin Chl-a floresansını ölçün.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Yazarların beyan edecek herhangi bir açıklaması yoktur.

Bu protokol ilk kez, doğal bir ortamda ekli aşama sırasında Colacium sp.'nin fotofizyolojisinin, AF-6 ortamındaki planktonik aşamasıyla karşılaştırılabilir olduğunu göstermiştir. Ek olarak, açlıktan ölen S. mucronata'nın bağırsak içeriği, yoğunluk ≤5 inds · mL−1 olduğunda taban çizgisini ve Chl-a floresansını etkilememiştir (Şekil 5 ve Şekil 6). Bu sonuçlar, bu protokolün düşük substrat organizma bolluğu altında düzeltme yap...

Klorofil değişken floresansı, alg fotosistem II (PSII) fotofizyolojisini ölçmek için yararlı bir araçtır. Algler, PSII fotofizyolojilerini değiştirerek aşırı ışık ve besin eksikliği gibi çeşitli çevresel streslere yanıt verir. Hızlı tekrarlama hızı florometresi (FRRf), PSII fotofizyolojisini1,2 ölçmek ve birincil üretkenliği tahmin etmek için yaygın bir yöntemdir1,3,4, fitoplankton PSII fotofizyolojisinin yanı sıra geniş uzamsal ve zamansal ölçeklerde birincil üretkenliğin izlenmesini sağlar5,6,7. FRRf aynı anda PSII (σ PSII) absorpsiyon kesitini, reaksiyon merkezi ([RCII]) konsantrasyonunu, maksimum fotokimyasal verimliliği (Fv / Fm), etkili fotokimyasal verimliliği (Fq ′ / Fm) ve fotokimyasal olmayan söndürmeyi (NPQNSV) ölçebilir (Tablo 1). Genel olarak, Fv/Fm ve Fq′/Fm′ PSII aktivitesi8 olarak tanımlanırken, NPQNSV göreceli ısı ile dağılmış enerji9 olarak tanımlanır.
Önemli olarak, FRRf'nin tek devirli (ST) flaşları, birincil kinon elektron alıcısı QA'yı tamamen azaltır, ancak plastokinon havuzunu azaltmaz. Tersine, bir darbe genlik modülasyonu (PAM) florometresinden gelen çoklu devir (MT) yanıp sönmeleri her ikisini de azaltabilir. ST yöntemi, Fv/Fm, Fq′/Fm′, NPQNSV ve σ PSII10'un geri kazanım kinetiğini eşzamanlı olarak ölçerek NPQNSV'nin olası kökenlerini belirlerken MT yöntemine göre açık bir avantaja sahiptir. Bugüne kadar, dalgıç tipi, küvet tipi ve akış tipi gibi çeşitli FRRf enstrümanları ticari olarak temin edilebilir. Dalgıç tipi FRRf, okyanuslarda ve göllerde yerinde ölçümlere olanak tanırken, küvet tipi FRRf, küçük numune hacimlerini ölçmek için uygundur. Akış tipi, yüzey sularındaki fitoplanktonların fotofizyolojisini sürekli olarak ölçmek için yaygın olarak kullanılır.
Çok çeşitli denekler için11 küvet tipi de dahil olmak üzere PAM florometrelerinin gelişimi göz önüne alındığında, PAM florometreleri alg fotofizyolojisi araştırmalarında FRRf'lerden hala daha yaygındır12. Örneğin, bu aletler arasındaki numune haznesi yapısı ve küvet kapasitesi sadece biraz farklılık gösterse de, küvet tipi PAM fitoplanktons13,14,15, bentik mikroalgler16,17,18, buz algleri19 ve epizoik alglere20 uygulanırken, küvet tipi FRRf öncelikle fitoplanktonlara21,22,23 uygulanmıştır. ve sınırlı sayıda buz alg topluluğu24,25. Etkinliği göz önüne alındığında, küvet tipi FRRf, bentik ve epizoik alglere eşit derecede uygulanabilir. Bu nedenle, uygulamasının genişletilmesi, özellikle daha az bilinen epizoik alg fotofizyolojisi için PSII fotofizyolojisi hakkında önemli bilgiler sağlayacaktır.
Epizoik algler, PSII fotofizyolojilerini20,26 inceleyen az sayıda çalışmayla, büyük olasılıkla sucul gıda ağlarındaki küçük rollerinden dolayı27,28 çok az dikkat çekmiştir. Bununla birlikte, epizoik algler de dahil olmak üzere epibiyontlar, üreme ve hayatta kalma oranlarının artması gibi zooplankton topluluk dinamiklerini29,30 ve ayrıca batma oranını29,31 ve görsel yırtıcılara karşı savunmasızlığı artırmak gibi süreçleri olumsuz yönde etkileyebilir32,33,34,35,36 . Bu nedenle, zooplankton topluluklarında epibiyont dinamiklerini kontrol eden çevresel ve biyolojik faktörlerin araştırılması çok önemlidir.
Epizoik algler arasında, Colacium Ehrenberg 1834 (Euglenophyta), ekli (Şekil 1A-D), hareketli olmayan planktonik (Şekil 1E, F) ve hareketli planktonik aşamalar dahil olmak üzere çeşitli yaşam aşamalarına sahip yaygın, tatlı su, alg grubu32,37,38,39'dur40,41 . Hareketli olmayan planktonik aşamada, hücreler müsilaj ile kaplı tek hücreli planktonlar, toplanmış koloniler veya tek katmanlı tabaka kolonileri olarak yaşarlar42. Ekli aşamada, Colacium sp., substrat organizmalarına (bazibiontlar), özellikle de mikrokabuklulara41,43 bağlanmak için hücrenin ön ucundan atılan müsilajı kullanır37,39,41. Yaşam döngüleri ayrıca erimiş dış iskeletten veya ölü bazibionttan ayrılmayı ve başka bir substrat organizması bulmak için flagellalarıyla yüzmeyi içerir39. Hem planktonik hem de ekli aşamalar mitoz ile popülasyon büyüklüklerini artırabilir40. Her ne kadar bunlara bağlı aşamalarının ışık44 ve eser elementler41,45,46 gibi kaynakları toplamak için evrimsel bir özellik olduğu veya bir dağılım stratejisi27 olduğu varsayılmış olsa da, bu yönlerle37,41,44 hakkında çok az deneysel kanıt mevcuttur ve anahtar bağlanma mekanizmaları büyük ölçüde bilinmemektedir. Örneğin, Rosowski ve Kugrens, Colacium'un dış iskelette47 yoğunlaşan substrat kopepodlarından41 manganez (Mn) elde etmesini beklediler.
Burada, planktonik alglerin PSII fotofizyolojisinin nasıl ölçüleceğini ve küvet tipi FRRf kullanarak Colacium sp. hücreleri ile bağlı algleri (zooplanktona bağlanarak) hedeflemek için ilgili uygulama yöntemini açıklıyoruz. 444 nm, 512 nm ve 633 nm48 merkezli flaş uyarma enerjisi sağlayan üç ışık yayan diyot (LED) ile donatılmış Act2 sistemini kullanıyoruz. Burada, 444 nm (mavi), krofil a'nın (Chl-a) absorpsiyon zirvesine karşılık gelirken, 512 nm (yeşil) ve 633 nm (turuncu) sırasıyla fikoeritrin ve fikosiyaninin absorpsiyon zirvelerine karşılık gelir. Floresan sinyal algılama zirvesi, 30 nm yarım bant genişliği ile 682 nm'dir. Colacium sp.'nin planktonik evresini doğal ortamlarda bulmak zor olduğundan, deneyler için ekli aşamaları toplanmıştır. Çok sayıda substrat organizması arasında, Scapholeberis mucronata O.F. Müller 1776 (Branchiopoda, Daphniidae; Şekil 1A, B, G), yavaş yüzme hızları, büyük vücut boyutları (400-650 μm) ve benzersiz davranışları (su yüzeyinde baş aşağı asılı) nedeniyle kullanımı en basit olanlardan biridir. Bu nedenle, bu protokol Kolacium-bazibiont sisteminin bir vaka çalışması olarak S. mucronata'ya bağlı Colacium sp.'yi kullanır. Bağırsak içeriğinden türetilen floresansı önlemek için, S. mucronata aç bırakıldı. Önceki bir çalışmada, bağırsak içeriğinden (yutulan algler) gelen floresan sinyalinin 40 dakika 49'dan sonra beş kat azalma gösterdiği bildirildiğinden, 90 dakikalık açlığın, FRRf ölçümünü etkileyen bağırsak içeriği floresansı olasılığını en aza indirmek için yeterli olacağını bekledik. Ayrıca, bu protokol Colacium sp.'nin bağlanma mekanizmasını açıklığa kavuşturmak ve iki metalin, kalsiyum (Ca) ve manganezin (Mn) hem planktonik hem de bağlı aşamaların fotofizyolojisini nasıl etkilediğini belirlemek için uygulanmıştır. Kalsiyum, fotosentetik yollarda50 birçok yönden kilit rol oynar ve PSII51'in oksijenle evrimleşen komplekslerini oluşturmak için her iki metal de gereklidir. Kalsiyum ve manganez, kabuklu zooplankton47'nin kabuğunda oldukça yoğunlaştığından, Colacium sp. fotofizyolojisinin, bu yaşam aşaması bu elementleri ekli aşamada S. mucronata'dan elde ederse, planktonik aşamada Ca ve Mn zenginleştirmesine daha belirgin bir şekilde yanıt verebileceğini varsayıyoruz.

<table><tbody><tr><td>Akrodisk şırınga filtresi</td><td>Pall Corporation, Ann Arbor, MI, ABD</td><td></td><td>0.2 & mu; m gözenek boyutu</td></tr><tr><td>Act2Run</td><td>CTG Ltd., West Molesey, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Wako</td><td>023-08711</td><td>AF-6 orta</td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2H2O</td><td>Wako</td><td>031-25031</td><td>AF-6 orta</td></tr><tr><td>CaCO3</td><td>Wako</td><td>036-00382</td><td>AF-6 orta</td></tr><tr><td>Sitrik asit</td><td>Wako</td><td>036-05522</td><td>AF-6 orta</td></tr><tr><td>CoCl2&middot; 6H2O</td><td>Wako</td><td>036-03682</td><td>AF-6 orta</td></tr><tr><td>Konsantre Chlorella</td><td>Recenttec, Tokyo, Japonya</td><td></td><td>20 mg C & middot; mL ve eksi; 1 ; 4 & deg'de saklayın; C</td></tr><tr><td>FastOcean Act2</td><td>CTG Ltd., West Molesey, İngiltere</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fe-sitrat</td><td>Wako</td><td>093-00952</td><td>AF-6 orta</td></tr><tr><td>FeCl3&middot; 6H2O</td><td>Wako</td><td>091-00872</td><td>AF-6 orta</td></tr><tr><td>HCLP-880PF</td><td>Nippon Tıbbi ve Kimyasal Aletler &nbsp;Co., Ltd., Osaka, Japonya</td><td></td><td>LED ampullerle</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Wako</td><td>160-04292</td><td>AF-6 orta</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Wako</td><td>167-04241</td><td>AF-6 orta</td></tr><tr><td>MgSO4&middot; 7H2O</td><td>Wako</td><td>137-00402</td><td>AF-6 orta</td></tr><tr><td>MnCl3&middot; 4H2O</td><td>Wako</td><td>139-00722</td><td>AF-6 orta</td></tr><tr><td>Na2EDTA</td><td>Wako</td><td>343-01861</td><td>AF-6 orta</td></tr><tr><td>Na2MoO4</td><td>Wako</td><td>196-02472</td><td>AF-6 orta</td></tr><tr><td>NaNO3</td><td>Wako</td><td>191-02542</td><td>AF-6 orta</td></tr><tr><td>NH4NO3</td><td>Wako</td><td>015-03231</td><td>AF-6 orta</td></tr><tr><td>Plankton Sayacı</td><td>Matsunami Camı, Osaka, Japonya</td><td>S6300</td><td></td></tr><tr><td>Pylex test tüpü</td><td>CTG Ltd., West Molesey, Birleşik Krallık</td><td></td><td>Jantlı, 16 x 100 mm</td></tr><tr><td>Vit. B1</td><td>Wako</td><td>203-00851</td><td>AF-6 orta</td></tr><tr><td>Vit. B12</td><td>Wako</td><td>226-00343</td><td>AF-6 orta</td></tr><tr><td>Vit. B6</td><td>Wako</td><td>165-05401</td><td>AF-6 orta</td></tr><tr><td>ZnSO4&middot; 7H2O</td><td>Wako</td><td>264-00402</td><td>AF-6 orta</td></tr></tbody></table>

colacium sp.'nin bağlı aşamasının fotofizyolojisinin küvet tipi hızlı tekrarlama hızı florometresi ile Ölçülmesi

Measuring Photophysiology of Attached Stage of Colacium sp. by a Cuvette-Type Fast Repetition Rate Fluorometer

Hızlı tekrarlama hızı florometresi (FRRf), fotosistem II (PSII) fotofizyolojisini ve birincil üretkenliği ölçmek için faydalı bir yöntemdir. FRRf, çeşitli ökaryotik algler ve siyanobakteriler için PSII absorpsiyon kesitini (σ PSII), maksimum fotokimyasal verimliliği (Fv / Fm), etkili fotokimyasal verimliliği (Fq ′ / Fm ′) ve fotokimyasal olmayan söndürmeyi (NPQNSV) ölçebilse de, bugüne kadar neredeyse tüm FRRf çalışmaları fitoplanktonlara odaklanmıştır. Burada, protokol epizoik alg Colacium sp'nin PSII fotofizyolojisinin nasıl ölçüleceğini açıklamaktadır. Ehrenberg 1834 (Euglenophyta), ekli aşamasında (zooplanktona bağlı), küvet tipi FRRf kullanarak. İlk olarak, substrat zooplanktonunun (Scapholeberis mucronata O.F. Müller 1776, Cladocera, Daphniidae) bazal floresan ve σ PSII, Fv / Fm, Fq′ / Fm′ ve planktonik Colacium sp'nin NPQNSV'si üzerindeki etkilerini tahmin ettik. Bu metodolojiyi doğrulamak için, S. mucronata'ya bağlı Colacium sp.'nin fotofizyoloji ölçümlerini kaydettik ve bu sonuçları planktonik aşamasıyla karşılaştırdık. Temsili sonuçlar, protokolün kalsiyum (Ca) ve manganezin (Mn) Colacium sp. fotofizyolojisi üzerindeki etkilerini nasıl belirleyebileceğini ve Mn zenginleştirmenin bağlı ve planktonik aşamalar arasındaki çeşitli etkilerini nasıl tanımlayabileceğini göstermiştir. Son olarak, bu protokolün diğer perifitik alglere uyarlanabilirliğini tartışıyoruz.

S. mucronata tarafından 5 bireye (inds.) mL−1'e kadar bazal floresan (Şekil 5) veya Chl-a floresansının (Şekil 6) anlamlı bir etkisi yoktu. Bununla birlikte, Fv / Fm ve NPQNSV, S. mucronata 7.5 inds · mL − 1 olduğunda önemli ölçüde etkilendi. Bu nedenle, ekli aşamada Colacium sp.'nin fotofizyolojisini ölçmek için, küvette yeterli Colacium sp. b...

Hızlı tekrarlama hızı florometresi (FRRf), fotosistem II fotofizyolojisini ve birincil üretkenliği ölçmek için faydalı bir yöntemdir. Burada, küvet tipi FRRf kullanarak substrat zooplankton üzerindeki epizoik alglerin, Colacium sp.'nin PSII fotofizyolojisini ölçmek için bir protokol tarif ediyoruz.

Colacium sp.'nin Bağlı Aşamasının Fotofizyolojisinin Küvet Tipi Hızlı Tekrarlama Hızı Florometresi ile Ölçülmesi

Fast repetition rate fluorometer (FRRf) is a beneficial method for measuring photosystem II (PSII) photophysiology and primary productivity. Although FRRf ...

Bu protokol, bağlı alglerin fotosentetik aktivitesini, tıpkı doğada olduğu gibi hala planktona bağlanırken ölçer. Bu tekniğin temel avantajı, fotofizyolojinin ölçümünün numunenin dikkati dağılmadan gerçek zamanlı olarak yapılabilmesidir. Zooplankton bireylerinin temel floresan üzerindeki etkilerini incelemek için, yetişkin scapholeberis mucronata'yı kültürden herhangi bir organizmaya bağlı olmadan hazırlayın.Şimdi FLW'deki bireyleri bağırsak içeriğinden floresan önlemek için en az 90 dakika boyunca 20 santigrat derecede aç bırakın. Bir küvete 1,5 mililitre FWL dökün. İstediğiniz s sayısını alın.100 kat büyütmede optik mikroskop altında pipet kullanan mucronata bireyleri ve bunları küvete aktarır. Numune hacmini 2 mililitreye çıkarmak için FLW ekleyin ve hızlı tekrarlama hızı florometre ölçümünden 15 dakika önce 20 santigrat derecede düşük ışık altında alışmasına izin verin. Ardından, ölçümü başlatmak ve ölçümleri numune başına üç defadan fazla tekrarlamak için "çalıştırmak için harekete geç" düğmesine tıklayın.Elde edilen grafikten F0 değerini okuyun. 100 kat büyütmede optik mikroskop altında bir pipet kullanarak erimiş bir karapaks ile kolakyum türlerini toplayın ve FLW ile yıkayı

measuring-photophysiology-attached-stage-colacium-sp-cuvette-type

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Damlacık tabanlı mikroakışkan platformları kHz oranları ucuza pikolitrelik, kendi kendine bölümlere damarları oluşturmak mümkün olduğundan yüksek kapasiteli deney için umut vaat eden adaylardır. Hızlı, hassas ve yüksek çözünürlüklü floresans spektroskopik yöntemleri ile entegrasyon sayesinde, bu sistemler içinde üretilen bilgilerin büyük miktarda verimli, ayıklanır, harnessed ve kullanılan olabilir.

Mikroakışkan damlacık platformları için Floresan algılama yöntemleri

Förster rezonans enerji transferi (FRET) mikroskopi gazetecilere gibi çeşitli biyosensör kullanılarak canlı hücrelerde olayların sinyalizasyon gerçek zamanlı izleme için güçlü bir tekniktir. Burada nasıl bir özelleştirilmiş Epifloresans oluşturmak için ticari olarak mevcut bileşenleri ve nasıl deneyler FRET için kullanmak, görüntüleme sistemi FRET tarif.

Unimoleküler Biyosensörler kullanma Canlı Hücreler Olaylar Sinyal gerçek zamanlı izlenmesi için Mikroskopi FRET

Bu video, protein homo-oligomerizasyonunu incelemek için floresan dalgalanma spektroskopisi (FFS) tekniğini göstermektedir. Bir numunedeki floresan etiketli proteinler, FFS kullanılarak protein oligomerizasyonu incelenirken bir ajan kullanılarak dimerize edilir. Konfokal bir mikroskop kullanılarak, proteinler küçük gözlem hacmine girip çıktıkça, proteinlerin oligomerik durumunu belirlemek için floresan moleküllerinin parlaklığındaki dalgalanmaların analizi yapılır.

Protein Homo-Oligomerizasyonunu İncelemek için Floresan Dalgalanma Spektroskopisi

Kaynak: Kulkarni, M. et al. Fare retinasının koni fotoreseptörü akson terminallerinde Ca2+ dinamiği. J. Vis. Uzm. (2015)Bu video, transgenik bir fare retinasının koni fotoreseptörlerindeki kalsiyum dinamiklerini izlemek için iki foton mikroskobunun kullanımını göstermektedir. Arka plan aydınlatması ve ışık stimülasyonu altında kalsiyum seviyelerini ölçmek için retina dilimleri hazırlama, FRET tabanlı kalsiyum biyosensörlerini görüntüleme ve floresan değişikliklerini analiz etme adımlarını ana...

Fare Retina Koni Fotoreseptörlerinde Kalsiyum Dinamiğini İzlemek için İki Foton Mikroskobu

Hücre içi Ca Ölçme<sup&gt; 2 +</supDört Teknikleri ile İnsan rm&gt; Değişiklikler: Konvansiyonel Florometre, Akış Florometre, Sitometrisi ve Tek Hücre Görüntüleme Durduruldu

Şu anda, mevcut kalsiyum indikatörlerinin çoğu, kültürlenmiş düz kas hücrelerinde sarkoplazmik retikulumdan salınan kalsiyumun dolaylı ölçümleri olarak sitoplazmik kalsiyum geçişlerini ölçmek için kullanılmaktadır. Bu protokol, sarkoplazmik retikulum lümeni içindeki kalsiyum sinyallerinin doğrudan ölçülmesine izin veren spesifik bir FRET tabanlı göstergenin kullanımını açıklar.

Kullanımı Kültür düz kas hücrelerinin sarkoplazmik retikulum içinde Kalsiyum Değişiminin Ölçülmesi FRET tabanlı Konfokal Görüntüleme

kalbinde, moleküler olaylar organın elektrik ve kasılma fonksiyonunu koordine ederler. Burada sunulan yerel alan floresan mikroskopi teknikleri bir dizi sağlam kalplerinde hücresel değişkenlerin kaydedilmesini sağlar. kalp fonksiyonlarını tanımlayan mekanizmaları belirleme kalp patolojik durumlar altında nasıl çalıştığını anlamada önemlidir.

Yerel Alan Floresan Mikroskopi: Bozulmamış Kalpler Hücresel Sinyalleri Görüntüleme

Burada, yüksek hızlı modüler fotometri sistemi kullanarak indüklenmiş pluripotent kök hücre türetilmiş kardiyomiyositlerden kaynaklanan eylem potansiyellerinin optik edinimi ve karakterizasyonu açıklanmaktadır.

İnsan kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Türevli Kardiyomiyositlerde Tek Hücreli Optik Eylem Potansiyeli Ölçümü

Bu makalede, geniş alan floresan mikroskopisi kullanılarak mobil, tek moleküllü Förster rezonans enerji transferi (smFRET) tabanlı probların mekansal analizi için bir yöntem sunulmaktadır. Yeni geliştirilen yazılım araç seti, doğru FRET verimliliği ve moleküler konumlar da dahil olmak üzere hareketli probların smFRET zaman izlerinin zamanın işlevleri olarak belirlenmesini sağlar.

Mobil Tek Moleküllü FRET Problarının Otomatik İki Boyutlu Mekansal Analizi

Bu protokol, spektral analize dayalı olarak kırmızı alglerdeki fikobiliprotein değişikliklerinin adım adım otofloresan görüntülemesini ve değerlendirilmesini açıklamaktadır. Bu, yalnızca kıt materyalin mevcut olduğu ve hücrelerin laboratuvar koşullarında yavaş büyüdüğü veya hiç büyümediği aşırı habitatlara hücresel adaptasyonu değerlendirmek için etiketsiz ve tahribatsız bir yöntemdir.

Kırmızı Alg Fizyolojisini Değerlendirmek için Otofloresan Görüntüleme

Keşfedin, küvet tipi hızlı tekrarlama hızı florometresi ile plankton üzerine yapışık Colacium sp.'nin fotosistem II fotofizyolojisini gerçek zamanlı ölçme yöntemini. Bu protokol, su ekosistemlerinde alg verimliliğini anlamaya yardımcı olur.

Colacium sp.'nin Bağlı Aşamasının Fotofizyolojisinin Küvet Tipi Hızlı Tekrarlama Hızı Florometresi ile Ölçülmesi

Daha fazla video keşfet