Name: Isolamento di cellule endoteliali retiniche murine per il sequenziamento di nuova generazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Impara l'isolamento di cellule endoteliali retiniche murine ottimizzato per rendimento, purezza e vitalità. Questo metodo facilita il sequenziamento di nuova generazione per studiare lo sviluppo vascolare.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Grazie alla Yale Flow Cytometry Facility, alla University of Virginia Flow Cytometry Core Facility, allo Yale Center for Genomic Analysis e alla University of Virginia Genome Analysis and Technology Core per il loro impegno, competenza e consulenza nel contribuire agli esperimenti presentati. Questo studio è stato finanziato da sovvenzioni NIH a N.W.C. (T32 HL007224, T32 HL007284), S.C. (T32 HL007284), K.W. (R01 HL142650) e K.K.H. (R01 HL146056, R01 DK118728, UH3 EB025765).

I comitati istituzionali per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Yale e dell'Università della Virginia hanno approvato tutti gli esperimenti sugli animali elencati in questo protocollo.
1. Ottenere occhi di topo per l'isolamento della retina
<ol><li>Preparare 1x PBS ghiacciato e aggiungere 500 μL a ciascun pozzetto di una piastra da 48 pozzetti.</li>
	<li>Eutanasia dei topi neonatali al sesto giorno postnatale (P6) secondo le linee guida istituzionali approvate. Per questo esperimento, cucciolate di circa 4-8 topi neonatali vengono eutanasizzati a P6 tramite inalazione di isoflurano per almeno tre minuti dopo l'arresto respiratorio, seguito dalla decapitazione.</li>
	<li>Rimuovi gli occhi da ciascuno dei topi. Tagliare via la pelle e la membrana sopra l'occhio tagliando perpendicolarmente alla palpebra usando le forbici da dissezione. Quindi, utilizzare una pinza per premere delicatamente sopra e sotto l'occhio in modo che l'occhio si muova fuori dalla presa.<ol><li>Pizzicare delicatamente sotto l'occhio con la pinza e tagliare il nervo ottico che tiene l'occhio attaccato. Quindi, posizionare ciascun occhio nella piastra a 48 pozzetti nel PBS ghiacciato 1x preparato fino al termine della raccolta. NOTA: utilizzare un pozzetto per mouse, con entrambi gli occhi di un singolo mouse nello stesso pozzetto.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Isolare il tessuto retinico del topo
<ol><li>Riempire una capsula di Petri, foderata con un tampone di dissezione sul fondo, con 500 μL di 1x PBS ghiacciato per immergere gli occhi e metterlo sotto un microscopio a dissezione impostato su un ingrandimento 4.0x.<ol><li>Sospendere gli occhi nel tampone di dissezione utilizzando una pipetta di trasferimento con una punta larga in modo da non danneggiare gli occhi. NOTA: Assicurarsi che gli occhi siano completamente coperti di PBS.</li>
	</ol></li>
	<li>Usando due pinze da dissezione fine, tenere il nervo ottico con una delle pinze per la stabilizzazione e con la seconda pinza perforare un foro attraverso la camera anteriore dove la cornea e la sclera si collegano (Figura 1B). Strappare il buco in un cerchio circa il 75% del percorso intorno alla cornea.<ol><li>Mentre si tiene ancora il nervo ottico con una delle pinze, utilizzare la seconda pinza per strappare delicatamente la sclera dal tessuto retinico.</li>
		<li>Come sopra, utilizzare la seconda pinza per strappare delicatamente il corpo vitreo del tessuto retinico.</li>
		<li>Ancora una volta, usando la seconda pinza, rimuovere delicatamente la lente e i vasi del plesso ialoide che non si sono staccati quando il corpo vitreo è stato rimosso. Per fare questo, raggiungere la retina con una pinza aperta fino quasi a toccare la retina, chiudere la pinza per afferrare la lente e i vasi del plesso ialoide e estrarre il forcipe dalla retina. Questo può essere ripetuto fino a quando tutti i vasi non vengono rimossi. NOTA: Il plesso ialoide assomiglia a una struttura chiara simile a una ragnatela.</li>
	</ol></li>
	<li>Riempire 2 mL di provette da microcentrifuga con 500 μL di 1x PBS ghiacciato e posizionare le retine nelle provette. Isolare tutte le retine dagli occhi e metterle in PBS ghiacciato prima di andare avanti. NOTA: Utilizzare un tubo per mouse, con due retine dello stesso mouse che condividono un tubo. Se il tessuto retinico è strappato, trasferirlo in più pezzi. Il tempo totale di dissezione del tessuto retinico per una cucciolata di topi dovrebbe richiedere 15-60 minuti, iniziando con l'eutanasia e terminando con l'isolamento finale del tessuto retinico.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63133/63133fig01.jpg"> Figura 1: Panoramica del protocollo di isolamento. (A) Schema della sequenza temporale dell'isolamento con un tempo stimato per ogni fase: isolamento del tessuto retinico, digest, colorazione degli anticorpi, FACS e finestra di vitalità cellulare. (B) Guida passo-passo per l'isolamento del tessuto retinico dall'occhio, con fasi di dissezione numerate: 1) perforare la cornea, 2) lacrimare la cornea, 3) strappare la sclera, 4) rimuovere la sclera dalla retina, 5) rimuovere ulteriormente la sclera e il tessuto di collegamento dalla retina, 6) rimuovere il corpo vitreo e i vasi vitreali dalla retina. (C) Immagini rappresentative del tessuto retinico durante le varie fasi della digestione: Pre-digestione, Post-digestione, Pellet (le frecce nere evidenziano il tessuto retinico o il pellet cellulare). Ripubblicato con il permesso di Chavkin et al. pubblicato in S. Karger AG, Basilea17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63133/63133fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
3. Digerire il tessuto retinico in una sospensione monocellulare
<ol><li>Preparare 500 μL di soluzione digestiva per ogni due retine isolate. Aggiungere FBS e collagenasi di tipo II a DMEM ad una concentrazione finale del 10% FBS e 1 mg/mL di collagenasi di tipo II. Mescolare e riscaldare la soluzione a 37 °C a bagnomaria.</li>
	<li>Rimuovere il PBS in eccesso dalle provette della microcentrifuga da 2 mL mediante pipettaggio accurato. Lasciare abbastanza PBS per coprire completamente il tessuto retinico, circa 100 μL in ogni tubo.</li>
	<li>Aggiungere 500 μL della soluzione digestiva a ciascuna provetta con tessuto retinico (Figura 1C).<ol><li>Utilizzare un pipettor P1000 e una punta per pipetta su e giù per il tessuto retinico nella soluzione di digestione cinque volte.</li>
	</ol></li>
	<li>Incubare la miscela di digestione a bagnomaria a 37 °C per 20 minuti.<ol><li>Utilizzare un pipettor P1000 e una punta per pipetta per pipettare la miscela di digestione su e giù ogni 5 minuti. Dopo l'incubazione, il tessuto retinico si è dissolto in una sospensione a singola cellula, quindi la miscela di digestione dovrebbe essere torbida (Figura 1C).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Contare le celle
<ol><li>Impostare una centrifuga da tavolo a 4 °C e posizionare all'interno i tubi della miscela di digestione. Pellettare la miscela di digestione mediante centrifugazione a 375 x g per 5 min.</li>
	<li>Rimuovere con cautela la soluzione di digestione surnatante mediante pipettaggio. Non disturbare il pellet cellulare (Figura 1C). Risospendere il pellet in 500 μL di 1x PBS ghiacciato mescolando delicatamente su e giù con la pipetta.</li>
	<li>Contare le cellule con un emocitometro al microscopio. NOTA: La conta delle cellule è di circa 1 x 106 cellule per due retine.</li>
	<li>Assicurarsi che le cellule siano correttamente risospese mediante miscelazione delicata, quindi aliquote 20 μL di sospensione cellulare in tre provette per la colorazione di controllo (tubo 1: controllo IgG, tubo 2: controllo CD31 e tubo 3: controllo CD45), come descritto e usato in precedenza17,18.</li>
	<li>Impostare una centrifuga da tavolo a 4 °C e posizionare all'interno i tubi contenenti celle. Pellettare le celle mediante centrifugazione a 375 x g per 5 min.</li>
</ol>5. Immunocolorare le cellule con anticorpi
<ol><li>Preparare 100 μL di tampone colorante per due retine colorate più quattro tubi di controllo. Aggiungere FBS, HEPES e D-glucosio al tampone HBSS a una concentrazione finale del 10% FBS, 10 mM HEPES e 1 mg / mL D-glucosio.</li>
	<li>Ottenere anticorpi coniugati fluorescentmente contro CD31 e CD45. Aggiungere gli anticorpi ad una diluizione 1:100 nel tampone colorante (tubo 1: solo anticorpo IgG, tubo 2: solo anticorpo CD31 e tubo 3: solo anticorpo CD45). Aggiungere 1 μL di anticorpo per 100 μL del tampone colorante per una concentrazione finale di anticorpi di 2 μg/ml.</li>
	<li>Rimuovere con cautela il PBS dal pellet cellulare lavato mediante pipettaggio.</li>
	<li>Risospendere il pellet in 100 μL di soluzione anticorpale per 0,5 x 106 cellule.<ol><li>Incubare la sospensione unicellulare con la soluzione anticorpale per 30 minuti su ghiaccio al buio. Picchiettare i tubi ogni 10 minuti per mescolare delicatamente le cellule.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Prepararsi per la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza
<ol><li>Impostare una centrifuga da tavolo a 4 °C e posizionare all'interno i tubi contenenti celle. Celle a pellet per centrifugazione a 375 x g per 5 min.<ol><li>Rimuovere il surnatante e risospendere queste cellule in 500 μL di 1x PBS da lavare.</li>
	</ol></li>
	<li>Impostare una centrifuga da tavolo a 4 °C e posizionare all'interno i tubi contenenti celle. Celle a pellet per centrifugazione a 375 x g per 5 min</li>
	<li>Preparare 1,5 mL di tampone FACS (1% FBS in 1x PBS).<ol><li>Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 300 μL di tampone FACS mescolando delicatamente con un pipettatore.</li>
	</ol></li>
	<li>Aggiungere lo ioduro di propidio (PI) alle provette contenenti il tampone FACS fino ad una concentrazione finale di 0,5 μg/ml. PI è usato come indicatore di vitalità.</li>
	<li>Trasferire e combinare le sospensioni cellulari in provette da 5 mL attraverso un tappo a scatto del filtro cellulare. Il tappo a scatto del filtro cellulare deve contenere un filtro da 35 μm e le sospensioni cellulari possono essere pipettate direttamente sul filtro.<ol><li>Tenere i tubi FACS sul ghiaccio al buio e trasferirli nella selezionatrice cellulare.</li>
	</ol></li>
</ol>7. Impostare lo strumento FACS
<ol><li>Installare un ugello da 100 μm in uno strumento FACS. NOTA: questo ugello di dimensioni riduce al minimo il volume di raccolta e massimizza la densità delle celle isolate.</li>
	<li>Preparare 250 μL di 1x PBS in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL come tubo di raccolta da installare nello strumento FACS.</li>
</ol>8. Isolare le cellule endoteliali vitali tramite FACS
<ol><li>Accendere lo strumento FACS e il computer. Fare clic sull'icona del software FACS per aprire il software FACS sul computer per eseguire e utilizzare lo strumento FACS. Eseguire test di controllo qualità di routine.</li>
	<li>Caricare i campioni colorati di controllo nello strumento FACS per regolare gli assi. Inizia con le sole cellule anticorpali IgG per generare e regolare FSC e SSC, quindi l'anticorpo CD31 solo per generare e regolare CD31 e quindi l'anticorpo CD45 solo per generare e regolare CD45. Registrare i dati dai campioni di controllo.</li>
	<li>Caricare le celle del campione colorato nello strumento FACS ed eseguire il campione.</li>
	<li>Gate le celle in base ai parametri forward-scatter e side-scatter (FSC-A e SSC-A, rispettivamente) (Figura 2A). NOTA: i parametri FSC-A e SSC-A vengono utilizzati per selezionare le celle in base a dimensioni, densità, granularità, proprietà superficiali e indice di rifrazione.</li>
	<li>Celle gate di FSC-A e FSC-H per identificare i doppietti cellulari e raccogliere solo singole celle (Figura 2A). NOTA: I parametri FSC-A e FSC-H vengono utilizzati per selezionare singole celle in base al principio che durante la diffusione in avanti, i doppietti delle celle saranno goccioline contenenti un rapporto area-altezza maggiore.</li>
	<li>Celle gate per PI e SSC-A per identificare le cellule vitali (Figura 2A). NOTA: Le cellule vitali saranno PI-negative.</li>
	<li>Crea un gate CD31+/CD45- con controlli e celle di gate di CD31 e CD45 (Figura 2A,B).<ol><li>Inserire una provetta di raccolta con 250 μL di tampone FACS.</li>
		<li>Iniziare a smistare le celle CD31-positive/CD45-negative nella provetta di raccolta installata.</li>
		<li>Tenere i tubi di raccolta sul ghiaccio per ulteriori analisi. I campioni possono essere elaborati per applicazioni di sequenziamento di nuova generazione in questa fase1.</li>
	</ol></li>
</ol>9. Eseguire il test di vitalità
<ol><li>Mescolare 10 μL di cellule con 10 μL di soluzione di tripano blu allo 0,4% per valutare la vitalità cellulare.</li>
	<li>Contare le cellule vitali pipettando la miscela colorata su un vetrino emocitometrico. Posizionare il vetrino al microscopio per conteggi accurati della vitalità. Conta le cellule blu come non vitali e conta le cellule chiare come vitali.<ol><li>Dividere il conteggio delle cellule vitali per il conteggio totale delle cellule per calcolare la percentuale di vitalità.</li>
	</ol></li>
</ol>10. Eseguire il test di espressione genica
<ol><li>Ottenere 10.000-20.000 cellule per campione ed eseguire l'isolamento dell'RNA per analizzare l'espressione genica delle cellule endoteliali retiniche murine. L'isolamento dell'RNA viene eseguito utilizzando un kit disponibile in commercio che utilizza la precipitazione dell'RNA a base di etanolo, quindi la centrifugazione e le colonne di membrana per lavare ed eluire l'RNA purificato dal lisato cellulare. I campioni possono essere elaborati per alcune applicazioni di sequenziamento di nuova generazione in questa fase1.</li>
	<li>Convertire l'RNA in cDNA usando l'enzima trascrittasi inversa e i reagenti di supporto19.</li>
	<li>Quantificare utilizzando un colorante legante il DNA e una macchina per PCR quantitativa (qPCR)20. Caricare campioni di cDNA in una piastra qPCR da 384 pozzetti con primer per amplificare i geni di interesse. Il volume di reazione dovrebbe ammontare a 10 μL, compreso il colorante legante il DNA, che verrà utilizzato per quantificare l'amplificazione genica.<ol><li>Utilizzare CD31, VE-caderina, CD45 e primer β-actina avanti e indietro per misurare l'espressione genica.</li>
	</ol></li>
	<li>Utilizzare l'esempio per le applicazioni di sequenziamento di nuova generazione1.</li>
</ol>

<ol><li>Slatko, B. E., Gardner, A. F., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+next-generation+sequencing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Overview of next-generation sequencing technologies.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 122 (1), 59(2018).</li>
<li>Chavkin, N. W., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+analysis+in+vascular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Single cell analysis in vascular biology.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 7, 42(2020).</li>
<li>Ma, F., Hernandez, G. E., Romay, M., Iruela-Arispe, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+to+study+vascular+diversity+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Hematology%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing to study vascular diversity and function.</a> Current Opinion in Hematology. 28 (3), 221-229 (2021).</li>
<li>Potter, A. S., Potter, S. S., S, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+tissues+for+single-cell+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Dissociation of tissues for single-cell analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1926, 55-62 (2019).</li>
<li>Braga, F. A. V., Miragaia, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+handling+and+dissociation+for+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Single+Cell+Methods%3A+Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Tissue handling and dissociation for single-cell RNA-seq.</a> Single Cell Methods: Methods in Molecular Biology. 1979, 9-21 (2019).</li>
<li>Brink, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing+reveals+dissociatin-induced+gene+expression+in+tissue+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing reveals dissociatin-induced gene expression in tissue subpopulations.</a> Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).</li>
<li>Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+tissue+enzymatic+digestion+on+analysis+of+immune+cells+in+mouse+reproductive+mucosa+with+a+focus+on+gammadelta+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells.</a> Journal of Immunological Methods. 474, 112665(2019).</li>
<li>Connolly, S., Hores, T., Smith, L., D'Amore, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+vascular+development+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of vascular development in the mouse retina.</a> Microvascular Research. 36 (3), 275-290 (1988).</li>
<li>Crist, A., Young, C., Meadows, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+arteriovenous+identity+in+the+developing+neonate+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expression+Patterns%3A+GEP%22%5BJournal%5D)">Characterization of arteriovenous identity in the developing neonate mouse retina.</a> Gene Expression Patterns: GEP. 23-24, 22-31 (2017).</li>
<li>dela Paz, N. G., D'Amore, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterial+versus+venous+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Arterial versus venous endothelial cells.</a> Cell and Tissue Research. 335 (1), 5-16 (2009).</li>
<li>Fang, J. S., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+arteriovenous+endothelial+cell+specification%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Res%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of arteriovenous endothelial cell specification.</a> F1000Res. 8, (2019).</li>
<li>Smith, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen-induced+retinopathy+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Oxygen-induced retinopathy in the mouse.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).</li>
<li>Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+gene+targeting+in+the+neonatal+vasculature+and+analysis+of+retinal+angiogenesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice.</a> Nature Protocols. 5 (9), 1518-1534 (2010).</li>
<li>Ruiz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+of+hereditary+hemorrhagic+telangiectasia+generated+by+transmammary-delivered+immunoblocking+of+BMP9+and+BMP10%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A mouse model of hereditary hemorrhagic telangiectasia generated by transmammary-delivered immunoblocking of BMP9 and BMP10.</a> Scientific Reports. 6, 37366(2016).</li>
<li>Fang, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear-induced+Notch-Cx37-p27+axis+arrests+endothelial+cell+cycle+to+enable+arterial+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Shear-induced Notch-Cx37-p27 axis arrests endothelial cell cycle to enable arterial specification.</a> Nature Communication. 8 (1), 2149(2017).</li>
<li>Ola, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SMAD4+prevents+flow+induced+arterial-venous+malformations+by+inhibiting+Casein+Kinase+2%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">SMAD4 prevents flow induced arterial-venous malformations by inhibiting Casein Kinase 2.</a> Circulation. 138 (21), 2379-2394 (2018).</li>
<li>Chavkin, N. W., Walsh, K., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+highly+purified+and+viable+retinal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vascular+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation of highly purified and viable retinal endothelial cells.</a> Journal of Vascular Research. 58 (1), 49-57 (2020).</li>
<li>Hulspas, R., O'Gorman, M. R. G., Wood, B. L., Gratama, J. W., Sutherland, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Considerations+for+the+control+of+background+fluorescence+in+clinical+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+PartB%3A+Clinical+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry.</a> Cytometry PartB: Clinical Cytometry. 76 (6), 355-364 (2009).</li>
<li>Bachman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse-transcription+PCR+%28RT-PCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Reverse-transcription PCR (RT-PCR).</a> Methods in Enzymology. 530, 67-74 (2013).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+RNA+by+real-time+Reverse+Transcription-Polymerase+Chain+Reaction+%28RT-PCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbour+Protocols%22%5BJournal%5D)">Quantification of RNA by real-time Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR).</a> Cold Spring Harbour Protocols. 2018 (10), (2018).</li>
<li>Liu, L., Shi, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD31%3A+beyond+a+marker+for+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">CD31: beyond a marker for endothelial cells.</a> Cardiovascular Research. 94 (1), 3-5 (2012).</li>
<li>Zarkada, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specialized+endothelial+tip+cells+guide+neuroretina+vascularization+and+blood-retina-barrier+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Specialized endothelial tip cells guide neuroretina vascularization and blood-retina-barrier formation.</a> Developmental Cell. 56 (15), 2237-2251 (2021).</li>
<li>Su, X., Sorenson, C. M., Sheibani, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+murine+retinal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of murine retinal endothelial cells.</a> Molecular Vision. 9, 171-178 (2003).</li>
<li>Benedito, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+notch+ligands+Dll4+and+Jagged1+have+opposing+effects+on+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The notch ligands Dll4 and Jagged1 have opposing effects on angiogenesis.</a> Cell. 137 (6), 1124-1135 (2009).</li>
<li>Daneman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+is+required+for+CNS%2C+but+not+non-CNS%2C+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Wnt/beta-catenin signaling is required for CNS, but not non-CNS, angiogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (2), 641-646 (2009).</li>
<li>Okabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+limit+angiogenesis+by+titrating+VEGF+in+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Neurons limit angiogenesis by titrating VEGF in retina.</a> Cell. 159 (3), 584-596 (2014).</li>
<li>Crist, A. M., Lee, A. R., Patel, N. R., Westhoff, D. E., Meadows, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+deficiency+of+Smad4+causes+arteriovenous+malformations%3A+a+mouse+model+of+Hereditary+Hemorrhagic+Telangiectasia%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Vascular deficiency of Smad4 causes arteriovenous malformations: a mouse model of Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia.</a> Angiogenesis. 21 (2), 363-380 (2018).</li>
<li>Kim, Y. H., Choe, S. W., Chae, M. Y., Hong, S., Oh, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SMAD4+deficiency+leads+to+development+of+arteriovenous+malformations+in+neonatal+and+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">SMAD4 deficiency leads to development of arteriovenous malformations in neonatal and adult mice.</a> Journal of the American Heart Association. 7 (21), 009514(2018).</li>
<li>Ma, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+TGFbeta+signaling+in+retinal+microglia+induces+retinal+degeneration+and+exacerbates+choroidal+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Absence of TGFbeta signaling in retinal microglia induces retinal degeneration and exacerbates choroidal neovascularization.</a> eLife. 8, 42049(2019).</li>
<li>Luo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterialization+requires+the+timely+suppression+of+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Arterialization requires the timely suppression of cell growth.</a> Nature. 589 (7842), 437-441 (2021).</li>
<li>Lawson, N. D., Vogel, A. M., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((sonic+hedgehog+and+vascular+endothelial+growth+factor+act+upstream+of+the+Notch+pathway+during+arterial+endothelial+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">sonic hedgehog and vascular endothelial growth factor act upstream of the Notch pathway during arterial endothelial differentiation.</a> Developmental Cell. 3 (1), 127-136 (2002).</li>
<li>Larrivee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALK1+signaling+inhibits+angiogenesis+by+cooperating+with+the+Notch+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">ALK1 signaling inhibits angiogenesis by cooperating with the Notch pathway.</a> Developmental Cell. 22 (3), 489-500 (2012).</li>
<li>Wythe, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ETS+factors+regulate+Vegf-dependent+arterial+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">ETS factors regulate Vegf-dependent arterial specification.</a> Developmental Cell. 26 (1), 45-58 (2013).</li>
<li>Davis, D. M., Purvis, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+analysis+of+signaling+patterns+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Computational analysis of signaling patterns in single cells.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 0, 35-43 (2015).</li>
<li>Gaudet, S., Miller-Jensen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+signaling+pathways+with+an+expanding+single-cell+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Redefining signaling pathways with an expanding single-cell toolbox.</a> Trends in Biotechnology. 34 (6), 458-469 (2016).</li>
<li>Aibar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCENIC%3A+single-cell+regulatory+network+inference+and+clustering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">SCENIC: single-cell regulatory network inference and clustering.</a> Nature Methods. 14 (11), 1083-1086 (2017).</li>
<li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+and+regulators+of+cell+fate+decisions+are+revealed+by+pseudotemporal+ordering+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The dynamics and regulators of cell fate decisions are revealed by pseudotemporal ordering of single cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (4), 381-386 (2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno divulgazioni rilevanti.

Questo protocollo descrive un metodo per l'isolamento delle cellule endoteliali dal tessuto retinico murino postnatale che è stato ottimizzato per un elevato numero di cellule, purezza e vitalità. La purezza cellulare è ottenuta mediante isolamento FACS di popolazioni di cellule endoteliali dalla sospensione monocellulare digerita mediante immunocolorazione CD31+/CD45-. La qualità dell'isolamento è quantificata nei saggi per la vitalità mediante colorazione blu di Trypan ed espressione genica mediante qPCR per CD31, CD45...

L'elevata capacità di sequenziamento degli acidi nucleici tramite approcci di sequenziamento di nuova generazione ha notevolmente migliorato la conoscenza dei ricercatori sulla biologia molecolare e cellulare. Queste tecniche avanzate includono il sequenziamento dell'RNA dell'intero trascrittoma, il sequenziamento del DNA di regioni mirate per identificare i polimorfismi a singolo nucleotide (SNP), il sequenziamento del DNA dei fattori di trascrizione legati nel sequenziamento dell'immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) o le regioni aperte della cromatina nel sequenziamento della cromatina accessibile alla trasposasi (ATAC) e il sequenziamento dell'RNA a singola cellula1 . Nella biologia vascolare, questi progressi hanno permesso ai ricercatori di chiarire complicati meccanismi di sviluppo e malattia, insieme a distinguere i modelli di espressione genica lungo un continuum di fenotipi variabili 2,3. Gli esperimenti futuri possono definire ulteriormente meccanismi complessi combinando il sequenziamento di prossima generazione con modelli valutati di sviluppo vascolare, ma i metodi per la preparazione del campione devono essere compatibili con le tecniche avanzate di sequenziamento.
La qualità, l'accuratezza e la riproducibilità degli approcci di sequenziamento di nuova generazione dipendono dal metodo di preparazione del campione. Quando si isola un sottogruppo di cellule o si generano sospensioni monocellulari dai tessuti, metodi ottimali di digestione e purificazione sono essenziali per massimizzare il numero di cellule, la vitalità e la purezza della popolazione cellulare 4,5. Ciò richiede un equilibrio nel metodo di digestione: una forte digestione è necessaria per liberare le cellule dal tessuto e ottenere abbastanza cellule per gli approcci a valle, ma la vitalità cellulare sarà influenzata negativamente se la digestione è troppo forte 6,7. Inoltre, la purezza della popolazione cellulare è necessaria per risultati solidi e un'analisi accurata dei dati, che può essere realizzata tramite FACS. Ciò evidenzia l'importanza di ottimizzare i metodi di isolamento cellulare per applicare il sequenziamento di prossima generazione a modelli consolidati di sviluppo vascolare.
Un modello ben caratterizzato per studiare lo sviluppo vascolare è il modello di sviluppo vascolare retinico murino. La vascolarizzazione retinica murina si sviluppa postnatale in un plesso superficiale bidimensionale, con germinazione angiogenica iniziale dal nervo ottico visibile al giorno postnatale (P)3, fronte angiogenico con cellule a stelo e punta e maturazione iniziale dei vasi visibili a P6 e maturazione del plesso vascolare visibile dopo P9 8,9. Durante il rimodellamento del plesso vascolare iniziale, le cellule endoteliali subiscono una specifica verso fenotipi arteriosi, capillari e venosi in diversi vasi per generare una rete circolatoria10,11. Pertanto, questo metodo consente ai ricercatori di visualizzare la formazione del plesso vascolare angiogenico e la specifica e la maturazione endoteliale arterioso-venosa in vari punti temporali durante lo sviluppo9. Inoltre, questo modello fornisce un metodo per studiare gli effetti della manipolazione transgenica sull'angiogenesi e sullo sviluppo del plesso vascolare, che è stato applicato per lo studio dello sviluppo vascolare, delle malformazioni arterio-venose e della neovascolarizzazione indotta dall'ossigeno 12,13,14,15,16 . Al fine di combinare approcci di sequenziamento di nuova generazione con il modello di sviluppo vascolare retinico murino, è necessario un protocollo ottimizzato per l'isolamento delle cellule endoteliali dal tessuto retinico.
Questo protocollo descrive un metodo ottimizzato per digerire il tessuto retinico dai topi a P6 per massimizzare la resa, la purezza e la vitalità delle cellule. Il tessuto retinico viene isolato dai topi P6, digerito per 20 minuti, immunocolorato per CD31 e CD45 e purificato attraverso FACS per isolare una sospensione a singola cellula di cellule endoteliali in circa 2,5 ore (Figura 1A). Si è scoperto che queste cellule endoteliali mantengono un'elevata vitalità per 60 minuti dopo l'isolamento17, consentendo la preparazione della libreria per i metodi di sequenziamento di prossima generazione. Inoltre, vengono forniti risultati rappresentativi per i risultati del gating FACS e del controllo di qualità da due diversi metodi di sequenziamento di nuova generazione che utilizzano questo protocollo di isolamento: sequenziamento dell'RNA dell'intero trascrittoma e sequenziamento dell'RNA a singola cellula. Questo metodo consente di utilizzare approcci di sequenziamento di nuova generazione in combinazione con il modello di vascolarizzazione retinica per chiarire nuovi meccanismi di sviluppo vascolare.

<table><tbody><tr><td>2 ml di Eppendorf provette con chiusura di sicurezza</td><td>USA Scientific</td><td>4036-3352</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Provette Falcon con filtro cellulare Tappo a scatto</td><td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Piatto di coltura non trattato</td><td>TC Corning</td><td>430589</td><td></td></tr><tr><td>APC Rat Anti-Mouse CD31</td><td>BD Biosciences</td><td>551262</td><td></td></tr><tr><td>APC Rat IgG2a &kappa; Controllo degli isotipi</td><td>BD Biosciences</td><td>553932</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSChorus Software</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSCHORUS</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSMelody Cell Sorter</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSMELODY</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi di tipo II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>234115</td><td></td></tr><tr><td>Costar Piastre a pozzetti multipli trasparenti a 48 pozzetti trattate con TC, confezionate singolarmente, sterili</td><td>Corning</td><td>3548</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Gibco</td><td>A2494001</td><td></td></tr><tr><td>Pipette monouso a trasferimento graduato</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-711-9AM</td><td></td></tr><tr><td>Vaschetta di dissezione Cera</td><td>Carolina</td><td>629100</td><td></td></tr><tr><td>Forbici da dissezione</td><td>Strumenti per scienze</td><td>14085-08</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio da dissezione M165 FC</td><td>Leica</td><td>M165FC</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11965-052</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp; Provette flessibili Provette per microcentrifuga 1,5 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22364120</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Gemini Bio</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>Pinze per dissezione fine</td><td>Strumenti per scienze fini</td><td>11250-00</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata di Hank (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630130</td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA Kit di sintesi</td><td>Bio-Rad</td><td>1708890</td><td></td></tr><tr><td>isoflurano, USP</td><td>Covetrus</td><td>11695067772</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp Bagnomaria Deluxe per uso generico</td><td>Fisher Scientific</td><td>FSGPD20</td><td></td></tr><tr><td>Primer: ActB_Forward: 5'- agagggaaatcgtgcgtgac -3'</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Primer: ActB_Reverse: 5'- caatagtgatgacctggccgt -3'</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Primer: CD31_Forward: 5'- gagcccaatcacgtttcagttt -3'</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Primer: CD31_Reverse: 5'- tccttcctgcttcttgctagct -3'</td><td>Tecnologie DNA integrate</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Primer: CD45_Forward: 5'- gggttgttctgtgccttgtt -3'</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Primer: CD45_Reverse: 5'- ctggacggacacagttagca -3'</td><td>Tecnologie del DNA integrate</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Primer: VE-Cadherin_Forward: 5'- tcctctgcatcctcactatcaca -3'</td><td>Tecnologie del DNA integrate</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Primer: VE-Cadherin_Reverse: 5'- gtaagtgaccaactgctcgtgaat -3'</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Ioduro di propidio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plus Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga Sorvall Legend Micro 21R, refrigerata</td><td>ThermoFisher</td><td>75002477</td><td></td></tr><tr><td>SYBR-Green iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5120</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione blu di tripano</td><td>ThermoFisher</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>V450 Rat Anti-Mouse CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>560501</td><td></td></tr><tr><td>V450 Rat IgG2b, &kappa; Controllo degli isotipi</td><td>BD Biosciences</td><td>560457</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento di cellule endoteliali retiniche murine per il sequenziamento di nuova generazione

Isolation of Murine Retinal Endothelial Cells for Next-Generation Sequencing

I recenti miglioramenti nel sequenziamento di prossima generazione hanno fatto progredire la conoscenza dei ricercatori sulla biologia molecolare e cellulare, con diversi studi che rivelano nuovi paradigmi nella biologia vascolare. L'applicazione di questi metodi a modelli di sviluppo vascolare richiede l'ottimizzazione delle tecniche di isolamento cellulare da tessuti embrionali e postnatali. La resa cellulare, la vitalità e la purezza devono essere tutte massime per ottenere risultati accurati e riproducibili dagli approcci di sequenziamento di prossima generazione. Il modello di vascolarizzazione retinica neonatale del topo viene utilizzato dai ricercatori per studiare i meccanismi dello sviluppo vascolare. I ricercatori hanno utilizzato questo modello per studiare i meccanismi dell'angiogenesi e la specifica del destino arterioso-venoso durante la formazione e la maturazione dei vasi sanguigni. L'applicazione di tecniche di sequenziamento di nuova generazione per studiare il modello di sviluppo vascolare retinico richiede l'ottimizzazione di un metodo per l'isolamento delle cellule endoteliali retiniche che massimizzi la resa, la vitalità e la purezza delle cellule. Questo protocollo descrive un metodo per l'isolamento, la digestione e la purificazione del tessuto retinico murino utilizzando la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS). I risultati indicano che la popolazione di cellule endoteliali CD31+/CD45- purificata da FACS è altamente arricchita per l'espressione genica delle cellule endoteliali e non mostra alcun cambiamento nella vitalità per 60 minuti post-FACS. Sono inclusi risultati rappresentativi degli approcci di sequenziamento di nuova generazione su cellule endoteliali isolate con questo metodo, tra cui il sequenziamento dell'RNA di massa e il sequenziamento dell'RNA a singola cellula, dimostrando che questo metodo per l'isolamento delle cellule endoteliali retiniche è compatibile con le applicazioni di sequenziamento di prossima generazione. Questo metodo di isolamento delle cellule endoteliali retiniche consentirà tecniche avanzate di sequenziamento per rivelare nuovi meccanismi di sviluppo vascolare.

La digestione del tessuto retinico e l'immunocolorazione per CD31 e CD45 si traducono in una popolazione identificabile di cellule endoteliali CD31+/CD45- dopo il gating per cellule, singole cellule e vitalità (Figura 2A). L'immunocolorazione CD45 è necessaria per eliminare le cellule CD31+/CD45+, che includono piastrine e alcuni leucociti21. I controlli devono essere eseguiti per ogni esperimento per mostrare la specificità degli anticorpi e guidare la strategia di g...

Questo protocollo descrive un metodo per l'isolamento di cellule endoteliali retiniche postnatali murine ottimizzate per la resa, la purezza e la vitalità delle cellule. Queste cellule sono adatte per approcci di sequenziamento di prossima generazione.

Isolamento di cellule endoteliali retiniche murine per il sequenziamento di nuova generazione

Recent improvements in next-generation sequencing have advanced researchers&#39; knowledge of molecular and cellular biology, with several studies ...

Questo metodo di isolamento delle cellule endoteliali retiniche consentirà tecniche avanzate di sequenziamento per rivelare nuovi meccanismi di sviluppo vascolare. Il protocollo descritto è ottimizzato per elevati gradi di vitalità e purezza, che sono essenziali per le applicazioni di sequenziamento di prossima generazione. A dimostrare la procedura sarà Shelby Cain, uno studente laureato del laboratorio Hershey.Inizia a rimuovere gli occhi dal topo neonatale eutanasia tagliando via la pelle e la membrana sopra l'occhio con un'incisione perpendicolare alla palpebra usando le forbici da dissezione. Quindi utilizzare la pinza per premere verso il basso sopra e sotto l'occhio in modo che l'occhio si sposti fuori dalla presa. Pizzicare delicatamente sotto l'occhio con la pinza e tagliare il nervo ottico che mantiene l'occhio attaccato.Quindi posizionare entrambi gli occhi del topo in un pozzetto della piastra a 48 pozzetti nel PBS ghiacciato appena preparato fino al termine della raccolta. Per isolare il tessuto retinico del topo, sospendere gli occhi nel tampone di dissezione in una capsula di Petri riempita con 500 microlitri di PBS ghiacciato utilizzando un tampone per tubi di trasferimento con una punta larga. Lavorando al microscopio a dissezione, tenere il nervo ottico con una pinza fine e utilizzare la seconda pinza per perforare il foro attraverso la camera anteriore dell'occhio dove si collegano la cornea e la sclera.Quindi strappare il foro in un cerchio circa il 75% del percorso intorno alla cornea. Mentre si tiene il nervo ottico con una pinza, utilizzare la seconda pinza per strappare delicatamente la sclera e il corpo vitreo dal tessuto retinico. Per rimuovere la lente e i vasi del plesso ialoide, raggiungere la retina con una pinza aperta fino quasi a toccarla e quindi chiudere la pinza per afferrare e tirare la lente e i vasi del plesso ialoide fuori dalla retina.Quando tutti i vasi vengono rimossi, posizionare le retine nei tubi di micro-centrifuga da due millilitri riempiti con 500 microlitri di un PBS ghiacciato. Rimuovere il PBS in eccesso dal tubo di microcentrifuga da due millilitri con una pipetta lasciando circa 100 microlitri di PBS nel tubo per coprire completamente il tessuto retinico. Quindi aggiungere 500 microlitri della soluzione di digestione appena preparata al tubo.Utilizzare una pipetta P1000 e una punta di pipetta per pipettare su e giù per il tessuto retinico nella soluzione di digestione cinque volte. Al termine, incubare la miscela di digestione in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 20 minuti con pipettaggio della miscela di digestione su e giù ogni cinque minuti come spiegato prima. Dopo l'incubazione, il tessuto retinico si dissolverà in una sospensione a singola cellula rendendo la miscela di digestione torbida.Quindi, pellettare le celle mediante centrifugazione a 375 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, rimuovere il PBS dal pellet cellulare lavato mediante pipettaggio e quindi immunocolorare le cellule risospendendo il pellet in 100 microlitri di soluzione anticorpale per 0,5 volte 10 alle sesta celle. Incubare la sospensione monocellulare con la soluzione anticorpale per 30 minuti sul ghiaccio al buio picchiettando il tubo ogni 10 minuti per mescolare delicatamente le cellule.Per la selezione delle cellule attivata dalla fluorescenza, pellettare le celle mediante centrifugazione a 375 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver rimosso il surnatante, lavare e pellettare le cellule in 500 microlitri di PBS come descritto in precedenza. E poi risospendere le cellule in 300 microlitri di selezione cellulare attivata dalla fluorescenza o tampone FACS mescolando delicatamente con la pipetta.Successivamente, aggiungere ioduro di propidio o PI come marcatore di vitalità alle provette contenenti il tampone FACS per ottenere una concentrazione finale di 0,5 microgrammi per millilitro. Utilizzare una pipetta per trasferire le sospensioni cellulari attraverso un tappo a scatto contenente un filtro da 35 micron in una provetta da cinque millilitri. Dopo la filtrazione, tenere il tubo FACS sul ghiaccio al buio e quindi trasferire il tubo nella selezionatrice cellulare.Accendere lo strumento FACS e il computer e aprire il software FACS per eseguire e utilizzare lo strumento FACS. Eseguire test di controllo qualità di routine. Caricare i campioni di macchie di controllo nello strumento FACS per regolare gli assi.Inizia con le cellule solo anticorpali IgG per generare e regolare la dispersione in avanti e la dispersione laterale. Quindi l'anticorpo CD31 solo per generare e regolare CD31. E poi l'anticorpo CD45 solo per generare e regolare CD45.Registrare i dati dai campioni di controllo. Quindi, caricare le celle del campione colorato nello strumento FACS ed eseguire il campione. Andare le celle in base ai parametri di forward scatter o FSC e side scatter o SSC.Cellule del cammino di FSCA e FSCH per identificare i doppietti cellulari e raccogliere solo singole cellule. Cellule dell'andatura mediante PI e SSCA per identificare le cellule vitali. Crea un'andatura CD31 + CD45 con controlli Crea un'andatura CD31 + CD45 con controlli e andatura le cellule con CD31 e CD45.Inserire un tubo di raccolta con 250 microlitri di tampone FACS nello strumento. Quindi, iniziare a ordinare le celle CD31 + CD45 nel tubo di raccolta installato. Tenere i tubi di raccolta sul ghiaccio per ulteriori analisi.I campioni possono essere elaborati per applicazioni di sequenziamento di nuova generazione. Nello studio, la variazione del tempo di digestione ha influenzato la resa cellulare e la percentuale di vitalità. Il tempo di digestione di 20 minuti ha portato a una resa ottimale con una bassa percentuale di cellule endoteliali non vitali.La successiva colorazione con ioduro di propidio ha dimostrato che le cellule endoteliali isolate sono rimaste vitali per 60 minuti dopo l'isolamento. La purezza della popolazione cellulare è stata valutata mediante analisi quantitativa PCR o qPCRR dell'espressione dei geni delle cellule endoteliali che mostrano un forte arricchimento per i geni delle cellule endoteliali nella popolazione CD31 + CD45. Purificare l'RNA dalle cellule endoteliali isolate convertendo e amplificando il cDNA attraverso la preparazione e il sequenziamento della libreria La libreria di cDNA ha portato a più di 16.000 geni identificati in nove campioni indipendenti.Un calo delle trascrizioni per milione di letture o TPM è stato osservato nei geni al di sotto di questa soglia. Il sequenziamento dell'RNA a singola cellula delle cellule endoteliali retiniche isolate attraverso la pipeline 10x Genomics ha portato a una mediana di 1.171 geni per cellula, 15.247 geni totali rilevati e una mediana di 2.255 identificatori molecolari univoci o conteggi UMI per cellula in 917 cellule. I passaggi critici di questo protocollo sono l'isolamento del tessuto retinico e la digestione dei tessuti, che devono essere eseguiti accuratamente come descritto per ottimizzare la resa e la vitalità cellulare.Le cellule endoteliali isolate possono essere utilizzate in tecniche di sequenziamento avanzate come il sequenziamento dell'RNA dell'intero trascrittoma, il sequenziamento dell'RNA a singola cellula, il sequenziamento dell'immunoprecipitazione della cromatina e il saggio per il sequenziamento della cromatina accessibile alla trasposasi. L'uso di questo metodo ottimizzato in combinazione con metodi di sequenziamento di nuova generazione e approcci computazionali può chiarire ulteriormente i meccanismi delle vie di segnalazione interconnesse che regolano gli sviluppi vascolari.

isolation-murine-retinal-endothelial-cells-for-next-generation

Research

Ricerca

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

In questo video ci dimostra come isolare le cellule staminali della retina dalla epitelio ciliare dell'occhio del mouse e farle crescere in coltura per formare clonale sfere della retina. Le sfere che sono isolati possiedono le caratteristiche cardine delle cellule staminali: l'auto-rinnovamento e multipotenzialità.

Isolamento di cellule staminali della retina dalla Eye mouse

Questo video mostra la procedura per isolare le cellule gangliari retiniche primarie murine (RGC) utilizzando la citometria a flusso. Questo metodo consente lo studio futuro delle RGC, con l'obiettivo di comprendere meglio il principale declino dell'acuità visiva che deriva dalla perdita di RGC funzionali nelle malattie neurodegenerative.

Isolamento delle cellule gangliari retiniche murine mediante smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza

La capacità di isolare le cellule endoteliali delle valvole cardiache (VEC) è fondamentale per comprendere i meccanismi di sviluppo, mantenimento e malattia delle valvole.  Qui descriviamo l'isolamento di VEC da topi Tie2-GFP embrionali e adulti utilizzando FACS che consentiranno studi che determineranno il contributo dei VEC nei processi di sviluppo e malattia.

Isolamento di cellule murine endoteliali Valve

Le cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC) derivano da (hemogenic) cellule endoteliali specializzate durante lo sviluppo, ma poco si sa circa il processo attraverso il quale alcune cellule endoteliali specificano a diventare la formazione del sangue. Dimostriamo un metodo basato citometria a flusso che permette l'isolamento simultaneo di cellule endoteliali hemogenic e HSPC da tessuti embrionali murine.

Isolamento di cellule murine embrionali Hemogenic endoteliali

Qui presentiamo un approccio combinatorio per la classificazione di tipi di cellule neuronali prima dell'isolamento e per la successiva caratterizzazione di transcriptomi a singola cellula. Questo protocollo ottimizza la preparazione di campioni per il successo RNA Sequencing (RNA-Seq) e descrive una metodologia studiata appositamente per una migliore comprensione della diversità cellulare.

Sequenza RNA a singola cellula di sottogruppi definiti delle cellule del Ganglio retinico

Milioni di persone soffrono di malattie degenerative della retina che provocano cecità irreversibile. Un elemento comune di molte di queste malattie è la perdita delle cellule del ganglio retinico (RGC). Questo protocollo dettagliato descrive l'isolamento di RGC murine primari mediante selezione positiva e negativa con citometria a flusso.

Isolamento delle cellule della ganglioma della retina primaria (RGC) mediante citometria a flusso

Presentiamo un metodo per isolare cellule e nuclei endoteliali dal lume delle arterie carotidi di topo esposte a condizioni di flusso stabili o disturbate per eseguire esperimenti omici a singola cellula.

Isolamento delle cellule endoteliali dal lume delle arterie carotidi di topo per esperimenti multi-omici a singola cellula

Questo manoscritto descrive un protocollo semplificato per l'isolamento delle cellule dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) dagli occhi dei topi in modo graduale. Il protocollo include l'enucleazione e la dissezione degli occhi di topo, seguita dall'isolamento, dalla semina e dalla coltura delle cellule RPE.

Isolamento delle cellule primarie dell'epitelio pigmentato retinico del topo

Questo articolo descrive un metodo per l'isolamento basato su biglie magnetiche di cellule endoteliali murine dai capillari linfatici dermici. Le cellule endoteliali linfatiche isolate possono essere utilizzate per esperimenti in vitro a valle e per l'analisi dell'espressione proteica.

Isolamento di cellule endoteliali linfatiche dermiche murine

L'epitelio pigmentato retinico (RPE) agisce come una barriera cruciale tra la coroide e la retina, promuovendo la salute e la funzione dei tipi di cellule retiniche, come i fotorecettori. In questo articolo, descriviamo un protocollo semplice ed efficace per isolare e coltivare l'EPR murino adulto.

Un metodo semplificato per l'isolamento e la coltura di cellule epiteliali pigmentate retiniche da topi adulti

La retina mostra una complessa organizzazione spaziale attraverso la sua struttura laminare. Le moderne tecniche di trascrittomica spaziale e sequenziamento richiedono sezioni di tessuto &lt; 20 μm di spessore, limitandone l'applicabilità nella ricerca retinica. Questo metodo di criosezione appena congelato produce sottili sezioni en face della retina di topo preservando le relazioni spaziali planari, consentendo una mappatura molecolare completa tra le lamine.

En face Criosezione della retina di topo per analisi molecolare spaziale ad alta dimensione

Impara l'isolamento di cellule endoteliali retiniche murine ottimizzato per rendimento, purezza e vitalità. Questo metodo facilita il sequenziamento di nuova generazione per studiare lo sviluppo vascolare.

Isolamento di cellule endoteliali retiniche murine per il sequenziamento di nuova generazione

Esplora altri video