使用Sigma的提取物N -安培组织PCR试剂盒小鼠组织的快速基因分型

嗨，我叫 Linda，在加州大学尔湾分校 Edwin Niki 博士的实验室工作。今天，我将向您展示如何使用 stigma 的 Cyber green，提取组织 PCR 试剂盒来快速对小鼠进行基因分型或转基因小鼠。通常，当我进行急性解离细胞培养时，我会使用这个试剂盒对胚胎小鼠进行基因分型，我需要快速、快速地找出小鼠的基因型。

但就今天而言，我们有成年小鼠尾巴，我们可以在其中向您展示我如何使用这个工具包。该方案包括快速的艾尔消化和 DNA 提取，然后是快速的中和步骤。我们在实时 PCR 中使用提取的 DNA，在那里我们可以监测我们的 PCR 扩增子。

因此，如果您准备好了，让我们开始吧。因此，在开始之前，我们要确保将加热块设置为 95 摄氏度，确保我们的 Cyber Green 已解冻并保存在冰上，直到需要为止，并且我们的其他试剂已解冻至室温。在我的冰桶里，我有我的两个引物，我们将使用它们进行基因分型，它们是专门为我们的目标基因设计的，并针对 QPCR 进行了验证。

我还有目标基因的阳性对照和阴性对照，以及我已经从成年小鼠那里收集的组织样本。现在，当您采集组织样本时，非常严格非常重要。当我们收集胚胎小鼠尾巴时，我们总是在每次组织收集之前和之前用 70% 乙醇冲洗镊子。

我们总是在 TBS 中冲洗尾部样品，首先您必须为每个尾部制作组织制备和 DNA 提取的预混液，您将需要 100 微升的提取溶液和 25 微升的组织制备溶液。我将使用我的 P 200 和过滤移液器吸头，将 100 微升提取溶液和 25 微升组织制备溶液量出到新的 eend rph 管中。您将需要通过上下移液来混合预混液溶液。

因此，您需要将 125 μL 预混液添加到您的目标预混液中，确保如果是成年小鼠尾巴，则切割端完全浸没在主麦克风溶液中，您可以用手指涡旋，并在室温下孵育 10 分钟。在 10 分钟的孵育过程中，我将准备我最喜欢的绿色预混液，其中包括他们包含在试剂盒中 milli Q 或 PCR 级水的苹果酒绿色预混液，以及我们的引物、一些 PCR 级水以及我们的正向和反向引物。就是这样。

现在 10 分钟的孵育已经结束，我们必须在 95 度下加热并激活反应 3 分钟。我们的 3 分钟灭活已经完成，现在我们将添加试剂盒中提供的中和溶液，我们将每个反应添加 100 微升，您将通过涡旋混合。添加中和缓冲液后，您的 DNA 样品可以储存在 4 摄氏度下，直到您准备好使用它们。

我们实际上需要立即获得我们的基因型。所以我们立即进入 QPCR，这样我的尾巴就被中和了，准备好了。我的 Cyber Green PCR 预混液已准备就绪，并且已将 PCR 管设置在冷块上。

我现在要做的就是向每个孔中加入 16 微升预混液，然后向每个孔中加入 4 微升共融提取物或 4 微升阳性或阴性对照。好吧，我所做的只是在每笔财富中加入 16 微升的预混液。然后，我将 4 微升中和提取物添加到孔中的 60 微升预混液中，总共 20 微升反应体积。

我将对阳性和阴性对照执行相同的作。加入 4 μL 至 16 μL 的 PPR 预混液。一旦它们全部添加，您就可以用光学透明的 8 盖条盖住它们。

您需要小心，不要触摸样品上方的瓶盖透明部分。所以我用 Kim 抹布向下推 Caps 以确保它们被密封。因此，我轻轻涡旋我们的 PCR 和 DNA 混合物，并将它们离心下来，现在我们准备将它们放入 QPCR 机器中。

我们要做的是，首先，我们将样品加载到 Opticon PCR 机器中，然后设置一个新的板，我们的第一个孔将是我们的样品。我们的第二个孔将是我们的阳性对照，第三个孔是我们的阴性对照，发现我们的反应体积总共为 20 微升。接下来，我将加载一个专为快速基因分型的人设计的方案。

该协议包括一个 3 分钟的变性步骤，一个 15 秒的变性循环，15 秒的初次跪下，然后是 20 秒的初次伸展。现在，主扩展油箱实际上可以下降到大约 10 秒，总共只有 40 秒。对于每个循环，我们让这三个步骤像普通 PCR 一样循环大约 40 次，然后在结束时我们获取熔解曲线。

因此，我们已经设置了板并加载了我们的方案。我们现在要做的就是运行我们的 QPCR，它从 3 分钟的变性物质开始。根据我的经验，使用我正在使用的引物和尾部样本，以及您寻找我正在寻找的基因，我知道我的阳性结果将在 25 个周期左右开始出现，跨越一个显著性周期阈值。

现在，何时交叉在很大程度上取决于您的组织样本、您要寻找的内容以及最初存在的 DNA 量。所以我们已经可以看到我们的阳性对照已经出现，看起来我们的样本也是阳性的。如您所见，在我们阳性对照之后，它开始出现一点。

我们仍然需要等待它结束，因为它只有 27 个循环，但希望再过几个循环，我们可以确定我们的样本是阳性的，然后我可以继续我的实验。此时，你可以看到阴性对照刚刚开始出现，那是因为我服用了过多的尾巴。这有助于您确保在这个多余的负尾之前出现的任何东西都是正的。

所以在这一点上，任何在负数之前出现的东西，我都会认为是正的，然后我会继续我的实验。PCR 完成循环后，机器进行熔解曲线分析。这将帮助您确定产品的成分和纯度。

这样，您可以判断是否正确选择了阳性和阴性样本。例如，阳性样品将具有特定的尖锐熔解温度峰，该峰对应于扩增的特定 PCR 产物。任何阴性样品都将具有非特异性宽熔解温度峰，对应于在 PCR 过程中扩增的非特异性 DNA。

我刚刚向您展示了我们如何使用 Sigma 的 Cyber Green 提取放大器对成年小鼠尾巴进行快速基因分型。但是这个试剂盒可以与各种动物组织、毛发、唾液一起使用，我用它来对小鼠胚胎尾巴进行基因分型。我们喜欢使用这个套件，因为它非常快速。

我可以在一小时内取回我的基因型，这非常方便和简单。所以感谢收看，祝你好运。