CRISPR-Cas12a와 결합된 재조합 중합효소 증폭을 사용한 현장 배치 가능 칸디다투스 리베리박터 아시아티쿠스 검출

황 롱 빙, HLB로 약칭. 전 세계적으로 치명적인 감귤류병입니다. 중국과 미국과 같은 대부분의 감귤류 생산 국가에서 HLB는 체관 제한 박테리아 칸디다투스 리베리박터 아시아티쿠스(CLas로 약칭)에 의해 발생합니다.

CLas의 조기 발견은 재배자가 조기 개입을 촉진하고 질병 확산을 예방하는 데 중요했습니다. 그래서 여기서 우리는 재조합 효소 중합효소 증폭 및 CRISPR-Cas12a 시스템과 결합하여 신속하고 휴대 가능한 HLB 진단을 위한 새로운 방법을 개발했습니다. 우리는 그것을 CLas-DETECTR라고 불렀습니다.

우리 플랫폼의 감도는 PCR보다 훨씬 높습니다. 또한, 잎 샘플을 사용했을 때 qPCR과 유사한 결과를 보여줍니다. 기존의 CLas 검출과 비교하여 당사의 방법은 90분 내에 완료할 수 있으며 등온 조건에서 작동합니다.

결과는 또한 현장에서 휴대용 형광 검출 장치를 통해 시각화할 수 있습니다. CLas-DETECTR에는 용액 준비, 감귤류 총 DNA 분리, 등온 DNA 증폭 및 시각화 결과의 4단계가 포함됩니다. CLas-DETECTR 분석의 개략도가 여기에 설명되어 있습니다.

완충액 A, 용액 B, 및 용액 C는 프로토콜에 기재된 바와 같이 제조된다. 시간을 절약하고 이 방법을 현장 CLas 검출에 적합하게 만들기 위해 E.coli 폴리에틸렌 글리콜 기반 접근법을 사용하여 DNA 증폭을 위한 조식물 추출물을 얻었습니다. 감귤류 잎은 도구에 사용됩니다.

잎에서 잎 디스크 몇 조각을 펀치하십시오. 리프 디스크를 1.5 밀리리터 에펜 도르프 튜브에 넣으십시오. 그런 다음 200 마이크로 리터의 버퍼 A를 튜브에 첨가하십시오.

플라스틱 막대로 수동으로 부드러워 질 때까지 잎 디스크를 연마하십시오. 튜브를 10 분 동안 그대로 두십시오. 상청액은 이어서 DNA 증폭에 적용됩니다.

등온 DNA 증폭을 위해 2.3단계의 상청액 1마이크로리터와 아세트산마그네슘 1마이크로리터를 용액 B에 넣고 잘 섞습니다. 실험실에서 간단한 인큐베이터에서 37도에서 15 분 동안 배양하십시오. 결과를 시각화하려면 3.2단계의 혼합물 10마이크로리터를 용액 C에 넣고 잘 섞습니다.

37도 인큐베이터에서 60 분 동안 배양하십시오. 고글을 착용하고 휴대용 형광 감지 장치를 통해 녹색 형광 신호를 관찰합니다. CLas-DETECTR의 특이성을 테스트하기 위해, 아그로박테리움 투메파시엔스 GV3101의 첫 번째 순수 콜로니, 크산토모나스 시트리 아종.

우리 실험실에서 분리 된 감귤류 구내염과 Burkholderia stabilis 균주 1440의 병원균 인 Citri는 게놈 DNA를 추출하는 데 사용되었습니다. 그 다음 3개의 박테리아 게놈 DNA와 CLas 양성 뉴홀 잎 게놈 DNA를 CLas-DETECTR 검사를 실시하였다. CLas-DETECTR의 민감도를 테스트하기 위해, 프로토콜에 기재된 바와 같이 PCR, CLas-DETECTR 및 qPCR을 사용하여 일련의 CLas DNA 단편 희석물을 검출하였다. 특이성 및 민감도 테스트 후, CLas-DETECTR 방법을 사용하여 현장에서 CLas의 존재를 검출하였다.

중국 장시성 간난 사범대학 캠퍼스의 생식질 자원 보육원에서 자란 Newhall 달콤한 오렌지 나무에서 채취한 잎 샘플. 실험실에서 일반적으로 사용되는 설득력 있는 CLas 검출 방법인 qPCR도 적용되었습니다. 우리 실험실에서 CLas의 존재가 확인 된 HLB 감염 및 HLB 감염되지 않은 Newhall 나무의 잎 샘플은 CLas-DETECTR 테스트를 받았습니다.

녹색 형광 신호는 HLB-감염된 샘플에서 포착되었지만, HLB-감염되지 않은 음성 대조군에서는 포착되지 않았다. 다른 박테리아에서 추출한 핵산을 사용하여 CLas-DETECTR의 특이성을 결정했습니다. CLas-DETECTR 분석에서 CLas 양성 뉴홀 잎에서 추출한 gDNA만이 녹색 형광 신호를 나타냈습니다.

아그로박테리움 투메파시엔스 GV3101, 크산토모나스 시트리 아종 시트리 및 버크홀데리아 스태빌리스 균주 1440에서 추출한 gDNA는 그렇지 않았으며, 이는 CLas-DETECTR이 CLas를 특이적으로 검출할 수 있음을 의미합니다. 또한 프로토콜에 나열된 일련의 CLas DNA 희석액을 사용하여 CLas-DETECTR의 민감도를 테스트했습니다.

PCR은 메가리터당 201개의 사본을 검출할 수 있습니다. 반면에 CLas-DETECTR는 메가리터당 2.01개의 복사본을 감지할 수 있어 민감한 현장 진단으로 사용할 수 있음을 시사합니다. qPCR은 메가리터당 0.201개의 카피를 검출할 수 있으며 Ct 값은 36보다 높습니다.

따라서 CLas-DETECTR은 희석된 CLas 특이적 앰플리콘을 사용했을 때 기존 PCR보다 2배 더 민감하고 qPCR보다 1배 덜 민감합니다. 마지막으로, 현장 샘플에 대한 CLas-DETECTR의 타당성을 재검토하고 민감도를 qPCR과 비교했습니다. 숫자로 보면 알 수 있습니다.

CLas 농도가 메가리터당 0.2 카피 미만일 때 Ct 값이 36보다 높으며 이는 매우 낮은 농도임을 알 수 있습니다. 15개의 샘플 중에서, qPCR에 의해 검출된 샘플 1, 2, 3, 4, 8, 10, 13 및 14의 Ct 값은 36 미만이었다. 명백한 녹색 형광 신호가 관찰되었다.

반면, qPCR에 의해 검출된 샘플 6, 7, 9, 12 및 15의 Ct 값이 결정되지 않은 경우, 녹색 형광 신호는 관찰되지 않았다. 또한, qPCR에 의해 검출된 샘플 5 및 11의 CT 값이 36보다 높을 때 약한 녹색 형광 신호가 관찰되었다. 결과는 우리 플랫폼이 현장에서 HLB 진단을 위한 빠르고 강력하며 민감한 도구임을 시사합니다.