通过听觉环路解析脆性X智力低下蛋白的细胞自主功能 在卵内 电穿孔

本方案是一种在体内研究FMRP在发育过程中细胞自主功能的方法。该方法有助于理解脆性X综合征的细胞类型特异性病理生理机制。本方法采用特定时期、特定部位和特定方向的电穿孔技术，导入含有Fmr1小发夹RNA的药物可诱导载体系统。

通过该方法，我们实现了在听觉回路中对 FMRP 的特异性敲低。该方法也可用于研究其他基因在听觉回路或前庭系统中的功能。首先将鸡蛋水平放置，使胚胎位于蛋的上方，便于操作。

在38摄氏度下孵育46至48小时，直至达到Hamburger and Hamilton（HH）12期，用于神经管转染；或孵育54至56小时，直至HH 13期，用于耳囊转染。从孵育箱中取出鸡蛋，每次取一打。鸡蛋离开孵育箱的时间超过一小时会引入发育差异并降低存活率。

使用手电筒从鸡蛋底部照射光线。胚胎的位置会在蛋壳上呈现为一个暗区。用铅笔在蛋壳上标记胚胎的位置。

用含75%乙醇的纱布擦拭鸡蛋，在鸡蛋尖端用剪刀尖端钻一个小孔。然后，使用18号针头的注射器抽出2毫升蛋清。确保小孔仅足够插入针头即可。

用纱布擦去渗出的白蛋白，并用透明胶带封住孔洞。用透明胶带覆盖蛋的顶部，中心对准铅笔标记的暗区，以尽量减少裂纹并防止开窗过程中壳碎片掉落。用含75%乙醇的纱布擦拭所有手术器械，并用75%乙醇擦拭已覆盖胶带的区域。

使用小型剪刀在铅笔标记周围剪出一个一至二平方厘米的窗口，沿圆周操作。操作时保持剪刀平放，以避免损伤下方的胚胎。将开窗后的卵置于体视显微镜下，使用10倍目镜和2倍变焦。

用1毫升注射器吸取墨水溶液，然后安装27号针头。使用镊子将针头弯曲成45度角。在显微镜下，从视杯边缘小心刺入，并将针头插入胚胎下方。

注射约50微升墨水，使其扩散至明区下方，以实现胚胎的可视化。墨水将形成深色背景，便于清晰观察胚胎。使用拉针仪将玻璃毛细管拉制成移液针。

在解剖显微镜下，用镊子小心地将毛细玻璃针的尖端打开至直径10至20微米。将移液管存放于储存盒中，直至使用。接下来，通过注射器对移液管末端的橡胶管施加负压，将0.5至1微升的质粒混合物吸入毛细玻璃移液管中。

将卵置于显微镜下，使胚胎垂直定向，尾部朝向操作者。用一只手或三轴操纵器握住毛细移液管，将移液管尖端沿尾部至头部方向推进至菱脑节5到6区域。

轻轻将吸头穿过卵黄膜，进入背侧神经管，然后稍微回撤移液器，使吸头位于神经管腔内。通过施加气压注入质粒混合物，直至带颜色的质粒充分扩散至第5至第6菱脑节，并延伸至第3和第4菱脑节。检查注射是否成功：当蓝色质粒溶液在神经管内快速扩散且无泄漏时，即为注射成功。

当发生泄漏时，蓝色会迅速消退。注射后立即在神经管两侧放置铂金双极电极，使用电穿孔仪施加两轮脉冲，每轮电压为12伏，持续时间为50毫秒。

观察双极电极末端的气泡，负极一侧气泡较多。检查电穿孔是否成功，当染色的质粒混合物进入电极正极侧附近的神经管组织时，即表示电穿孔成功。电穿孔后，小心移除双极电极。

用预先切成两英寸见方并喷有75%乙醇的透明薄膜覆盖蛋壳上的窗口。将鸡蛋放回培养箱中。在处理下一个鸡蛋之前，通过在生理盐水中施加10至20次12伏、持续50毫秒的脉冲来清洁双极电极。

在显微镜下，将卵放置成胚胎呈垂直方向，尾部朝向操作者。手持毛细移液管，轻轻从背外侧方向刺入右侧耳囊。利用气压注入质粒混合物，直至耳囊充满蓝色溶液。

检查注射是否成功，成功的标志是蓝色质粒混合物被限制在耳囊内且无泄漏。注射后立即在耳囊上放置双极电极，将正极和负极分别置于耳囊的前侧和后侧。使用电穿孔仪传递两轮脉冲，每轮电压为12伏，持续时间为50毫秒。

检查电穿孔是否成功，当蓝色质粒混合物进入耳囊组织靠近电极正极一侧时，即表示电穿孔成功。电穿孔后，小心移除双极电极，并用透明薄膜覆盖蛋壳上的窗口，最后将鸡蛋放回孵育箱中。

代表性图像显示了在胚胎第2天（E2）进行神经管转染并给予多西环素处理后，胚胎第3天（E3）的示例。图中横截面显示了转染了Fmr1 shRNA和EGFP的细胞。表达EGFP的细胞局限于神经管和脑干的一侧。图中还展示了E15时期横截面上转染侧表达EGFP的巨细胞核（nucleus magnocellularis, NM）神经元。

在对侧，可见含有 EGFP 的轴突位于尾侧丘系核（nucleus laminaris, NL）的腹侧部分。通过转染 NM 神经元后，FMRP 免疫反应性较邻近未转染神经元显著降低，从而验证了 Fmr1 shRNA 的敲低效果。图中显示了 E19 期具有 FMRP 免疫反应性的听觉神经节。听觉神经节神经元未进行转染。

部分来源于颅神经嵴细胞的胶质细胞被转染。代表性图像显示，在耳囊转染后，听觉管中FMRP表达被敲低。E9时期的听觉管表现出强烈的EGFP荧光。

在横断面切片中，表达EGFP的细胞位于基底乳头和听觉神经节。通过与邻近未转染的毛细胞相比，转染毛细胞中FMRP免疫反应性降低，验证了Fmr1 shRNA的敲低效果。类似地，转染的听觉神经节神经元中FMRP免疫反应性也显著减弱。

通过听觉神经及其特征性的端足终末，追踪转染的听觉神经节神经元在脑干中的中枢投射。在进行该操作时，最重要的是控制电穿孔的位点和方向，以实现选择性转染。在此操作之后，可进行单细胞类型填充、免疫染色、细胞分选结合质谱分析，或单细胞测序，以揭示形态学和生物化学水平上的变化。

该技术还可实现对听觉耳中干细胞回路的其他基因进行具有时间控制和组分特异性的选择性编辑，并可加以改造以操控前庭系统。