Zebra Balığı Kalplerinde CRISPR-Cas9 Aracılı Hassas Knock-In Düzenlemeleri

Protokolümüz, CRISPR düzenlemelerinin hem hassas entegrasyonu hem de basit görsel tespiti için bir boru hattı ve ayrıca düzenleme sonrası fenotiplemenin bir örneğini sağlar. Bu yaklaşımın temel avantajı, başarılı düzenlemelerin verimli ve basitleştirilmiş bir şekilde tanımlanmasını sağlayan CRISPR düzenleme algılamasının kolaylığıdır. Bu yaklaşım, zebra balıklarında hastalıkla ilişkili varyantların basit bir şekilde üretilmesini ve karakterize edilmesini sağlar.

Burada uzun QT sendromunu inceliyoruz. Farmasötik tedavilerle ilgili takip çalışmaları daha sonra araştırılabilir. İlgilenilen gen için zebra balığı ortologunu tanımlayarak hedef bölge dizisini dışlamak için iki sgRNA kılavuzu tasarlayarak başlayın.

Şablonu oluşturmak için kullanılan iki kilobaz kanat dizisi de dahil olmak üzere, hedef bölgeyi ilgilenilen gen dizisi içinde bulmak için Ensembl'i kullanın. CRISPOR gibi bir tasarım yazılımı aracı kullanın ve Danio rerio türlerini ve Cas enzimini seçin. İki sgRNA yaklaşımı için, hedef ekzondan önce bir sgRNA ve hemen aşağı akış intronunda ikinci bir sgRNA seçin.

Seçilen sgRNA'ların yüksek özgüllüğe ve düşük tahmin edilen hedef dışı bağlanmaya sahip olduğundan emin olun. Minimum hedef dışı bağlamaya sahip kılavuzları belirlemek için CRISPOR sıralamalarını kullanın. Şimdi PCR tabanlı Sanger dizileme genotiplemesi için en olası potansiyel hedef dışı bölgeleri belirleyin.

İki sgRNA'yı seçtikten sonra, her biri için ters tamamlayıcıyı, mutasyondan önce gelen iki tamamlayıcı oligoyu ve mutasyonun aşağı yönünde iki tamamlayıcı oligoyu elde edin. Kılavuzu tercih edilen plazmid'e dahil etmek için her oligoya uyumlu kısıtlama bölgeleri ekleyin. Seçilen kılavuz dizilerinin DR274 plazmidine entegrasyonu için, beş asal BSA1 kısıtlama bölgesini kullanarak bir çıkıntı oluşturun ve kılavuzların beş ana ucundaki BSA1 tanıma bölgelerini tasarlayın.

Daha sonra, PKHR5 plazmidinde bulunan M venöz YFP muhabir genini kuşatacak iki dizi parçası seçerek zebra balığında HDR için eksojen şablonu tasarlayın. Şablonu M venöz YFP muhabir geninin her iki tarafına eklemek için iki bölüme ayırın. Kodlama sırasının kesilmesini önlemek için bölünmüş sitenin bir intron içinde olduğundan emin olun.

PKHR5 plazmidine klonlamayı kolaylaştırmak için makalede belirtilen tüm gerekli modifikasyonları dahil edin. Embriyoları döllenmeden yaklaşık 40 dakika sonra bir hücre aşamasında enjekte edin. Üç günlük döllenmeden sonra, zebra balığı larvalarını, kendi kendini düzeltme reflekslerini kaybedene kadar% 0.3 MS222 içeren 25 milimetrelik bir Petri kabına aktararak anestezi yapın.

Anestezi uygulandıktan sonra, larvayı 24 kuyucuklu bir plakanın kuyucuğuna aktarın. GFP veya YFP'yi tespit edebilen bir mikroskop kullanarak, larvaların gözlerinde muhabir gen floresansını tarar. Larvaların görüntülerini yakaladıktan sonra, muhabir gen ifadesinin varlığını veya yokluğunu belgeleyin.

Doğru ve kesin HDR gen düzenlemesini doğrulamak için, daha önce gösterildiği gibi larvaları döllenmeden üç gün sonra anestezi yaparak ve hotshot yöntemini kullanarak genomik DNA'yı kuyruk klipsinden izole ederek genotipleme yapın. Eksize edilmiş kuyruk klipsi 15 mikrolitre 25 milimolar sodyum hidroksite ekleyin ve 20 dakika boyunca 95 santigrat derece inkübe edin, ardından 1.5 mikrolitre tris hidroklorik asit ile nötralize edin. 30 saniye boyunca 13.800 kez G'de santrifüj yapın ve ekstrakte edilen genomik DNA'yı içeren süpernatantı tutun.

Larvaları E3 ortamında kurtarın ve daha fazla çalışma yapılması gerekiyorsa konut sistemine geri gönderin. Ekstrakte edilen genomik DNA'yı şablon olarak kullanarak, hedef içi ve potansiyel hedef dışı bölgelerin PCR tabanlı Sanger dizilimini gerçekleştirin. Hedef üzerindeki primer tasarımın mutasyon bölgesini ve en yakın sgRNA bağlanma bölgesini yakaladığından emin olun.

İlgilenilen genle entegrasyonu doğrulamak için yerleştirilen homoloji kolundan ve hedef genden geçişi tespit etmek için ayrı bir dizileme astarı tasarlayın. Hedef dışı ilk üç potansiyel alanı sıralamak için astarlar tasarlayın. Her zebra balığı için tanımlanabilir genotipleme, kalp atış hızı, perikardiyal boyutlar, EKG fenotipleme ve muhabir gen verilerini derleyin.

YFP M venöz muhabir gen ekspresyonu adalarda gözlendi ve başarılı şablon entegrasyonunun olumlu bir muhabiri olarak hareket etti. Muhabir gen pozitif balıkların, R26Q varyantını ZKCNH6A'ya tanıtan kesin düzenleme G56A'ya sahip oldukları bulundu. Perikardiyal boyutların göz bölgesinin bir oranı olarak ölçümü burada gösterilmiştir.

Zebra balıklarında kardiyak repolarizasyon bozuklukları ile ilişkili perikardiyal ödem artışı ile birlikte bradikardi eğilimi R56Q geni düzenlenmiş larvalarda gözlenmiştir. Döllenmeden üç gün sonra zebra balığı larva kalbinden EKG kaydı burada gösterilmiştir. Bu yaklaşımın en önemli yönü, CRISPR prosedürlerinde sıklıkla olduğu gibi kılavuz tasarımıdır.

Başarılı CRISPR düzenlemeleri için etkili kılavuzlar gereklidir. Daha fazla hassasiyet veya diğer işlevlere izin veren alternatif CRISPR yöntemleri takip edilebilir. Ek olarak, in vivo indüklenebilir bir düzenleme sistemi sağlayan bir asal düzenleme kompleksi gibi büyük genler eklenebilir.