Name: 변형된 샌드위치 ELISA를 사용하여 호중구 세포외 트랩에서 Myeloperoxidase-DNA 및 Neutrophil Elastase-DNA 복합체 정량화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T12:25:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: 학습하세요 변형된 샌드위치 ELISA를 사용하여 호중구 세포외 트랩 잔여물을 정량화하는 방법을. Myeloperoxidase-DNA 및 Neutrophil Elastase-DNA 복합체를 측정하여 패혈증 중증도를 평가할 수 있습니다.

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저자는 원고 검토에 도움을 준 Huq Muhammad Aminul 박사에게 감사를 표합니다.

본 연구는 헬싱키 선언에 따라 수행되었으며, 아이치 의과대학 임상시험심사위원회(2017-H341, 2019-H137)의 승인을 받았다. 각 참가자로부터 서면 동의서를 얻었습니다.
1. 시약 준비
참고: 샌드위치 ELISA 분석을 수행하기 위해 시약은 아래에 설명된 대로 준비됩니다.
<ol><li>코팅 버퍼:<ol><li>0.1 mol/L 탄산염-중탄산염 완충액을 만들기 위해 무수 탄산나트륨 10.6g(분자량, 106g/mol)과 중탄산나트륨 8.4g(분자량, 84g/mol)의 무게를 잰다.</li>
		<li>비커에 있는 약 900mL의 증류수에 추가합니다.</li>
		<li>희석된 염산 또는 수산화나트륨을 필요한 양만큼 첨가하여 완충액의 pH를 9.6으로 조정합니다.</li>
		<li>pH 측정기로 pH를 확인하십시오.</li>
		<li>그런 다음 필요한 양의 증류수를 추가하여 총 부피가 1,000mL가 되도록 합니다.</li>
		<li>이 0.1 mol/L 탄산염-중탄산염 완충액을 4°C의 냉장고에 보관하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>블로킹 버퍼:<ol><li>137mmol/L NaCl, 8.1mmol/L Na2HPO4, 2.68mmol/L KCl 및 1.47mol/L KH 2PO 4(pH 7.4)로 구성된 인산염 완충 식염수(PBS) 70mL에 약 250μL의20% 아지드화나트륨과 1g의 소혈청 알부민(BSA)을 넣고 부드럽게 섞습니다.</li>
		<li>증류수를 첨가하여 총 부피가 100mL가 되도록 합니다. 소 혈청 알부민과 아 지드 화 나트륨의 최종 농도는 각각 1 %와 0.05 %입니다. 10분 정도 기다리면 솔루션을 사용할 준비가 됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>세척 용액: 증류수에 0.5% t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올, 폴리에틸렌글리콜 tert-옥틸페닐 에테르(Triton X-100)를 준비합니다.<ol><li>100 % Triton X-100을 증류수로 10 %로 희석하고 10 % 용액을 사용하기 전에 1 일 동안 방치하십시오.</li>
		<li>그런 다음 10% Triton X-100 용액을 증류수로 20배 다시 희석하여 0.5%의 농도를 얻습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>항체 희석:<ol><li>포획 항체(항-MPO 항체[1mg/mL] 또는 항-NE 항체[1mg/mL])를 코팅 완충액(pH 9.6)에서 1:2,000으로 희석하여 분석 1일차(아래 참조) 및 검출 항체(퍼옥시다아제 접합 항-DNA 항체)를 분석 3일차에 사용하기 전에 PBS로 1:40으로 희석합니다(아래 참조). 참고: 예비 실험을 위해 이소형 항체(IgG 토끼[5mg/mL] 및 IgG1 마우스 클론 Ci4[0.5mg/mL])를 코팅 완충액(pH 9.6)에서 1:10,000 및 1:1,000으로 희석합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>ABTS 기질 용액: 시료 수에 따라 1개, 2개 또는 3개의 2,2'-아지노-비스(3 에틸벤조티아졸린-6-설폰산(ABTS) 정제를 5mL, 10mL 또는 15mL의 ABTS 완충액(과붕산나트륨, 구연산 및 인산수소이나트륨 함유)에 용해합니다. 시료당 100μL이 필요합니다. 준비된 용액을 빛으로부터 보호되는 2-8 °C에서 보관하십시오. 이 솔루션은 최대 3 개월 동안 안정적입니다.</li>
</ol>2. 시료 채취 및 보관
<ol><li>플라즈마 격리:<ol><li>4mL의 말초 혈액 샘플을 22G 주사기로 정맥 천자하여 리튬 헤파린 채혈 튜브에 수집하고 4°C에서 10분 동안 1,600 x g 에서 원심분리합니다.</li>
		<li>상층액을 2mL 안전 잠금 샘플 튜브로 옮깁니다.</li>
		<li>상청액을 4°C에서 10분 동안 16,000 x g 로 다시 원심분리하여 잔류 세포를 제거한다.</li>
		<li>튜브 바닥의 펠릿을 방해하지 않고 새로운 안전 잠금 장치 샘플 튜브에 상청액을 수집합니다.</li>
		<li>수득한 혈장을 추가 사용이 있을 때까지 -80°C에서 보관한다. 참고: 이 분석으로 고처리량 결과를 얻으려면 양질의 샘플이 필요합니다. 혈장 샘플을 사용하는 경우 두 번째 원심분리를 수행하여 잔류 세포를 제거합니다. 샘플의 반복적인 해동을 피하십시오. EDTA가 DNase 활성에 영향을 미치기 때문에 항응고제로 헤파린을 사용하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>다형핵 호중구의 분리<ol><li>말초 혈액 샘플을 22G 주사기로 정맥 천자하여 리튬 헤파린 채혈 튜브에 수집합니다.</li>
		<li>6mL의 혈액을 6mL의 원스텝 다형체에 적층하고 실온(RT)에서 45분 동안 1,000 x g 에서 튜브를 원심분리합니다.</li>
		<li>호중구를 함유하는 제3 버피 코팅층을 수확하고, 이를 페놀 레드가 없는 RPMI-1640에서 400 x g 로 RT에서 10분 동안 3회 세척한다.</li>
		<li>6% 열 비활성화 태아 소 혈청이 보충된 2mM L-글루타민을 함유한 페놀 레드가 없는 RPMI-1640에 호중구를 재현탁하고 혈구계로 현미경 필드의 세포를 계수합니다. 참고: 이 방법은 트리판 블루 염료 배제로 평가한 바와 같이 96%에서 98% 이상의 생존력으로 95% 순도를 산출합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>다형핵 호중구의 활성화와 NETosis in vitro
	<ol><li>갓 분리된 다형핵 호중구를 1 × 105 cells/mL로 희석하여 6% 열 비활성화 태아 소 혈청이 보충된 2mM L-글루타민을 함유한 페놀 레드가 없는 RPMI-1640에 넣고 35mm 배양 접시에 파종합니다.</li>
		<li>NET을 유도하기 위해, 5% CO2/95% 공기 중 37°C에서 4시간 동안 25nM PMA로 다형핵 호중구를 자극한다.</li>
		<li>4시간의 배양 후, 0.6μg/mL DNase I을 RT에서 15분 동안 배양 접시에 직접 첨가하여 NET을 부분적으로 분해하고, 5mM EDTA를 첨가하여 DNase I 활성을 중지합니다.</li>
		<li>합성된 NET을 함유하는 배지를 수집하고, 4°C에서 10분 동안 400 x g 에서 원심분리하여 세포 파편을 제거하였다.</li>
		<li>4개의 건강한 대조군으로부터 상층액을 얻고, 혼합하고, 사용할 때까지 -80°C에서 보관한다. 참고: 4개의 건강한 대조군으로부터 얻은 DNase 분해 PMA 자극 호중구는 NET 표준 1,14,15로 사용됩니다. PBS를 사용하여 연속적으로 희석된 NET 표준물질에서 검량선을 생성하고, 희석되지 않은 NET 표준물질에서 얻은 광학 밀도(OD) 값을 100% NET으로 할당합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 분석 방법
참고: 분석을 수행하는 단계는 아래에 자세히 설명되어 있습니다.
<ol><li>1일차<ol><li>총 100μL의 희석된 항-MPO 또는 0.05μg의 항체를 포함하는 항-NE 항체를 블랭크 웰을 포함한 플레이트의 각 웰에 적용합니다. 알림: 코팅 완충액에는 어떤 종류의 세제도 포함되어서는 안 되며, 그렇지 않으면 항체가 각 웰의 벽에 균등하고 매끄럽게 결합하지 않을 수 있습니다. 후크 효과를 방지하기 위해 코팅 단백질 농도는 20μg/mL를 넘지 않아야 하는데, 그 수준 이상의 농도는 마이크로타이터 플레이트에서 사용 가능한 대부분의 부위를 포화시키기 때문입니다. 단백질 코팅 용액의 일반적인 농도 범위는 2-10 μg/mL입니다. 예비 실험을 위해, MPO에 대한 특정 단일 클론 항체 대신에 코팅을 위해 희석 된 이소 타입 대조군 항체 IgG 토끼를 사용한다. NE에 대한 특정 단클론 항체 대신 희석된 이소형 대조군 항체 IgG1 마우스를 코팅에 사용하십시오.</li>
		<li>샘플의 증발을 방지하기 위해 접착성 플라스틱 덮개로 플레이트를 덮고, 포획 항체의 결합을 허용하기 위해 4°C에서 밤새 인큐베이션한다.</li>
	</ol></li>
	<li>2일차<ol><li>희석된 항체 용액을 웰에서 버리고 웰당 세척 용액 300μL를 피펫팅하고 이 세척 절차를 3-4회 반복합니다.</li>
		<li>종이 타월로 접시를 두드려 말려서 여분의 PBS를 제거합니다.</li>
		<li>ELISA 플레이트의 각 웰을 200 μL의 블로킹 완충액으로 블로킹한다.</li>
		<li>접착 플라스틱 덮개로 플레이트를 밀착시키고 RT에서 1.5-2 시간 동안 배양하여 웰을 막습니다.</li>
		<li>블로킹 용액을 웰에서 완전히 버린 다음 웰 당 세척 용액 300μL를 피펫팅하고 이 세척 절차를 3-4회 반복합니다.</li>
		<li>종이 타월로 접시를 두드려 말려서 여분의 PBS를 제거합니다.</li>
		<li>블랭크 웰을 제외한 각 웰에 총 25μL의 혈장 또는 배지를 도포하고 희석제로 PBS 75μL를 첨가하여 최종 부피 100μL를 만듭니다. 블랭크 웰에 PBS 100μL를 추가합니다.</li>
		<li>그런 다음 플레이트를 250rpm의 셰이커에 올려 놓음으로써 RT에서 10초 동안 샘플을 혼합합니다.</li>
		<li>블랭크 웰을 포함한 각 웰에 100배 희석된 DNase I(0.03mg/mL) 2μL를 적용합니다(반응 혼합물 내 DNase I의 최종 농도: 0.6μg/mL).</li>
		<li>접착 플라스틱 덮개로 플레이트를 밀봉하고 플레이트를 250rpm의 셰이커에 올려 놓아 RT에서 10초 동안 샘플을 완전히 혼합합니다. 참고: DNA 소화를 위한 최적 조건을 평가하기 위해 분석을 개발할 때 RT에서 15분 동안 0-0.9μg/mL DNase I로 COVID-19 환자의 MPO 관련 DNA를 포함하는 샘플을 배양하고 MPO에 대한 특정 포획 항체 또는 종 일치 이소형 대조군 항체로 코팅된 플레이트를 사용했습니다.</li>
		<li>RT에서 15분 동안 샘플을 배양합니다.</li>
		<li>접착 플라스틱 덮개를 제거하고 각 웰에 0.5M EDTA 1μL를 도포하여 DNase 반응을 중지합니다.</li>
		<li>접착식 플라스틱 덮개로 플레이트를 다시 밀봉하고 250rpm의 셰이커에 올려 놓아 실온에서 15초 동안 흔듭니다.</li>
		<li>이어서, 플레이트를 4°C에서 밤새 인큐베이션하여 NET의 단백질 성분이 포획 항체에 부착되도록 한다.</li>
	</ol></li>
	<li>3일차<ol><li>접착 플라스틱 덮개를 제거하고 웰에서 용액을 버립니다.</li>
		<li>웰로부터 용액을 완전히 버린 다음, 웰 당 세척 용액 300 μL를 피펫팅하고, 이 세척 절차를 3 내지 4회 반복한다.</li>
		<li>희석된 퍼옥시다제 접합 항-DNA 검출 항체를 총 100μL씩 각 웰에 도포합니다.</li>
		<li>접착식 플라스틱 덮개로 플레이트를 밀착 밀봉하고 RT에서 1.5시간 동안 배양합니다.</li>
		<li>웰에서 용액을 완전히 버린 다음 웰 당 세척 용액 300μL를 피펫팅하고 이 세척 절차를 3-4회 반복합니다.</li>
		<li>잔류 용액을 조심스럽게 제거하십시오.</li>
		<li>총 100 μL의 ABTS 기질 용액을 각 웰에 적용하고, 플레이트를 접착성 플라스틱 커버로 덮는다.</li>
		<li>플레이트를 250rpm의 진탕기 상에서 20-30분 동안 RT의 어둠 속에서 배양한다. 알림: 원하는 OD 판독값을 얻을 때까지 5분 간격으로 플레이트를 모니터링합니다.</li>
		<li>총 50μL의 2M 황산을 추가하여 반응을 중지합니다.</li>
		<li>플레이트의 측면을 조심스럽게 두드려 우물의 액체 내용물을 혼합하십시오.</li>
		<li>마이크로플레이트 리더의 전원을 켜고 컴퓨터에 연결합니다.</li>
		<li>컴퓨터에서 소프트웨어 응용 프로그램을 엽니다.</li>
		<li>상태 표시줄에서 새 실험을 만들고 이름을 지정합니다.</li>
		<li>플레이트 판독을 위해 다음 매개변수를 모두 설정합니다: 읽기 유형, 흡광도; 읽기 모드, 끝점; 파장, 2; Lm-1, 405 나노미터; Lm-2, 490 나노미터; 자동 믹스 & 블랭킹 전, 꺼짐; 미리 읽은 플레이트, 꺼짐; 자동 보정, 켜짐; 스트립, 전체 플레이트 읽기; 컬럼 파장 우선 순위, 컬럼 우선 순위; 캐리지 속도, 정상; 및 자동 읽기, 끄기.</li>
		<li>그런 다음 샘플이 들어 있는 96웰 플레이트를 서랍에 넣고 닫습니다.</li>
		<li>마지막으로 플레이트를 즉시 읽을 수 있도록 읽기 버튼을 선택합니다.</li>
		<li>마이크로플레이트 리더를 사용하여 405nm 파장에서 각 웰의 흡광도를 판독합니다(이 단계에서는 490nm 파장을 기준으로 사용).</li>
		<li>모든 미지의 샘플에서 분석 배지 단독의 흡광도 값을 자동으로 빼고 데이터를 저장합니다. 참고: 연속 희석된 NET 표준에서 얻은 표준 곡선을 사용하여 샘플 1,14,15에서 NET의 상대 농도를 계산합니다. 여기서, 최종 결과는 "MPO- 또는 NE-DNA 복합체 (NET 표준의 %)"로 제시된다. 검출한계(LOD)는 표준편차(SD)와 검량선의 기울기(S)로부터 다음과 같이 계산되었습니다: LOD = 3.3(SD/S).</li>
	</ol></li>
</ol>4. 통계
<ol><li>적절한 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 모든 통계 분석을 수행합니다. 여기서는 SigmaPlot v14.5가 사용되었습니다. 백분율과 계량형 변수는 대부분의 매개변수의 편향된 분포로 인해 사분위수 범위의 중앙값으로 표시됩니다.</li>
	<li>Wilcoxon 순위 합계 테스트를 사용하여 COVID-19 환자와 건강한 대조군 간의 혈장 MPO-DNA 및 NE-DNA 수준을 비교합니다. 상관 분석을 사용하여 광학 밀도와 NET 표준 비율 간의 관계를 탐색할 수 있습니다.</li>
</ol>

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<li>Masso-Silva, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+peripheral+blood+neutrophil+activation+phenotypes+and+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+critically+ill+Coronavirus+disease+2019+%28COVID-19%29+patients%3A+A+case+series+and+review+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Increased peripheral blood neutrophil activation phenotypes and neutrophil extracellular trap formation in critically ill Coronavirus disease 2019 (COVID-19) patients: A case series and review of the literature.</a> Clinical Infectious Diseases. 74 (3), 479-489 (2022).</li>
<li>Gong, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+potential+biomarkers+and+immune+features+of+sepsis+using+bioinformatics+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+of+Inflammation%22%5BJournal%5D)">Identification of potential biomarkers and immune features of sepsis using bioinformatics analysis.</a> Mediators of Inflammation. 2020, 3432587(2020).</li>
<li>Almansa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+correlates+of+organ+failure+extent+in+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infection%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic correlates of organ failure extent in sepsis.</a> Journal of Infection. 70 (5), 445-456 (2015).</li>
</ol>

이 연구 중에 생성 및/또는 분석된 모든 데이터는 이 게시된 기사에 포함되어 있습니다. 저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.

본 발명자들은 MPO-DNA 또는 NE-DNA 복합체를 함유하는 샘플의 초기 배양 동안 MPO 또는 NE가 포획 항체의 한 부위에 결합하는 샌드위치 ELISA 방법을 설명하였다. 세척 후, "샌드위치"는 샘플을 퍼옥시다아제-관련 항-DNA 모노클로날 항체와 함께 인큐베이션함으로써 완성된다. 결합되지 않은 2차 항체를 제거한 후, 발색 ABTS 과산화효소 기질을 첨가하여 결합된 퍼옥시다제 접합체를 검출하고, 이는 405nm에서 분광광도계로 판독할 수 있는 가용성 최종 생성물을 생성합니다. 우수한 선형성과 높은 분석 간 및 분석 내 정밀도는 이 논문 및 기타 1,2에 설명된 ELISA 분석이 임상 적용에 대해 신뢰할 수 있고 실현 가능하다는 것을 나타냅니다. 또한, DNase-처리된 PMA-자극 호중구의 상청액이 NET-표준에 대한 최대 신호로서 할당될 때, 이 ELISA 분석은 반-정량적 방법으로서 사용될 수 있다 1,14,1...

이 기사에서는 샌드위치 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)을 사용하여 DNA 1,2와 골수과산화효소(MPO) 및 호중구 엘라스타제(NE)의 복합체를 검출함으로써 생물학적 체액에서 호중구 세포외 트랩(NET) 형성을 정량화하는 방법을 설명합니다. NET은 호중구 과립 3,4에서 유래한 항균 프로테아제로 장식된 DNA 골격으로 구성됩니다. MPO-DNA와 NE-DNA 복합체는 모두 NET의 중요하고 특정한 구성 요소이며 NET 3,4의 분해 산물로서 세포외 공간으로 방출됩니다.
NET은 항균 방어3에서 중요한 생리학적 역할 외에도 혈전 형성6의촉진과 패혈증7의 악화를 포함하여 다양한 병리학적 효과4,5를 가지고있다. 이에 따라 최근 NET이 주목받고 있다. 그럼에도 불구하고 NET의 생체 내 정량화는 민감하고 신뢰할 수 있는 정량 분석 방법이 없기 때문에 어려운 것으로 입증되었습니다.
형광 현미경 8,9 및 유세포 분석(flow cytometry)10에 의한 NET의 직접 측정과 순환 cell-free DNA, 뉴클레오솜 및 시트룰린화 히스톤 H3의 간접 측정을 포함하여 몇 가지 방법을 사용할 수 있지만, 각 방법에는 고유한 장점과 한계가 있습니다11. 면역형광 현미경 방법은 NET에 특이적이며 국소화 및 NET 형성 정도를 명확하게 보여주지만 샘플은 생검 조직 및 분비 물질로 제한됩니다. 또한, 이 방법은 숙련된 연구원이 수행해야 하며 결과를 얻는 데 오랜 시간이 필요합니다. 유세포 분석을 통해 NET 관련 구성 요소의 순환 수준을 측정하는 것은 쉽고 결과를 빠르게 제공합니다. 그러나 이 방법은 NET12에만 국한되지 않습니다.
우리13 및 기타 1,2는 MPO 또는 NE에 대한 특이적 항체를 포획 항체 및 DNA 특이적 검출 항체로 사용하는 변형된 ELISA 기술을 사용하여 인간 혈장에서 순환하는 NET 성분, MPO-접합 또는 NE-접합 DNA를 측정하기 위한 매우 민감하고 신뢰할 수 있는 분석법을 개발했습니다. 이 분석은 또한 생체 외에서 phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA) 자극에 반응하여 활성화된 호중구에 의해 방출되는 세포 배양 상청액의 NET 성분을 식별하는 데 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>1-Step Polymorphs</td><td>Accurate Chemical and Scientific Corporation</td><td>AN221725</td><td>인간의 혈액에서 PMN의 분리.</td></tr><tr><td>96웰 마이크로타이터 플레이트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>467466</td><td>평평한</td></tr><tr><td>바닥 ABTS 완충 용액</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>11 204 530 001</td>은 <td>과붕산나트륨, 구연산 및 인산수소이나트륨을 함유하고 있습니다.</td></tr><tr><td>ABTS 정제</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>11 204 521 001&nbsp;</td><td>각 정제에는 5mg의 ABTS 기질과 60mg의 차량 물질이 포함되어 있습니다.</td></tr><tr><td>접착 플라스틱 커버, Axygen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14222348</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MPO 항체</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>&nbsp; 07-496-I</td><td>2-8°C에 보관하며 1년간 안정되어 있습니다. 숙주 종은 토끼입니다.</td></tr><tr><td>Anti-NE 항체, 클론 AHN-10</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>MABS461</td><td>2-8°C에서 1년 동안 안정적입니다. 숙주 종은 마우스입니다.</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Biomedical Science</td><td>BR-220700081</td><td>소 분획 V. Store at 2&ndash의 알부민; 8 &deg;C. 2년 동안 안정적입니다.</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>New England BioLabs</td><td>M0303M</td><td>-20 &deg에 저장; C</td></tr><tr><td>IgG, 토끼, 아이소타입 컨트롤</td><td>GENETEX, Inc.</td><td>GTX35035</td><td>2&ndash에 집중된 해결책으로 저장하십시오; 8 &deg;C입니다.</td></tr><tr><td>IgG1, 마우스 Isotype Control, 클론 Ci4</td><td>Merck&nbsp;</td><td>MABC002</td><td>2&ndash에 집중된 해결책으로 저장하십시오; 8 &deg;C입니다.</td></tr><tr><td>리튬 헤파린 혈액 수집 튜브</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로플레이트 믹서</td><td>하나의 법인으로서</td><td>NS-P</td><td></td></tr><tr><td>마이크로플레이트 리더</td><td>분자 장치</td><td>SpectraMax 190&nbsp;</td><td>405&ndash의 파장을 읽을 수 있는 모든 마이크로플레이트 플레이트 리더; 490nm를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>마이크로플레이트 리더 애플리케이션</td><td>Molecular Devices</td><td>SoftMax pro</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase-conjugated anti-DNA anti-DNA, cell death Detection ELISA</td><td>Roche Diagnostics</td><td>1154467500</td><td>&nbsp; 병 2. 2&ndash에 저장; 8 &deg;C. 1년 동안 안정적입니다.</td></tr><tr><td>Phorbol 12-myristate 13-acetate</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>P8139</td><td>인간 혈액에서 PMN의 활성화.</td></tr><tr><td>인산염 완충 용액</td><td>Takara Bio</td><td>T9181</td><td>실온에서 보관하십시오. 6개월 동안 안정적입니다.</td></tr><tr><td>시그마플롯 v14.5</td><td>&nbsp; Systat Software Inc. San Jose, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>아지드화나트륨</td><td>Fujifilm Wako Chemicals</td><td>190-14901</td><td>실온에서 보관하십시오.</td></tr><tr><td>t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올, 폴리에틸렌 글리콜, tert-옥틸페닐 에테르</td>, <td>Fujifilm Wako Chemicals</td><td>9002-93-1</td><td>실온에서 보관하십시오.</td></tr></tbody></table>

변형된 샌드위치 elisa를 사용하여 호중구 세포외 트랩에서 myeloperoxidase-dna 및 neutrophil elastase-dna 복합체 정량화

Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

미생물과 같은 특정 자극은 호중구가 호중구 세포외 트랩(NET)을 방출하게 하는데, 이는 기본적으로 골수과산화효소(MPO) 및 호중구 엘라스타제(NE)와 같은 과립 단백질과 세포질 및 세포골격 단백질이 있는 DNA로 구성된 거미줄과 같은 구조입니다. 최근 NET에 대한 관심이 높아졌지만 임상 환경에서 NET을 측정하는 데 사용할 수 있는 민감하고 신뢰할 수 있는 분석 방법은 없습니다. 이 기사에서는 순환 NET의 두 가지 구성 요소인 MPO-DNA 및 NE-DNA 복합체를 정량적으로 측정하기 위한 변형된 샌드위치 효소 결합 면역흡착 분석에 대해 설명하며, 이는 NET의 특정 구성 요소이며 NET의 분해 산물로 세포외 공간으로 방출됩니다. 상기 분석은 포획 항체 및 DNA 특이적 검출 항체로서 MPO 또는 NE에 대한 특이적 단일클론 항체를 사용한다. MPO 또는 NE는 MPO-DNA 또는 NE-DNA 복합체를 함유하는 샘플의 초기 인큐베이션 동안 포획 항체의 한 부위에 결합한다. 이 분석은 우수한 선형성과 높은 분석 간 및 분석 내 정밀도를 보여줍니다. 우리는 급성 호흡 곤란 증후군을 동반하는 COVID-19 환자 16 명에게 사용했으며 MPO-DNA 및 NE-DNA의 혈장 농도가 건강한 대조군에서 얻은 혈장보다 유의하게 높다는 것을 발견했습니다. 이 검출 분석은 인간 혈장 및 배양 상청액에서 NET의 특성을 조사하기 위한 신뢰할 수 있고 매우 민감하며 유용한 방법입니다.

이 방법은 MPO 관련 및 NE 관련 DNA를 측정하기 위해 항-MPO, 항-NE 및 항-DNA 단클론 항체와 함께 샌드위치 ELISA를 사용했습니다(그림 1). 이 방법에서, 마이크로타이터 플레이트의 웰을 MPO-특이적 또는 NE-특이적 단일클론 항체로 코팅하여 DNA-연관 MPO 및 DNA-연관 NE 뿐만 아니라, 비-DNA-연관 MPO 및 NE를 포획하였다. 분석 내 가변성 계수(CV)를 계산하기 위해 COVID-19 환자와 건강한 대조군으로부터 수집한 30개의 샘플에 대해 동일한 플레이트 내에서 중복 측정을 수행했으며 %CV는 중복 측정의 평균으로 계산되었습니다. 분석 간 CV(즉, 플레이트 간 일관성)를 계산하기 위해 COVID-19 환자와 건강한 대조군의 두 가지 유형의 샘플을 10개의 다른 플레이트에서 4배로 측정했습니다. 이 분석의 특이성을 입증하기 위해, MPO 및 NE에 대한 특정 단클론 항체 대신 이소형 대조군 항체로 코팅된 플레이트를 사용하여 다양한 농도...

우리는 활성화된 호중구에서 파생된 호중구 세포외 트랩 잔해의 두 가지 구성 요소인 골로페록시다제 접합 DNA 및 호중구 엘라스타제 접합 DNA 복합체를 정량적으로 측정하기 위한 변형된 샌드위치 효소 결합 면역흡착 분석 기술에 대한 프로토콜을 제시합니다.

변형된 샌드위치 ELISA를 사용하여 호중구 세포외 트랩에서 Myeloperoxidase-DNA 및 Neutrophil Elastase-DNA 복합체 정량화

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...

NET은 최근 주목을 받고 있지만 생체 내에서 NET을 정량화하는 것은 어려운 것으로 입증되었습니다. 이 프로토콜은 임상 환경에서 NET의 특성을 조사하기 위한 바람직하고 매우 민감하며 가치 있는 방법을 제공합니다. 이 기술은 패혈증 또는 패혈성 ARDS의 중증도, 급성 호흡 곤란 증후군을 평가하기 위해 확장되어야 합니다.덤프 또는 손상 관련 분자 패턴을 조절하는 것이 패혈증의 임상 상태를 개선하는 열쇠라는 것이 널리 받아들여지고 있습니다. 이 방법의 가장 큰 장점은 골수과산화효소-DNA 및 호중구 엘라스타제-DNA와 같은 순환하는 NET 잔여물을 단시간에 정확하게 정량화하는 것입니다. 분석 전에 샘플을 회전시키고 반복적인 해동을 피하는 것이 좋습니다.프로토콜에 주어진 잠복기를 따르는 것이 중요합니다. 갓 분리된 다형핵 호중구를 페놀 레드가 없는 RPMI 1640에서 밀리리터당 10, 000 세포로 희석하는 것으로 시작하십시오. 35 밀리미터 배양 접시에 체로 치십시오.호중구 세포외 트랩 또는 NET을 유도하려면 먼저 25나노몰 PMA로 다형핵 호중구를 자극합니다. 이어서, DNase I의 밀리리터 당 0.6 마이크로그램을 첨가하여 세포외 트랩을 부분적으로 소화시키고, 혼합물을 실온에서 50분 동안 인큐베이션한다. 이제 5밀리몰 EDTA를 추가하여 DNase 활성을 중지하고 합성된 NET이 포함된 배지를 수집합니다.세포 파편을 제거하기 위해 원심 분리기. 4개의 건강한 대조군에서 상층액을 수집합니다. 믹스 추가 사용을 위해 섭씨 영하 80도에 보관하십시오.0.05 마이크로 그램의 항체를 함유 한 희석 된 항 -골수과산화 효소 100 마이크로 리터를 ELISA 플레이트에 피펫으로 넣습니다. 이제 시료 증발을 방지하기 위해 접착식 플라스틱 덮개로 플레이트를 덮고 섭씨 4도에서 밤새 시료를 배양하여 포획 항체가 결합할 수 있도록 합니다. 다음날, 희석된 항체 용액을 웰로부터 버리고, 300 마이크로리터의 세척 용액을 각각의 웰에 피펫팅한다.종이 타월로 접시를 두드려 물기를 제거하여 여분의 PBS를 제거합니다. 플레이트의 각 웰을 200 마이크로리터의 블로킹 완충액으로 블로킹한다. 접착 플라스틱 덮개로 덮고 부화하여 우물을 막습니다.우물에서 차단 용액을 버리고 플레이트를 3-4 번 세척 한 후 종이 타월로 두드려 말립니다. 다음으로, 블랭크를 제외한 모든 웰에 25 마이크로리터의 혈장을 피펫팅한다. 이를 75 마이크로리터의 PBS로 희석하여, 최종 웰 부피를 100 마이크로리터로 만든다.그런 다음 블랭크 웰에 100 마이크로 리터의 PBS를 추가합니다. 플레이트를 실온에서 250rpm으로 10초 동안 진탕기에 올려놓음으로써 샘플을 혼합한다. 100 완전히 희석된 DNase I 2마이크로리터를 모든 웰에 첨가하고, 밀봉된 플레이트를 10초 동안 쉐이커에 올려 샘플을 완전히 혼합한다.실온에서 15 분 동안 배양하십시오. 각 웰에 1마이크로리터의 0.5몰 EDTA를 첨가하여 DNase 반응을 중지시킨다. 그런 다음 밀봉된 플레이트를 셰이커에 15초 동안 올려 샘플을 완전히 혼합합니다.마지막으로, 플레이트를 섭씨 4도에서 밤새 배양하여 NET의 단백질 성분이 포획 항체에 부착되도록 합니다. 다음날, 우물에서 용액을 버리십시오. 여러 웰 세척 후, 희석된 퍼옥시다아제 접합 항-DNA 검출 항체 100 마이크로리터를 각 웰에 피펫팅한다.플레이트를 1 1/2 시간 동안 배양 한 다음 용액을 웰에 버립니다. 웰을 3회 세척한 후, 100 마이크로리터의 ABTS 기질 용액을 각 웰 내로 피펫팅하고, 밀봉된 플레이트를 암실에서 진탕기 상에서 인큐베이션한다. 50 마이크로 리터의 2 몰 황산을 첨가하여 반응을 중지하십시오.접시 측면을 조심스럽게 두드려 우물 내용물을 섞습니다. 그런 다음 마이크로플레이트 리더를 컴퓨터에 연결하고 소프트웨어 응용 프로그램을 시작합니다. 상태 표시줄에서 새 실험을 만들고 이름을 지정합니다.그런 다음 Absorbance를 판독 유형으로, Endpoint를 판독 모드로, two를 파장으로 선택하여 플레이트 판독 파라미터를 설정합니다. 다음으로 람다 1을 405 나노 미터로, 람다 2를 490 나노 미터로 설정합니다. 이제 AutoCalibration을 On으로 유지하면서 Automix와 Blanking 모두에 대해 Off 상태를 선택합니다.그런 다음 Strips에서 Read entire plate를 선택합니다.마지막으로 Normal(보통)을 Carriage Speed(캐리지 속도)로 Column Wavelength Priority(열 파장 우선 순위)를 설정한 다음 AutoRead(자동 읽기)에서 Off(끄기)를 선택합니다. 플레이트를 악기 서랍에 잘 넣고 닫습니다. 읽기를 클릭하면 플레이트를 즉시 읽을 수 있습니다.405 나노미터에서 각 웰의 흡광도를 판독하고, 모든 미지의 샘플에서 분석 배지 흡광도의 자동 뺄셈을 수행합니다. 흡광도 값이 각각 0.93 및 0.9를 초과하지 않았을 때 MPO-DNA 및 NE-DNA 모두에 대해 신뢰할 수 있는 표준 검량선이 얻어졌다. 가장 높은 OD는 DNase I의 밀리리터 당 0.6 마이크로 그램이 적용되었을 때 얻어졌다.건강한 대조군의 복합체에 대한 분석 간 변동 계수는 각각 1.871 및 0.987이었고, COVID-19 환자는 각각 2.532 및 2.010의 변동 계수를 보였다. MPO-DNA 및 NE-DNA에 대한 평균 분석간 가변성 계수는 각각 6.524 및 4.389였다. MPO-DNA 및 NE-DNA 복합체에 대한 포획 항체의 특이성은 이소형 대조군 항체가 복합체에 거의 반응하지 않는다는 것을 보여주었습니다.두 복합체의 비율은 건강한 대조군에 비해 COVID-19 환자의 혈장에서 더 높았습니다. DNase 소화 시간을 최적화해야 하며, 그렇지 않으면 과도한 소화는 흡광도를 감소시킵니다.

quantifying-myeloperoxidase-dna-neutrophil-elastase-dna-complexes

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

호중구 세포 트랩 (그물) 병원성 박테리아, 곰팡이 및 기생충에 대항하는 중요한 타고난 면역 메커니즘입니다. 여기 우리는 인간의 피를에서 호중구 granulocytes을 분리하고 그물을 형성 그들을 활성화하는 방법을 설명합니다. 우리는 빛과 전자 현미경의 그물을 시각화하기 위해 준비 기술을 제시한다.

호중구 세포 트랩 : 그들을 생성 및 시각화하는 방법

이 비디오는 항호중구 세포질 항체가 포함된 환자 혈청을 사용하여 사전 라벨링된 호중구에서 호중구 세포외 트랩 또는 NET의 유도 및 시각화를 보여줍니다. 또한 불침투성 DNA 염료와 형광 현미경을 사용하면 NET을 시각화할 수 있습니다.

Induction and Visualization of Neutrophil Extracellular Traps in Pre-Labeled Neutrophils

High throughput assay는 인간 호중구에서 NET 방출을 정량화할 수 있는 우수한 도구를 함께 제공합니다.

세포 외 DNA 릴리스의 높은 처리량 측정 및 인간 호중구의 양적 NET 형성<em&gt; 체외</em

지질은 세포 기능에 중요한 역할을하는 것으로 알려져있다. 여기, 우리는 호중구 세포 트랩 형성의 기본 메커니즘의 더 나은 이해를 얻기 위해 HPTLC 및 HPLC를 모두 사용하여, 콜레스테롤 수준에 중점을두고, 호중구의 지질 구성을 결정하는 방법을 설명합니다.

방법은 지질 호중구의 변경 및 호중구 세포 외 트랩의 후속 형성을 연구하기 위해

호중구 세포 트랩 (그물) DNA, 히스톤 및 호중구 단백질의 네트워크입니다. 선천성 면역 반응의 구성 요소이지만, 그물자가 면역 및 혈전증에 연루되어있다. 이 프로토콜은 개과 호중구 분리 및 마이크로 플레이트 형광 분석법을 이용하여 그물 정량화하기위한 간단한 방법을 설명한다.

개 호중구 세포 외 트랩 릴리스의 정량화를위한 ​​간단한 형광 분석

우리 개 neutrophils 전체 혈액에서 분리 하 고 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 라이브 호 중구에서 그물 형성을 시각화 하는 방법을 설명 합니다. 프로토콜 네트워크 형성 및 citrullinated 히스톤 H3 계량 하는 설명 (citH3) 식 면역 형광 검사 현미경 검사 법을 사용 하 여.

생체 외에서 형광 현미경 검사 법에 의해 개 호 중구 Extracellular 함정 형성: 역동적이 고 양적 분석

여기에서는 면역형광 이미지에서 NET를 정량화하기 위한 완전 자동 소프트웨어 옵션인 NEUTrophil 세포 외 트랩(NET)을 생성하고 NETQUANT를 운영하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

NETQUANT를 사용한 호중구 세포외 트랩의 자동 이미지 기반 정량화

이 프로토콜 면역 형광 3 차원 confocal 현미경 검사 법에 의해 ex vivo 그물 형성의 반자동된 정량화에 대 한 매우 민감하고 높은 처리량 호 중구 extracellular 함정 (그물) 분석 결과를 설명합니다. 이 프로토콜 네트워크 형성 및 다른 자극 후 저하를 평가 하는데 사용 될 수 있습니다 그리고 잠재적인 NET 타겟 치료를 공부 하는 데 사용할 수 있습니다.

평가 하 고 호 중구 Extracellular 함정 대형 계량 높은 처리량 분석 결과

여기에 제시된 것은 시험관 내 호중구 세포 외 트랩 (NET)의 유도 및 분석을위한 프로토콜입니다. DNA, 카텔리시딘(LL37) 및 효소 활성의 정량화는 유사한 통제 조건에서 미생물 및 화학적 자극에 의해 유도된 NET의 구성 및 형태의 가변성을 보여주는 데이터를 산출했습니다.

미생물 및 화학적 자극에 의해 유도 된 호중구 세포 외 트랩의 형태 학적 및 조성 분석

당사는 막 투과성 의존성 이중 염료 접근법과 결합된 살아있는 세포 분석 시스템을 활용하여 호중구 세포외 트랩(NET)을 정량화하는 자동화된 고처리량 방법을 제시합니다.

인간 호중구에서 호중구 세포외 트랩 형성을 정량화하기 위한 실시간 고처리량 기법

이 정의된 프로토콜은 in vitro에서 인간 호중구 세포외 트랩(NET) 방출을 시각화하고 정량화하기 위한 실시간 고처리량 현미경 접근 방식을 설명합니다. 재현 가능한 방법을 통해 뚜렷한 NETosis 유도 인자를 자극 시 NET 방출의 특성과 동역학을 조사할 수 있으며 NETosis 길항제의 약리학을 평가할 수 있습니다.

Human Neutrophil Extracellular Trap release의 실시간 고처리량 현미경 정량화 및 길항제의 약리학 평가

학습하세요 변형된 샌드위치 ELISA를 사용하여 호중구 세포외 트랩 잔여물을 정량화하는 방법을. Myeloperoxidase-DNA 및 Neutrophil Elastase-DNA 복합체를 측정하여 패혈증 중증도를 평가할 수 있습니다.

변형된 샌드위치 ELISA를 사용하여 호중구 세포외 트랩에서 Myeloperoxidase-DNA 및 Neutrophil Elastase-DNA 복합체 정량화

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