Monitoring van on-target signaalreacties bij larvale zebravissen - Z-REX ontmaskert precieze mechanismen van elektrofiele geneesmiddelen en metabolieten

En dus kunnen onderzoekers met behulp van Z-REX onderzoeken hoe individuele signaalreacties worden veranderd als reactie op een specifiek reactief ligand dat zich bezighoudt met een specifiek eiwit dat van belang is in bijna fysiologische omstandigheden in zebravislarven. Conventionele methoden zoals bulkdosisreactieve kleine moleculen veroorzaken doelwitten en toxiciteit en geven geen controle over de specificiteit van liganddoelen. Z-REX kan een specifieke ligand target engagement koppelen aan een specifiek fenotype met een hoge spatiotemporale precisie.

We hebben onlangs aangetoond hoe een reactieve metaboliet HNE, een geassocieerd doelwit en route ontdekt door Z-REX, de ontwikkeling van precisie-isovormspecifieke kinaseremmers tegen triple-negatieve borstkankers mogelijk maakt. Begin met het uitlijnen van de embryo's in de groeven van een injectieplaat gevuld met verse 10% Hank's gebalanceerde zoutoplossing of HBSS. Dompel de naaldpunt onder in het medium en breng indien nodig injectiepulsen aan om luchtbellen in de punt te verwijderen Voor het injecteren van het embryo, penetreert u het chorion en de dooierzak in één beweging en brengt u een injectiepuls aan.

Na het injecteren van de andere embryo's, spoel ze in een nieuwe petrischaal met verse HBSS-media met behulp van een spuitfles. Bundel de niet-geïnjecteerde embryo's in een andere plaat. Om de Z-REX-behandelingsanalyse uit te voeren, begint u met het verdelen van de geïnjecteerde embryo's in schalen van 10 centimeter.

Vervang in een donkere ruimte met rood licht het medium door 30 milliliter 10% HBSS met of zonder één micromolair van de REX-sonde. Incubeer de embryo's bij 28,5 graden Celsius in het donker. Vervang 30 uur na de bevruchting de media in het donker.

Na twee keer incubatie en mediavervanging te hebben herhaald, stelt u de embryo's bloot aan licht van een voorverwarmde UV-lamp die elke 30 seconden wervelt. Om een fenotypische test uit te voeren, verwijdert u de onbevruchte of dode embryo's van de plaat met de verdoofde embryo's. Verwijder met een scherpe tang het chorion van de embryo's.

Monteer de embryo's op een 2% agarose plaat bereid met 10% HBSS medium en observeer onder een stereomicroscoop. Gebruik ImageJ om het neutrofielen- en macrofaagnummer van elke vis te tellen. Selecteer de Freehand Selection en omcirkel de hele vis en kies vervolgens de optie Find Maxima om de fluorescerende cellen te tellen In de huidige studie vertoonden met Z-REX behandelde embryo's een verlies van neutrofielen en macrofagen.

Dit effect was afwezig in de onbehandelde groepen. De apoptose-signaalroute werd niet geactiveerd in de Halo-P2A-Keap1-groep, wat resulteerde in ongewijzigde macrofaag- en neutrofielenniveaus. Vergelijkbare resultaten werden ook waargenomen bij de Halo-TEV-Keap1-mutant die niet reageerde op de HNE.

Transcriptionele en real-time kwantitatieve PCR-analyses toonden downregulatie van immuungerelateerde genen en upregulatie van antioxidantgenen na Z-REX. Immunofluorescentiekleuring toonde aan dat de P2A-split-construct twee keer meer HA-tags had dan de TeV-fusie-construct, wat wijst op vergelijkbare expressieniveaus. De expressieniveaus van het wildtype en het mutante type Halo-TeV-Keap1 waren ook vergelijkbaar.

In de met Z-REX behandelde transgene neutrofielenreporterlijn werd ook colocalisatie van neutrofielen en actief caspase 3 waargenomen. Het belangrijkste is om uw documenten correct in te stellen. Beperken zal je resultaten echt verbeteren.

We hebben Z-REX geadopteerd, een idee voor een platform voor geneesmiddelenscreening dat bekend staat als Localis-REX. Geen enkele andere techniek is tot nu toe in staat geweest om zo'n lokale specifieke en reactieve ligand- of doelkartering te bereiken. Het heeft ons geholpen om elektrofiele kandidaat-geneesmiddelen te ontwikkelen voor de behandeling van borstkanker.

Gezien het groeiende belang van gelokaliseerde signalering op vele gebieden, kanker, immunologie, veroudering, enzovoort, belooft Z-Rex, het enige hulpmiddel dat in staat is om de gelokaliseerde reactieve ligandgerichte gebeurtenissen in kaart te brengen, tal van velden te helpen.