Name: 2光子顕微鏡を用いたマウスの胸腺のその場イメージングで (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-01-25T19:52:00.000+00:00
Duration: 15 min
Description: 学ぶ2光子顕微鏡を用いたマウス胸腺のその場イメージング法。新生児キメラ作成、組織分離、生細胞動態観察のプロトコルを解説。T細胞選択機構の解析に応用可能です。

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我々は技術支援のためにマットポールとジミー呉に感謝。

養子免疫伝達 1:1の最終的なドナーとホスト間の比で、人生の最初の3-7日中にインスリン注射器の2-4倍を使用して骨髄の50 - 100ulで新生児を注入する。胸骨や胸郭の下注射部位のため、しかし、腸や胃上記の目的。十分ではない穿刺ダイアフラムに注意して腹膜を貫通する針を挿入します。それは、骨髄の一部が注入中に失われることは珍しくありません。もし皮膚が徐々に針を除去、その後、拡大してできるようにするように注入されているように子犬にあなたのグリップを緩めて、損失を減らすことができます。 胸腺の解剖正中切開を行い、胸郭を明らかにするために、肌を切ったり、涙。胸骨にホールドし、腹膜と横隔膜カットスルー。胸腔を明らかにするために胸郭の側面をカット。胸腺は心臓の上部に位置しています。胸腺の構造を保つように、あなたが胸腺をばらばらにすると周囲の組織へのホールド。解剖時の乾燥からそれを維持するためにPBSで胸腺をすすいでください。ゆっくりと胸腺カプセルの表面に離れて余分な組織をいじめるし、2つの葉を二等分する。 イメージングのために組織を準備正方形のカバースリップには接着剤胸腺に獣医組織接着剤を使用します。接着剤のマイクロリットルの割合を置くことpipettemanを使用してください。胸腺のおおよその長さと幅に接着剤を広げる。カバースリップに対する胸腺安定して所定の位置にドラッグします。 二光子イメージング組織は、95％酸素、5％の二酸化炭素で灌流して37に加温するフェノールレッド℃にすることなくDMEMに浸漬され二光子励起は、スペクトラフィジックスマイタイレーザーは900nmのに合わせて調整し、CFP、GFP、YFPおよびテキサスレッド発光光はPMT検出器を使用して、515、495を使用して560ダイクロイックミラーを分離して収集された使用して達成された。

<ol><li>Kyewski, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeding+of+thymic+microenvironments+defined+by+distinct+thymocyte-stromal+cell+interactions+is+developmentally+controlled%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Seeding of thymic microenvironments defined by distinct thymocyte-stromal cell interactions is developmentally controlled.</a> J Exp Med. 166, 520-538 (1987).</li>
<li>Ladi, E., Yin, X., Chtanova, T., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+microenvironments+for+T+cell+differentiation+and+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymic microenvironments for T cell differentiation and selection.</a> Nat Immunol. 7, 338-343 (2006).</li>
<li>Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+Migration+of+Positively+Selected+Thymocytes+Visualized+in+Real+Time%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Directed Migration of Positively Selected Thymocytes Visualized in Real Time.</a> PLoS Biol. 3, (2005).</li>
</ol>

著者に開示すべき事項はありません。

胸腺における二光子イメージングには、リビング、無傷の器官の相互作用および胸腺内選択イベントの根底に移行で検討することを可能にしています。

2光子顕微鏡を用いたマウスの胸腺のその場イメージングで

In situ Imaging of the Mouse Thymus Using 2-Photon Microscopy

二光子顕微鏡（TPM）は、胸腺および文書胸腺細胞の開発にとって重要なイベントへの深い画像を可能にしています。胸腺細胞の群衆の中に個人の移行を追跡するには、我々は、胸腺細胞の1％未満が普遍的に蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックであるドナーに由来している新生児キメラを生成する。これらの部分的な造血キメラを生成するには、新生児の受信者は、年齢の3-7日の間に骨髄を注入されています。 4-6週間後、マウスは屠殺され、胸腺は慎重に解剖され、イメージ化される組織のアーキテクチャを維持bissected。胸腺は、TPMによるex vivoでのイメージングの準備のためにカバースリップの上に接着される。撮像中に胸腺は95％酸素、5％の二酸化炭素で灌流して37に加温するフェノールレッド℃にすることなくDMEMで維持されますこのアプローチを使用して、我々は多様なT細胞のレパートリーの生成に必要なイベントを調べることができます。

我々は、新生児キメラの世代だけでなく、2光子顕微鏡によるex vivoでのイメージングのための胸腺の解剖と準備のためのステップバイステップの手順を提示する。

2光子顕微鏡法（TPM）を用いることで、胸腺深部のイメージングが可能となり、胸腺細胞の分化・成熟において重要なイベントを記録することができます。……を追跡するためには、

2光子イメージングは、単一細胞が環境と相互作用しながら移動する様子を追跡できるため、免疫学において有用です。胸腺内での移動を追跡し、2光子顕微鏡を用いることで、正選択および負選択のメカニズムを明らかにすることができます。こんにちは。カリフォルニア大学バークレー校のEllen Roby博士の研究室のIna Lottieです。そして、同じくEllen Roby博士の研究室のPaul Herzmarkです。今日は、胸腺組織のin situイメージングの方法をご紹介します。そして私が、2光子顕微鏡を用いて胸腺をイメージングする方法を実演します。それでは、2光子イメージングに至るまでの手順を説明します。これには、骨髄からの造血幹細胞の単離、新生児への骨髄細胞の養子移入、胸腺の解剖および二等分、そして2光子レーザースキャニング顕微鏡によるイメージングのための組織準備という一連の手順が含まれます。それでは、始めていきましょう。胸腺をイメージング用に準備する前に、まず新生児マウスに骨髄細胞を養子移入させる必要があります。これらの骨髄細胞は、GFPを遍在的に発現するトランスジェニックマウスの後肢から単離したものです。これは、50 µLの骨髄が入ったインスリン用注射器です。生後3日から7日のホストに対し、注入する子マウス1匹につき1頭のドナーから採取した骨髄を用いて、2回から4回の注入を行います。ここでは生後5日の子マウスを用い、注入中のマウスの動きを防ぎ、皮膚を緊張させるために、皮膚を後ろに引っ張ります。注入部位は、肺と肋骨よりも下で、腸と胃よりも上の位置を狙います。注入しながら皮膚を軽く緩め、皮膚が拡張するようにします。最後に、骨髄の喪失量を最小限に抑えるため、ゆっくりと注射器を抜きます。これらのマウスを4〜6週間育成した後、イメージングのために胸腺を摘出します。4〜6週間後、胸腺を摘出できます。イメージング用に、大型のピンセットとハサミのセット、および小型のピンセットとハサミのセットを使用します。このマウスは動物使用プロトコルに従って安楽死させ、エタノールで噴霧消毒しています。大きなピンセットで皮膚を挟み、正中線に切開を入れます。次に、ハサミで正中線に沿って切開するか、皮膚を腹膜から剥離させます。皮膚をピンで固定して胸腔を露出させます。腹膜を切開して胸腔に入る際は胸骨を保持し、横隔膜から胸腔に入った後、肋骨ケージの側面に沿って切開します。心臓のすぐ上に胸腺が位置しているのがわかります。これらを元に戻します。こちらが胸腺です。触れないようにします。小さいピンセットを使用して、胸腺の周囲の組織を保持したままにしてください。それでは、PBSで洗浄し、余分な組織の除去を開始します。胸腺を保持するために、その周囲の組織を利用します。胸腺を洗浄する際、余分な組織を慎重に切り取りながら

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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学ぶ2光子顕微鏡を用いたマウス胸腺のその場イメージング法。新生児キメラ作成、組織分離、生細胞動態観察のプロトコルを解説。T細胞選択機構の解析に応用可能です。

2光子顕微鏡を用いたマウスの胸腺のその場イメージングで

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