Name: ניתוח צפיפות המיטוכונדריה והתפלגות האורך בסיבי שריר שלד חי של חולדות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-01T13:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: חקור ניתוח צפיפות מיטוכונדריה והתפלגות אורך בסיבי שריר שלד חי של חולדות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. השיטה מאפשרת כימות רשתות מיטוכונדריות ומספקת תובנות לגבי דינמיקה מיטוכונדרית בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי בית הספר לרפואה והמכון לחקר השמנת יתר של Tecnologico de Monterrey. איור 3A נוצר באמצעות תוכנת Scientific Image and Illustration.

ניתוח מיקרוסקופי קונפוקלי של מיטוכונדריה של שרירי חולדה

<ol><li>Lackner, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+the+dynamic+mitochondrial+network%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Shaping the dynamic mitochondrial network.</a> BMC Biology. 12, 35(2014).</li>
<li>De Mario, A., Gherardi, G., Rizzuto, R., Mammucari, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+mitochondria+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle mitochondria in health and disease.</a> Cell Calcium. 94, 102357(2021).</li>
<li>Chang, C. R., Blackstone, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+regulation+of+mitochondrial+fission+through+modification+of+the+dynamin-related+protein+Drp1%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Dynamic regulation of mitochondrial fission through modification of the dynamin-related protein Drp1.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1201, 34-39 (2010).</li>
<li>Willingham, T. B., Ajayi, P. T., Glancy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+specialization+of+mitochondrial+form+and+function+in+skeletal+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Subcellular specialization of mitochondrial form and function in skeletal muscle cells.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 757305(2021).</li>
<li>Kuznetsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+subpopulations+and+heterogeneity+revealed+by+confocal+imaging%3A+possible+physiological+role%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial subpopulations and heterogeneity revealed by confocal imaging: possible physiological role.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1757 (5-6), 686-691 (2006).</li>
<li>Díaz-Vegas, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+calcium+increase+induced+by+RyR1+and+IP3R+channel+activation+after+membrane+depolarization+regulates+skeletal+muscle+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial calcium increase induced by RyR1 and IP3R channel activation after membrane depolarization regulates skeletal muscle metabolism.</a> Frontiers in Physiology. 9, 791(2018).</li>
<li>Boncompagni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+are+linked+to+calcium+stores+in+striated+muscle+by+developmentally+regulated+tethering+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria are linked to calcium stores in striated muscle by developmentally regulated tethering structures.</a> Molecular Biology of the Cell. 20 (3), 1058-1067 (2009).</li>
<li>Reggiani, C., Marcucci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+controversial+issue%3A+Can+mitochondria+modulate+cytosolic+calcium+and+contraction+of+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">A controversial issue: Can mitochondria modulate cytosolic calcium and contraction of skeletal muscle fibers.</a> The Journal of General Physiology. 154 (9), e202213167(2022).</li>
<li>Heinzel, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+of+T-tubules+and+reduced+synchrony+of+Ca2%2B+release+in+myocytes+from+chronically+ischemic+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Remodeling of T-tubules and reduced synchrony of Ca2+ release in myocytes from chronically ischemic myocardium.</a> Circulation Research. 102 (3), 338-346 (2008).</li>
<li>Al-Qusairi, L., Laporte, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-tubule+biogenesis+and+triad+formation+in+skeletal+muscle+and+implication+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">T-tubule biogenesis and triad formation in skeletal muscle and implication in human diseases.</a> Skeletal Muscle. 1 (1), 26(2011).</li>
<li>Pérez-Treviño, P., Pérez-Treviño, J., Borja-Villa, C., García, N., Altamirano, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+T-tubules+and+sarcoplasmic+reticulum+in+ventricular+myocytes+in+early+cardiac+hypertrophy+in+a+pressure+overload+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Changes in T-tubules and sarcoplasmic reticulum in ventricular myocytes in early cardiac hypertrophy in a pressure overload rat model.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 37 (4), 1329-1344 (2015).</li>
<li>Celestino-Montes, A., Pérez-Treviño, P., Sandoval-Herrera, M. D., Gómez-Víquez, N. L., Altamirano, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+role+of+T-tubules+disruption+and+decreased+SERCA2+on+contractile+dynamics+of+isolated+rat+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Relative role of T-tubules disruption and decreased SERCA2 on contractile dynamics of isolated rat ventricular myocytes.</a> Life Sciences. 264, 118700(2021).</li>
<li>Song, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orphaned+ryanodine+receptors+in+the+failing+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Orphaned ryanodine receptors in the failing heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (11), 4305-4310 (2006).</li>
<li>Houzelle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skeletal+muscle+mitochondrial+dynamics+in+relation+to+oxidative+capacity+and+insulin+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Human skeletal muscle mitochondrial dynamics in relation to oxidative capacity and insulin sensitivity.</a> Diabetologia. 64 (2), 424-436 (2021).</li>
<li>Call, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ulk1-mediated+autophagy+plays+an+essential+role+in+mitochondrial+remodeling+and+functional+regeneration+of+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Ulk1-mediated autophagy plays an essential role in mitochondrial remodeling and functional regeneration of skeletal muscle.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 312 (6), C724-C732 (2017).</li>
<li>Fealy, C. E., Grevendonk, L., Hoeks, J., Hesselink, M. K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+mitochondrial+network+dynamics+in+metabolic+disorders+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle mitochondrial network dynamics in metabolic disorders and aging.</a> Trends in Molecular Medicine. 27 (11), 1033-1044 (2021).</li>
<li>Rivera-Alvarez, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+session+of+physical+activity+restores+the+mitochondrial+organization+disrupted+by+obesity+in+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">A single session of physical activity restores the mitochondrial organization disrupted by obesity in skeletal muscle fibers.</a> Life Sciences. 256, 117965(2020).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2022).</li>
<li>Sage, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DeconvolutionLab2%3A+An+open-source+software+for+deconvolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">DeconvolutionLab2: An open-source software for deconvolution microscopy.</a> Methods. 115, 28-41 (2017).</li>
<li>Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+membrane+potential+probes%2C+and+the+proton+gradient%3A+a+practical+usage+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial membrane potential probes, and the proton gradient: a practical usage guide.</a> Biotechniques. 50 (2), 98-115 (2011).</li>
<li>Ma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy%2C+mitochondrial+homeostasis%2C+and+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitophagy, mitochondrial homeostasis, and cell fate.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 467(2020).</li>
<li>Meinild, L. A. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise+training+increases+skeletal+muscle+mitochondrial+volume+density+by+enlargement+of+existing+mitochondria+and+not+de+novo+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica%22%5BJournal%5D)">Exercise training increases skeletal muscle mitochondrial volume density by enlargement of existing mitochondria and not de novo biogenesis.</a> Acta Physiologica. 222 (1), (2018).</li>
<li>Memme, J. M., Erlich, A. T., Phukan, G., Hood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise+and+mitochondrial+health%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Exercise and mitochondrial health.</a> Journal of Physiology. 599 (3), 803-817 (2021).</li>
<li>Gan, Z., Fu, T., Kelly, D. P., Vega, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+mitochondrial+remodeling+in+exercise+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle mitochondrial remodeling in exercise and diseases.</a> Cell Research. 28 (10), 969-980 (2018).</li>
<li>Schiaffino, S., Hanzlíková, V., Pierobon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relations+between+structure+and+function+in+rat+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Relations between structure and function in rat skeletal muscle fibers.</a> Journal of Cell Biology. 47 (1), 107-119 (1970).</li>
<li>Vincent, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spectrum+of+mitochondrial+ultrastructural+defects+in+mitochondria+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The spectrum of mitochondrial ultrastructural defects in mitochondria myopathy.</a> Scientific Reports. 6, 30610(2016).</li>
<li>Mishra, P., Varuzhanyan, G., Pham, A. H., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dynamics+is+a+distinguishing+feature+of+skeletal+muscle+fiber+types+and+regulates+organellar+compartmentalization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dynamics is a distinguishing feature of skeletal muscle fiber types and regulates organellar compartmentalization.</a> Cell Metabolism. 22 (6), 1033-1044 (2015).</li>
<li>Cheng, A. J., Westerblad, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+isolation%2C+and+measurement+of+force+and+myoplasmic+free+%5BCa2%2B%5D+in+fully+intact+single+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Mechanical isolation, and measurement of force and myoplasmic free [Ca2+] in fully intact single skeletal muscle fibers.</a> Nature Protocols. 12 (9), 1763-1776 (2017).</li>
<li>Kuznetsov, A. V., Javadov, S., Margreiter, R., Hagenbuchner, J., Ausserlechner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+function%2C+structure%2C+and+intracellular+organization+in+situ+in+cardiomyocytes+and+skeletal+Muscles%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial function, structure, and intracellular organization in situ in cardiomyocytes and skeletal Muscles.</a> International Journal of Molecular Sciences. 23 (4), 2252(2022).</li>
<li>Pawley, J. B. Fundamental limits in confocal microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPawley%2C+JB+%22In%3A+Pawley%2C+J.+%28eds%29+Handbook+of+Biological+Confocal+Microscopy%22">In: Pawley, J. (eds) Handbook of Biological Confocal Microscopy</a>. , Springer, Boston, MA. (2006).</li>
<li>Otsu, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Threshold+selection+method+from+gray-level+histogram%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+System+Man+Cybernetics%22%5BJournal%5D)">Threshold selection method from gray-level histogram.</a> IEEE Transactions on System Man Cybernetics. 9, 62-66 (1979).</li>
<li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> The Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).</li>
<li>Jakobs, S., Stephan, T., Ilgen, P., Brüser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+microscopy+of+mitochondria+at+the+nanoscale%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Light microscopy of mitochondria at the nanoscale.</a> Annual Review of Biophysics. 49, 289-308 (2020).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

מיטוכונדריה הם אברונים עם יכולת שיפוץ גבוהה. ניתן לשנות במהירות את התוכן, הצפיפות והתפוצה שלהם באמצעות הפעלת מנגנוני האיחוי והביקוע של המיטוכונדריה, המכונים דינמיקה מיטוכונדריאלית1, והאיזון בין מנגנוני התחלופה של המיטוכונדריה: הביוגנזה המיטוכונדריאלית ומסלול פירוק המיטוכונדריה המיוחד, מיטופגיה21,22. התוכן והמורפולוגיה של המיטוכונדריה יכולים להשתנות בהתאם לסוג התא ולשלב ההתפתחות וניתן לעצב אותם מחדש תחת גירויים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים 17,22,23,24. לכן, המחקר של מורפולוגיה מיטוכונדריאלית היה רלוונטי במשך יותר מחצי מאה25. יש לציין כי ניתוח מיטוכונדריה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים היה הטכניקה הסטנדרטית שיושמה במחקרים רבים26.
מחקרים פלואורסצנטיים במיקרוסקופ קונפוקלי צברו רלוונטיות בשנים האחרונות בשל יכולתם להדמיית תאים חיים של מיטוכונדריה בעומקי סיבים שונים, מה שיכול לעזור להבין טוב יותר את תפקיד המיטוכונדריה בשרירי השלד בתנאים אדפטיביים ולא מסתגלים שונים27. במחקר זה מתוארת מתודולוגיה לניתוח צפיפות ופיזור המיטוכונדריה בסיבי שריר שלד חיים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. אחד האתגרים העיקריים בעבודה עם סיבי שריר שלד חיים הוא למנוע התכווצות מתהליכי הבידוד ועד לרישום הקונפוקלי של המיטוכונדריה. כדי להשיג מטרה זו, תמיסת Mg ו- ATP Relaxגבוהה 17 משמשת לשמירה על הסיבים רגועים למשך שעתיים לפחות, מה שנותן מספיק זמן לבצע את תהליך בידוד הסיבים, עומס הפלואורופור ורכישת אות מיטוכונדריאלי במיקרוסקופ קונפוקלי. נקודה קריטית בפרוטוקול היא השגת הסיבים באופן מכני מכיוון שהוא דורש דיוק גבוה ורקמות טריות; עם זאת, ניתן להשיג חבילות סיבים קיימא משריר חולדה עם טכניקה זו ששימשה בעבר ודווחה28. השגת סיבים שלמים מאפשרת לשמר את הסרקולמה ואת הסביבה התוך-תאית, תוך שמירה על האינטראקציה המטבולית והתפקודית בין מבני התא28,29.
שלא כמו עבודה עם רקמות או תאים קבועים, רכישת תמונות פלואורסצנטיות של הדמיה של תאים חיים על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי מאפשרת ניטור בזמן אמת של ההשפעה של תנאי ניסוי מגוונים. הפרוטוקול הנוכחי יכול לשמש כדי לחקור שינויים בצפיפות ובחלוקה של המיטוכונדריה בזמן אמת ולחקור הבדלים בין קבוצות ניסוי, כמו למשל הדוגמאות שמוצגות כאן בין סיבים רזים לסיבים שמקורם ב-Ob (איור 3 ואיור 4). זה תמיד צריך להיחשב כי הדמיה של תאים חיים מרמז סטנדרטיזציה של תנאי עבודה אופטימליים עם נזק קל לתאים. זמן העבודה, איכות הפתרונות המשמשים, פרמטרי הרכישה וחשיפת הלייזרים חייבים להיות מבוקרים היטב. לפיכך, שיקולים מהותיים מוזכרים להלן.
מיטוכונדריה של סיבי שריר לא ניתן לרשום באופן אורכי לחלוטין על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי בשל גודל הסיב ואת הנזק של הסיב שיכול להיגרם על ידי חשיפה ארוכה לייזר. עם זאת, מדגם מייצג של הסיבים נרשם תחת טכניקה זו. למרות שניתן להקליט את כל עובי סיבי שריר השלד של חולדה על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי, זה מרמז על זמן הקלטה ארוך יותר וחשיפה לקרן הלייזר. במקרה של חולדות ביקורת, לא נתקלו בבעיות עם הקלטות אלה. עם זאת, סיבים מתנאים פתולוגיים עשויים להיות רגישים יותר לנזק כפי שנצפה בסיבים מחולדות אוב. כתוצאה מכך, עדיף לרכוש ערימה של תמונות קונפוקליות מייצגות המתקבלות במרחקי Z שונים. כאשר נרשם רק קטע מעובי הסיבים, מומלץ לקחת את הערימה באותו עומק על כל הסיבים שנבדקו, שכן פיזור וצפיפות המיטוכונדריה יכולים להשתנות בהתאם למיקומו בתוך הסיב. רכישת האות בעומק מעל 15 מיקרומטר מומלצת לקבלת תמונות קונפוקליות מייצגות של קרן המטבע הבינלאומית, תוך הימנעות מאוכלוסיות SSM הממוקמות קרוב לפריפריה.
במהלך הרכישה הקונפוקלית יש לקחת בחשבון כמה שיקולים חשובים. ראשית, בחירת עדשת הטבילה האובייקטיבית בהתחשב בהגדלה, NA גבוה ומדיום טבילה. מכיוון שהתאים נשמרים בתווך דגירה הידרופילי, מדד השבירה של מדיום הדגירה והטבילה חייב להיות דומה כדי לקבל אות טוב ולסרוק עמוק לתוך הרקמה. מושגת בדרך כלל באמצעות עדשה אובייקטיבית טבילה במים. תמונות קונפוקליות של איור 3 ואיור 4 נרכשו עם יעד טבילה במים של 20x, 0.7 NA. מטרה זו מאפשרת תיעוד של הסיב בכל עומקו, אך הוחלט על סריקה ב-15, 18 ו-21 מיקרומטר, שכן ניתן לקבל תמונות קונפוקליות מייצגות של קרן המטבע הבינלאומית עם אות בעוצמה פלואורסצנטית גבוהה ונזק קל לסיבים. ניתן לשקול הגדלה אחרת, כגון פי 40 ושמן כמדיום טבילה, אך יש צורך להעריך אותה.
שנית, גודל הפיקסלים לרכישת הדמיה מחושב על פי משפט נייקוויסט, המאפשר בחירה של גודל פיקסל מתאים המונע דגימת יתר (חשיפה גבוהה יותר ללייזר) ותת-דגימה (מוביל לרזולוציה נמוכה יותר)30. החישוב תלוי במאפייני העדשה האובייקטיבית שנבחרה ובאורך הגל (~90 ננומטר). זה יכול להיות מותאם עם זום; לכן, הגדרת זום אחת בלבד מספקת גודל פיקסלאופטימלי 30. עם זאת, בפועל, הזום תלוי גם באזור הדגימה שיש לנתח. לכן, מציאת איזון מאפשרת עבודה עם גודל פיקסל הקרוב ביותר לקריטריון Nyquist וזה גם מתאים לאזור להיות מנותח. איור 3 ואיור 4 נרכשו בגודל פיקסלים של 150 ו-190 ננומטר, מה שאיפשר ניתוח של הרוחב המלא של הסיב שהוא ~50-80 מיקרומטר.
שלישית, יש להשתמש בקוטר חור סיכה מתאים המונע מאור שאינו ממוקד להגיע לגלאי. בדרך כלל, 1 איירי נחשב לגודל חור הסיכה האופטימלי מכיוון שהוא מאפשר זיהוי של ~80% מהפוטונים שמקורם במישור מיקוד30. עם זאת, כמה דגימות ביולוגיות מוכתמות המראות רמות פלואורסצנטיות נמוכות דורשות עלייה של חור סיכה30. תמונות קונפוקליות של איור 3 ואיור 4 נרכשו עם חור סיכה בגודל 3 איירי עקב אות נמוך שצולם עם אוורירי נמוך יותר. חשוב לקחת בחשבון כי העלייה בעוצמת האות הנובעת מהגדלת גודל חור הסיכה מובילה להפחתת הרזולוציה עקב עלייה באור שנלכד מחוץ לפוקוס. מסיבה זו, המלצנו להשתמש בגודל חור סיכה קרוב ככל האפשר לאוורירי אחד.
כאשר הן נרכשות כראוי, ניתן לעבד תמונות קונפוקליות כדי לקבל מידע כמותי על צפיפות ופיזור המיטוכונדריה. בכל מקרה, שלב תמונת העיבוד הקריטי של הסף צריך להתבצע לפני הניתוח כדי לשפר את כימות האות. במהלך שלב מכריע זה, מוגדר ערך עוצמת הפלואורסצנטיות המפריד בין הפיקסלים החיוביים במיטוכונדריה לבין אלה שברקע. ניתן להגדיר את הסף על ידי התאמה גאוסיאנית של הפסגה המייצגת מיטוכונדריה כאשר ההיסטוגרמה של התמונה מציגה שתי פסגות, אחת המתאימה לרקע והשנייה למיטוכונדריה. עם זאת, התפלגות בימודאלית לא תמיד מושגת בכל אחת מהתמונות, ולכן יש ליישם שיטות סף אחרות.
בפרוטוקול זה מתואר יישום הסף של אוטסו, שהוא שיטה לא פרמטרית ולא מפוקחת שנועדה למצוא את ערך הסף כאשר שתי הפסגות אינן מופרדות, או כאשר פסגות אחרות קיימות31. ניתן ליישם את Otsu בקלות באמצעות פלטפורמת קוד פתוח לניתוח ביולוגי-תמונה; עם זאת, ניתן לבדוק שיטות סף אחרות. אותה שיטת סף חייבת להיות מיושמת על כל התמונות הקונפוקליות ויש לחשב אותה באופן עצמאי עבור כל תמונה קונפוקלית. החלת הסף על ערימה שלמה מובילה לתוצאות שגויות. לאחר קבלת התמונות הבינאריות לאחר תהליך הסף, ניתוח צפיפות המיטוכונדריה ו- FFT יכול להתבצע בקלות על ידי ביצוע ההוראות המתוארות בפרוטוקול זה. עם זאת, יש לנקוט בזהירות בעת ביצוע שני הניתוחים כדי להימנע מהכללת גרעינים ונימים, שכן זה יוביל לטעויות כימות. לגבי צפיפות, זה מספיק כדי להחסיר את הפיקסלים, או את השטח הכבוש על ידי גרעינים או נימים, מן הפיקסלים או השטח הכולל להיות מנותח. בנוסף, בעת ביצוע ניתוח FFT, יש לוודא כי אות המיטוכונדריה הוא ישר. לעומת זאת, כאשר אות המיטוכונדריה מוטה, הוא יכול לייצר פרופילים שאינם מייצגים את התפלגות האורך של המיטוכונדריה, מה שמניב נתוני ספקטרום FFT שגויים. בנוסף, ניתן להחיל שלב עיבוד מראש כדי להפחית את הרעש בתמונות. פרוטוקול זה מתאר שני שלבים אופציונליים לעיבוד מקדים באמצעות מסנן חציוני ודה-ממד דה-ממד. ההשפעות של שיטות עיבוד מקדים אלה על התמונה ותכולת צפיפות המיטוכונדריה מוצגות באיור משלים S1. חשוב לקחת בחשבון שבעוד שתהליכים מקדימים אלה יכולים לשפר את איכות התמונה, הם יכולים גם לגרום לאובדן של פרטים מסוימים בתמונה. לכן, יש להשתמש בהם בזהירות ולהחיל באופן עקבי על כל התמונות המנותחות.
למרות יתרונותיו, מיקרוסקופ קונפוקלי מוגבל על ידי רזולוציה לרוחב (XY) של 180-250 ננומטר כאשר התנאים האופטימליים לרכישה מיושמים32. קוטר המיטוכונדריה הוא ~ 200-700 ננומטר, קרוב לגבול העקיפה של מיקרוסקופ קונפוקלי; לפיכך, מבנים תת-מיטוכונדריאליים אינם ניתנים לזיהוי הולם33 ולא ניתן להעריך אותם על ידי ניתוחי צפיפות ו-FFT המוצגים בפרוטוקול זה. ניתן לחקור טכניקות אחרות של מיקרוסקופיה ברזולוציית על, כגון מיקרוסקופ שחזור אופטי סטוכסטי (STORM), ננוסקופיית דלדול פליטה מגורה (STED) או מיקרוסקופ תאורה מובנה (SIM), כדי לפתור מבנים תת-מיטוכונדריאליים32. בפרוטוקול זה, התמונות הקונפוקליות של המיטוכונדריה מתקבלות באמצעות פלואורופור TMRE, אשר תלוי בפוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית. לכן, עוצמת הפלואורסצנטיות של המיטוכונדריה יכולה להשתנות בהתאם לפוטנציאל הממברנה שלהם. תהליך סף מתבצע לפני ניתוח הנתונים כדי להתגבר על בעיה זו. כל הפיקסלים מעל סף מוגדר נחשבים חיוביים לאות מיטוכונדריאלי ללא תלות בערך הפלואורסצנטי שלהם. עם זאת, יש לציין כי מיטוכונדריה עם פוטנציאל קרום נמוך מאוד לא ניתן לפתור עם טכניקה זו. לכן, מחקרים משלימים של כימות תכולת חלבון מיטוכונדריאלי מומלץ. יתרון בשימוש ב-TMRE הוא שניתן להשתמש בתמונות קונפוקליות גם לניתוח פוטנציאלי של קרום המיטוכונדריה, אך יש לבצע בקרות נאותות עם חומרי פירוק צימוד, כגון קרבוניל-ציאניד-p-טריפלואורומתוקסיפנילהידראזון (FCCP). בנוסף, ניתן להשיג את ההוראות לניתוח צפיפות ופיזור המיטוכונדריה באמצעות אינדיקטורים פלואורסצנטיים ירוקים למיטוכונדריה, אשר מעמיסים מיטוכונדריה ללא קשר לפוטנציאל הממברנה שלהם, אך אסטרטגיית הדגירה והגדרות הרכישה הקונפוקלית צריכות להיות סטנדרטיות.
בהתחשב בכך שמבנה המיטוכונדריה קשור לתפקודים מיטוכונדריאליים ותאיים חיוניים, הפרוטוקול המתואר כאן יכול לספק מידע רב ערך על עיצובם מחדש במהלך מחלה או על ידי עלבון לחץ מסוים. זה יכול לתרום להבנה טובה יותר של תפקודים מרכזיים של שרירי השלד הנשלטים על ידי מיטוכונדריה, כגון ייצור אנרגיה, או שבהם מיטוכונדריה ממלאים תפקיד חשוב באינטראקציה עם אברונים אחרים, כגון צימוד כיווץ-מטבוליזם. ביצוע הוראות הפרוטוקול מאפשר להעריך את צפיפות ופיזור המיטוכונדריה בשרירי השלד החי. שלבי הפרוטוקול מחולקים לשלושה שלבים עיקריים המתמקדים בדיסקציה של צרור שרירי השלד, סריקת מיקרוסקופ קונפוקלי וניתוח תמונה, בהם נכללות הוראות מפורטות ושיקולים חשובים. יש לציין כי ניתן לבצע אופטימיזציה נוספת של הפרוטוקול כדי לחקור שלבי Z נוספים לשחזור מיטוכונדריאלי מלא בתוך הסיב בהתאם לצרכי המשתמש. לדוגמה, ניתן לבחון את התמונה הקונפוקלית ואת שלבי הניתוח כדי לחקור מבנים תאיים בעלי התפלגות דומה, כגון TT בדגימות חיות וקבועות.

מיטוכונדריה יוצרים רשתות דינמיות מאוד המווסתות בעיקר על ידי האיזון בין התארכותו (איחוי) ופיצול (ביקוע)1,2, המווסתות על ידי ביטוי ופעילות של חלבונים כגון מיטופוסין 1 ו-2 (Mfn1 ו-Mfn2), ואטרופיה של חלבון אופטי 1 (Opa1), המווסתים את האיחוי של קרום המיטוכונדריה החיצוני והקרום הפנימי, בהתאמה 1,2. חלבון הקשור לדינמין (Drp1) מווסת בעיקר את הביקוע המיטוכונדריאלי כאשר הוא עובר זרחן ב-Ser6163.
בשרירי השלד, הוכח היטב כי הרשת המיטוכונדריאלית מסודרת בתת-אוכלוסיות מוגדרות היטב מבחינה מבנית בהתבסס על קרבתן לאזורי תאים שונים (מיופיברילים, סרקולמה וגרעינים)4,5. המיטוכונדריה הממוקמים ממש מתחת לסרקולמה נקראים מיטוכונדריה תת-סרקולמלית (SSM), אלה הממוקמים בין חוטי ההתכווצות נקראים מיטוכונדריה אינטרמיופיברילארית (IMF), ותת-האוכלוסייה המיטוכונדריאלית סביב הגרעינים נקראת רשת מיטוכונדריה פרי-גרעינית (PMN). יתר על כן, הוצע כי תת-אוכלוסיות מיטוכונדריאליות אלה יש פונקציות ספציפיות לאזור והם מתמחים מטבולית 4,5.
תחזוקת הומאוסטזיס האנרגיה התאית, המאפשרת תפקוד מטבולי והתכווצות, תלויה במידה רבה באינטראקציה ובתקשורת באתרים ספציפיים דרך הרשת המיטוכונדריאלית (למשל, אינטראקציית IMF ו- SSM)4,6. בנוסף לאינטראקציות ברשת המיטוכונדריה, המיטוכונדריה יכולים גם לקיים אינטראקציה עם אברונים אחרים, וליצור קומפלקסים מבניים ופונקציונליים. בהקשר זה, הוכח כי IMF יכול להיות ממוקם בסמוך לרשתית הסרקופלזמית (SR) ובסמיכות ליחידות השחרור Ca2+ (CRU), שנוצרו על ידי הצינוריות הרוחביות (TT)7. עובדה זו רלוונטית בשל התפקיד של ספיגת Ca2+ מיטוכונדריאלי בוויסות סינתזת ATP ואפופטוזיס. לאחרונה הוצע גם תפקיד פוטנציאלי בוויסות מעברי Ca2+ ציטוסוליים8.
TT הם פלישות של סרקולמה שיש להן התפלגות מחזורית לאורך ציר האורך של קרדיומיוציטים וסיבי שרירי השלד 9,10, בדומה להתפלגות IMF 5. לשינויים בהתפלגות TT יש השלכות פיזיולוגיות חשובות, בהתחשב בתפקידם בתפקוד ההתכווצות. עם זאת, שינויים אלה הוערכו בעיקר cardiomyocytes. שימוש בניתוח התמרת פורייה מהירה (FFT) מאפשר המרה של אותות מחזוריים מתחום המרחק לתחום התדרים, וכתוצאה מכך ספקטרום FFT המציין את התדר ואת הסדירות של האות11,12,13. למרות שיש ראיות לכך שארגון הרשת המיטוכונדריאלית בסיבי שריר השלד חיוני להסתגלות לתנאים מטבוליים שונים, שכן במהלך התחדשות לאחר פגיעה בשריר14,15, רוב הניתוחים מבוצעים בצורה איכותית.
נוסף על כך, בהתחשב בכך שתפקוד לקוי של המיטוכונדריה נקשר למספר מחלות הקשורות לשרירי השלד (למשל, ניוון דיס-שימוש)2 ולמחלות שאינן קשורות לשרירים, במיוחד מחלות מטבוליות, ולאובדן מסת השריר (כלומר, ניוון)16, ההערכה הכמותית של הרשת המיטוכונדריאלית והפיזור בשרירי השלד רלוונטית. לאחרונה, הבדל משמעותי בהתפלגות האורכית של מיטוכונדריה של סיבי שריר gastrocnemius בין קבוצה שמנה (Ob; חולדות פא /פא של צוקר), וקבוצה רזה (Lean; חולדות צוקר +/+) זוהו באמצעות FFT17. מחקר זה הדגים את התועלת של FFT בניתוח התפלגות המיטוכונדריה. לכן, פרוטוקול זה מציג מתודולוגיה לחקר מיטוכונדריה בסיבי שריר שלד חיים מתמונות שהתקבלו במיקרוסקופ קונפוקלי פלואורסצנטי. צפיפות המיטוכונדריה מכומתת על ידי סף רקע, ומתואר גם ניתוח התפלגות מיטוכונדריאלית אורכית על ידי ניתוח FFT. סכימת זרימת עבודה מוצגת באיור 1.

<table><tbody><tr><td>אדנוזין 5'-טריפוספט דיסודיום מלח הידרט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A6419</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי זכוכית בורוסיליקט</td><td>וורנר אינסטרומנטס</td><td>64-0709</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Leica</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת מיקרוסקופ קונפוקלי Leica Application Suite&nbsp;</td><td>Leica</td><td>2.7.3.9723</td><td></td></tr><tr><td>קריאטין פוספוקינאז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C3755</td><td></td></tr><tr><td>DeconvolutionLab2 (DeconvolutionLab_2.jar)</td><td>קבוצת הדמיה ביו-רפואית, EPFL</td><td>http://bigwww.epfl.ch/deconvolution/deconvolutionlab2/</td><td></td></tr> <tr><td>דימתיל סולפוקסיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DL-חומצה אספרטית אשלגן סט המיהידראט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>11240</td><td></td></tr><tr><td>אתילן גליקול-ביס(2-אמינואתילאתר)-N,N,N&חריף; N&acute;-חומצה טטראצטית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td>Miltex</td><td>MH-18</td><td></td></tr><tr><td>HC PL APO 20x/ 0.7 IMM אובייקטיבי&nbsp;</td><td>Leica</td><td>506517</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>מספריים לקשתית</td><td>Miltex</td><td>5-304</td><td></td></tr><tr><td>L-(-)-חומצה מאלית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7397</td><td></td></tr><tr><td>L-חומצה גלוטמית מונוסודיום מלח הידרט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1626</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד הקסהידרט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Maxchelator</td><td>UC Davis Health</td><td>https://somapp.ucdmc.ucdavis.edu/pharmacology/bers/maxchelator/downloads.htm&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>מספריים מיקרו</td><td>Miltex</td><td>18-1633</td><td></td></tr><tr><td>פלטפורמת קוד פתוח לניתוח תמונות ביולוגיות Fiji&nbsp;</td><td>ציבורי, מתוחזק על ידי קבוצת Eliceiri/Loci, קבוצת כד ומעבדת Tomancak. פיג'י</td><td>https://fiji.sc/</td><td></td></tr> <tr><td>פוספוקריאטין דיסודיום מלח הידרט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P7936</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>מחולל PSF (PSF_Generator.jar)</td><td>קבוצת הדמיה ביו-רפואית, EPFL</td><td>http://bigwww.epfl.ch/algorithms/psfgenerator/&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>תא הקלטה</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-27N</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>גיליון אלקטרוני Microsoft Excel</td><td>Microsoft&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סטריאו</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 508</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylrhodamine, אתיל אסטר</td><td>Invitrogen</td><td>T669</td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוח צפיפות המיטוכונדריה והתפלגות האורך בסיבי שריר שלד חי של חולדות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי

Analysis of the Mitochondrial Density and Longitudinal Distribution in Rat Live-Skeletal Muscle Fibers by Confocal Microscopy

המיטוכונדריון הוא אברון שניתן להאריך, לפרק ולשפץ בהתאם לדרישות המטבוליות של התאים. העיצוב מחדש של רשת המיטוכונדריה מאפשר למיטוכונדריה בריאה לעמוד בדרישות התאים; עם זאת, אובדן יכולת זו היה קשור להתפתחות או התקדמות של פתולוגיות שונות. בשרירי השלד, שינויים בצפיפות המיטוכונדריה ובפיזור נצפים במצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים כגון פעילות גופנית, הזדקנות והשמנת יתר, בין היתר. לכן, חקר הרשת המיטוכונדריאלית עשוי לספק הבנה טובה יותר של מנגנונים הקשורים למצבים אלה.
כאן מתואר פרוטוקול להדמיית מיטוכונדריה של סיבי שריר שלד חיים מחולדות. סיבים מנותחים ידנית בתמיסה מרגיעה ומודגרים עם אינדיקטור הדמיה פלואורסצנטי של תאים חיים של מיטוכונדריה (tetramethylrhodamine ethyl ester, TMRE). אות המיטוכונדריה נרשם במיקרוסקופ קונפוקלי באמצעות מצב סריקה XYZ כדי לקבל תמונות קונפוקליות של רשת המיטוכונדריה הבין-מיופיבריאלית (IMF). לאחר מכן, התמונות הקונפוקליות מעובדות על ידי סף ובינאריות. התמונה הקונפוקלית הבינארית לוקחת בחשבון את הפיקסלים החיוביים עבור מיטוכונדריה, אשר נספרים לאחר מכן כדי לקבל את צפיפות המיטוכונדריה. הרשת המיטוכונדריאלית בשרירי השלד מאופיינת בצפיפות גבוהה של אוכלוסיית IMF, בעלת התפלגות אורכית תקופתית דומה לזו של צינוריות T (TT). התמרת פורייה מהירה (FFT) היא טכניקת ניתוח סטנדרטית המבוצעת להערכת התפלגות TT המאפשרת למצוא את תדירות ההתפלגות ואת רמת הארגון שלהם. בפרוטוקול זה מתואר יישום אלגוריתם FFT לניתוח ההתפלגות המיטוכונדריאלית האורכית בשרירי השלד.

בעקבות הפרוטוקול הנוכחי, ניתן להשיג ניתוח של צפיפות ופיזור המיטוכונדריה בשרירי שלד חיים. הפרוטוקול מחולק לשלושה שלבים עיקריים: דיסקציה של צרור שרירי השלד, סריקת מיקרוסקופ קונפוקלי וניתוח תמונה. סקירת זרימת העבודה מוצגת באיור 1. איור 2A מראה שריר גסטרוקנמיוס שלם של חולדה בצלוחית פטרי, המסמן את הראש הצידי שממנו מתקבלים הסיבים, ואילו איור 2B מראה את צרורות הסיבים בתמיסת Relax. באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי, ניתן לרשום את המיטוכונדריה לאורך עומק סיבי שריר השלד החי באמצעות מחוון הפלואורסצנטי TMRE. TMRE הוא פלואורופור קטיוני ליפופילי המצטבר באופן סלקטיבי בתוך המיטוכונדריה על פי פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית20.
ניתן לקבל תמונה קונפוקלית אופטימלית של קרן המטבע הבינלאומית על-ידי בחירת מרחק Z מעל 15 מיקרומטר של עומק בתוך הסיב (איור 3A). איור 3B מראה תמונות קונפוקליות מייצגות XY של מיטוכונדריה עמוסים ב-TMRE שנרכשו לאורך מרחק Z של סיבי שריר הגסטרוקנמיוס (15 עד 21 מיקרומטר). התמונות הקונפוקליות עובדו על ידי סף כדי להפוך אותן לתמונות בינאריות כדי לאפשר ניתוח מיטוכונדריאלי. איור 3B (פאנל שמאלי) מראה סיב מחולדה רזה שעברה פעילות גופנית. הוא מייצג תיעוד קונפוקלי צפוי של מיטוכונדריה של סיבי שריר השלד, שכן יש לו דפוס עקבי לאורך הסיבים. לעומת זאת, בחרנו סיב מחולדת Ob (איור 3B, פאנל ימני) שמראה שינויים משמעותיים בתכולת המיטוכונדריה ובפיזורה. איור 3C מראה את הכימות של אזור הסיבים התפוס על-ידי המיטוכונדריה המתבטא בצפיפות המיטוכונדריה, המתקבלת מכל תמונה בינארית (מוצגת בלוח B). כצפוי, סיבי Ob הציגו צפיפות מיטוכונדריאלית נמוכה יותר. הוא כומת באופן עקבי לאורך מרחק Z שנותח, שנצפה גם באיור 3D כאשר צפיפות המיטוכונדריה מחושבת לכל ערימה התואמת את שלוש התמונות הקונפוקליות שנרכשו ב-15, 18 ו-21 מיקרומטר.
בדומה לניתוח צפיפות המיטוכונדריה, סריקה קונפוקלית של אינדיקטור פלואורסצנטי לדימות תאים חיים, כגון TMRE, מאפשרת לחקור את הארגון האורכי של המיטוכונדריה בשרירי שלד חיים. קרן המטבע הבינלאומית מציגה ארגון מחזורי בתחום התדרים I-band קרוב ל-TT7, אותו ניתן לנתח באמצעות FFT כדי לכמת את תדירות האות המיטוכונדריאלי ואת רמת הארגון17. איור 4 מראה את ההבדלים בארגון קרן המטבע הבינלאומית שנמצאו בגסטרוקנמיוס שמקורו בחולדות Lean ו-Ob, וכיצד FFT מאפשר למצוא את השינויים בהתפלגות האות המיטוכונדריאלי. איור 4A,B מציג ROI אורכי שנבחר במיקום מרכזי ורוחבי בסיב לצורך ניתוח FFT. לפני ביצוע FFT, מחושב הסף לחיסור רקע. לאחר מכן, התמונה בינארית; הליכים אלה מבטלים את השינויים ברמות עוצמת הפלואורסצנטיות של האות המיטוכונדריאלי. התמונה הבינארית מספקת את פרופיל העלילה של התפלגות הפלואורסצנטיות הדרושה לביצוע FFT.
איור 4C,D מציג את החזר ההשקעה שנבחר בלוחות A ו-B עם פרופילי העלילה שלהם (לוחות עליונים). מפרופילי העלילה ניתן להבחין בהבדלים בהתפלגות הפלואורסצנטית בין הסיבים שמקורם בחולדות Lean ו-Ob, כמו גם בהבדלים בין החזר ההשקעה בתוך אותו סיב. עבור כל פרופיל מגרש, ספקטרום FFT המתאים שלהם מוצג (לוחות נמוכים יותר). שיא ספקטרום ה-FFT המרבי מציין את תדר ה-FFT (ציר X) של התפלגות האות המיטוכונדריאלי לאורך ציר האורך. ניתן להפוך אותו לערך מרחק הקרוב ל-2 מיקרומטר בהחזר ההשקעה הצידי והמרכזי מהחולדה הרזה. יש לציין כי גודל ה-FFT של הפסגה הוא מדד לסדירות האות המיטוכונדריאלי, ושינויים באמפליטודה זו חושפים שינויים בהתפלגות המיטוכונדריאלית.
איור 4E,F מראה את ההבדלים בספקטרום ה-FFT בין סיבים רזים וסיבים שמקורם ב-Ob, שבהם נותחו תשואות השקעה רוחביות ומרכזיות, בהתאמה. ב-ROI רוחבי (איור 4E) תדירות ההתפלגות האורכית של המיטוכונדריה הייתה דומה בסיבים רזים ובסיבים שמקורם ב-Ob; אף על פי כן, המשרעת של שיא ה-FFT המרבי בסיבים שמקורם ב-Ob הייתה גבוהה יותר, מה שתואם את הסדירות הגבוהה יותר של האות שנצפתה בתמונה באיור 4B. אף על פי כן, החזר ההשקעה המרכזי (איור 4F) של Ob נצפה כדוגמה להפחתה קריטית של שיא ה-FFT בהשוואה ל-Lean כאשר קיים שינוי חשוב בהתפלגות המיטוכונדריה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65306/65306fig01v2.jpg"> איור 1: סכימה לניתוח מיטוכונדריאלי בשרירי השלד באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. תוכנית זו מסכמת את השלבים העיקריים של הפרוטוקול בשלושה שלבים נפרדים. השלב הראשון, דיסקציה של צרורות סיבי שריר gastrocnemius, מחולק לשלושה שלבים עוקבים, בידוד שריר gastrocnemius, ואחריו דיסקציה מכנית שריר לצרורות כדי סוף סוף לבצע בחירה חזותית של אלה קיימא. השלב השני מורכב מרכישת הדמיה של תאים חיים על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי, הכולל דגירה עם פלואורופור (TMRE) במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר כדי למקם את הסיבים בתא. לאחר מכן, ההגדרות המתאימות נעשות במיקרוסקופ כדי לבצע את רכישת התמונות הקונפוקליות. בשלב השלישי מתבצע עיבוד תמונה קונפוקלית וניתוח נתונים. החל מעיבוד תמונה, כאשר נדרש סף כדי ליצור תמונות בינאריות שמהן מתבצעים חישובי צפיפות מיטוכונדריאלית והתפלגות מיטוכונדריאלית על ידי FFT. קיצורים: TMRE = tetramethylrhodamine ethyl ester; FFT = התמרת פורייה מהירה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65306/65306fig01largev2.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65306/65306fig02.jpg"> איור 2: דיסקציה של צרור שרירי השלד. (A ) ראש גסטרוקנמיוס רוחבי של חולדה מנותח (חץ שחור) בצלוחית פטרי עם תמיסת Relax. (B) תמונה מייצגת של צרורות סיבי שריר gastrocnemius בתמיסת Relax לפני העמסת TMRE. קיצור: TMRE = tetramethylrhodamine ethyl ester. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65306/65306fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65306/65306fig03.jpg"> איור 3: ניתוח צפיפות מיטוכונדריה. (A) איור המייצג את מרחק Z המומלץ לסריקה קונפוקלית של מיטוכונדריה של IMF בסיבי שרירי השלד. (B) סדרה של תמונות קונפוקליות של מיטוכונדריה עמוסות TMRE בסיבי שרירי השלד, שהתקבלו מחולדת צוקר +/+ (רזה) ומחולדת פא/פה של צוקר (Ob) שמנה שתועדו במרחק Z (מעומק של 15 עד 21 מיקרומטר). התמונות עובדו על ידי סף והפכו לתמונות בינאריות. (C) צפיפות מיטו-מחושבת של פרוסות קונפוקליות המתקבלות במרחקי Z שונים שנצפו בלוח B. (D) צפיפות המיטו-צפיפות המתקבלת מהערימה שמורכבת מהתמונות שנצפו בלוח B. התמונות בלוח B הן בגודל 65 x 50 מיקרומטר. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. קיצורים: צפיפות מיטו-צפיפות = צפיפות מיטוכונדריאלית; IMF = מיטוכונדריה intermyofibrillar; Ob = השמנת יתר; SSM = מיטוכונדריה subsarcolemmal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65306/65306fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65306/65306fig04.jpg"> איור 4: ניתוח התפלגות מיטוכונדריאלית על-ידי FFT. תמונות קונפוקליות מייצגות של מיטוכונדריה טעונות במחוון הפלואורסצנטי TMRE שנרכשו בעומק 21 מיקרומטר מעומק סיבי שריר השלד שהתקבלו מחולדת צוקר +/+ מאומצת (Lean, לוח A) ומחולדת פא /פא שמנה של צוקר (Ob, לוח B). התמונות עובדו על ידי סף והפכו לתמונות בינאריות. החזר השקעה רוחבי ומרכזי מלוח A (לוח C) ומלוח B (לוח D) עם פרופילי העלילה המתאימים שלהם של עוצמת פלואורסצנטיות (חלקה עליונה) וספקטרום FFT (חלקה תחתונה). FFT חושב מתוך ROI עם רוחב של 256 פיקסלים, המתאים לגודל ROI של 39 x 5 מיקרומטר בלוח A וגודל ROI של 50 x 5 מיקרומטר בלוח B. לוח E מראה את ההבדלים של ספקטרום FFT שנמצא בין מיטוכונדריה שמקורם בחולדות Lean ו-Ob בהחזר ההשקעה הצידי, ואילו לוח F מראה את ההבדלים של ספקטרום FFT של החזר השקעה מרכזי. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. קיצורים: A.U. = יחידות שרירותיות; FFT = התמרת פורייה מהירה; ROI = אזורי עניין; Ob = השמנת יתר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65306/65306fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>מגיב</td>
			<td>ריכוז סופי ב 100 מ"ל</td>
			<td>מניות </td>
		</tr><tr><td>קיי-אספרטט</td>
			<td>100 מ"מ</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>KCl</td>
			<td>20 מ"מ</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>HEPES</td>
			<td>20 מ"מ</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>L-חומצה גלוטמית</td>
			<td>3 מ"מ</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>חומצה מאלית</td>
			<td>3 מ"מ</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>EGTA</td>
			<td>0.1 מ"מ</td>
			<td>10 מ"מ</td>
		</tr><tr><td>MgCl2</td>
			<td>1 mM חינם מ"ג2+</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>CaCl2</td>
			<td>0.00002 mM חינם Ca2+</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>פוספוקריאטין די-נא</td>
			<td>5 מ"מ</td>
			<td>500 מ"מ</td>
		</tr><tr><td>קריאטין פוספוקינאז</td>
			<td>5 U/מ"ל</td>
			<td>200 U/מ"ל</td>
		</tr><tr><td>MgATP</td>
			<td>5 מ"מ</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>pH 7.3 (עם NaOH)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1: ריאגנטים של תמיסת הרפיה וריכוז.
איור משלים S1: השפעת שיטות עיבוד מקדים של תמונה. (A) תמונות קונפוקליות מייצגות של מיטוכונדריה טעונות במחוון הפלואורסצנטי TMRE שנרכשו בעומק של 18 מיקרומטר בסיבי שרירי השלד שהתקבלו מחולדת צוקר +/+ (רזה, פאנל עליון) ומחולדת פא/ פא שמנה של צוקר (פאנל תחתון), יחד עם התמונות שלהן שהתקבלו לאחר עיבוד מקדים באמצעות סף Otsu, מסנן החציון וסף Otsu, ודה-קונבולוציה דו-ממדית וסף אוטסו. (B) תרשים פרופיל של צפיפות מיטו-צפיפות המתקבלת מתמונות קונפוקליות (לוח A) לאחר עיבוד מקדים בשיטות שונות. גודל התמונות בלוח A הוא 65 x 50 מיקרומטר. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. קיצורים: 2D-Decon = 2D deconvolution; צפיפות מיטו-צפיפות = צפיפות מיטוכונדריאלית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65306/Supl%201-rev4.pdf" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לניתוח שינויים בצפיפות המיטוכונדריה ובפיזור האורך על ידי הדמיית שרירי שלד חיים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת רשת מיטוכונדריאלית.

The mitochondrion is an organelle that can be elongated, fragmented, and renovated according to the metabolic requirements of the cells. The remodeling of ...

שיפוץ הרשת המיטוכונדריאלית מתרחש בלחץ פיזיולוגי ובמצבים פתולוגיים. עם זאת, ההשפעות של עיצוב מחדש של המיטוכונדריה בשרירי השלד עדיין אינן מובנות לחלוטין. פרוטוקול זה מאפשר לכמת שינויים במיטוכונדריה בשרירי שלד חיים, ומשפר את הבנתנו את יחסי הגומלין בין שינויים במיטוכונדריה לבין תפקוד התאים.עבודה עם שרירי שלד חיים מציבה אתגרים עקב כיווץ סיבים במהלך בידוד ורגישות לתמונה במהלך סריקה קונפוקלית. פרוטוקול זה מתאר תהליך בידוד באמצעות פתרון הרפיה, המאפשר ניתוח של סיבי שריר קיימא להערכה מיטוכונדריאלית באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. הפרוטוקול שלנו מטפל במחסור בזרימות עבודה לניתוח כמותי של רשתות מיטוכונדריאליות בסיבי שרירי השלד.השלבים המתוארים כאן מאפשרים למשתמשים לנצל יותר תמונות המתקבלות במיקרוסקופ קונפוקלי באמצעות עיבוד תמונה על ידי סף וניתוח פורייה מהיר כדי להשיג כימות של צפיפות ופיזור המיטוכונדריה. אנו מתעניינים בחקר שינויים בשרירי השלד, במיוחד דינמיקה מיטוכונדריאלית ועיצוב מחדש של מבנה המיטוכונדריה במהלך מצוקה, וכיצד ניתן לווסת אותם באמצעות התערבות כגון פעילות גופנית וצום ביניים.

analysis-mitochondrial-density-longitudinal-distribution-rat-live

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Fibroblasts מחולים שנשאו מוטציות בגני פרקינסון גורמי מחלות לייצג...

השימוש בפיברובלסטים אנושיים ראשוניים לניטור פנוטיפים מיטוכונדריאלי בתחום מחלת פרקינסון

פרוטוקול זה משתמש תלת מימדי (3D) טכניקות הדמיה וניתוח כדי להמחיש ולכמת המיטוכונדריה עצבים ספציפיים. הטכניקות ישימות למצבים אחרים שם אות ניאון אחד משמש כדי לבודד ערכת משנה של נתונים מ עוד אות ניאון.

הדמיה תלת-ממדית וניתוח של המיטוכונדריה בתוך סיבי עצב Intraepidermal אנושי

הדמיה וניתוח מיטוכונדריאלי מרקמת מוח של יונקים היא משימה מאתגרת. כאן, אנו מתארים כיצד ניתן להשתמש בניתוח שחזור תלת מימדי (תלת מימד) ממיקרוסקופ אלקטרונים סורק בלוק סדרתי (SBFSEM) כדי לקבל תובנות על הניתוח המורפולוגי והנפחי של אברון ייצור אנרגיה קריטי זה.

ניתוח של המוח המיטוכונדריה באמצעות מיקרוסקופ סידורי בלוק פן אלקטרונים סורק

כאן, אנו מציגים פרוטוקול סיב שריר מהיר מנתח, המאפשר איכות מכתים משופרת, ובכך רכישה אוטומטית וכימות של אוכלוסיות סיבים באמצעות ImageJ התוכנה הזמין באופן חופשי.

פרוטוקול אוטומאטי ומהיר עבור שריר סיבי ניתוח אוכלוסיית חתכי שריר עכברוש באמצעות שרשרת השרירן כבד אימונוהיסטוכימיה

הליך שלאחר קיבוע שונה מגביר את הניגודיות של חלקיקי גליקוגן ברקמה. מאמר זה מספק פרוטוקול שלב אחר שלב המתאר כיצד לטפל ברקמה, לבצע את ההדמיה ולהשתמש בשיטות סטרולוגיות כדי להשיג נתונים משוחדים וכמותיים על התפלגות גליקוגן תת-תאי ספציפית לסוג סיבים בשריר השלד.

כימות של התפלגות גליקוגן תת-תאית בסיבי שריר השלד באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור

עדויות הולכות וגוברות מצביעות על כך שחדירה מוגזמת של שומנים בתוך שרירי השלד גורמת לליפטוקסיות ולסוכרת. כאן אנו מציגים פרוטוקול שלם, כולל עיבוד רקמות, צביעה עם Bodipy, רכישת תמונה וניתוח, כדי לכמת את הגודל, הצפיפות וההתפלגות התת-תאית של טיפות שומנים באופן ספציפי מסוג סיבים.

סוג הסיבים וניתוח ספציפי תת-תאי של תכולת טיפות השומנים בשרירי השלד

אנו מתארים פרוטוקול לקבלת סיבים מנותקים אנזימטית באורכים וסוגים שונים משישה שרירים של עכברים בוגרים: שלושה מהם כבר תוארו (flexor digitorum brevis, extensor digitorum longus, soleus) ושלושה מהם נותקו בהצלחה בפעם הראשונה (extensor hallucis longus, peroneus longus, peroneus digiti quarti).

סיבי שריר שלד שלמים קצרים, בינוניים וארוכים המתקבלים על ידי דיסוציאציה אנזימטית של שישה שרירי גפיים אחוריות של עכברים: Beyond Flexor Digitorum Brevis

במחקר זה, אנו מתארים פרוטוקול שלב אחר שלב ומדגישים את הפרטים העיקריים לקביעת מאפיינים מורפולוגיים של מיטוכונדריה בתאים חיים, כולל הכנת דגימות, רכישת תמונה וניתוח נתונים. שיטה זו משמשת בדרך כלל לבחינת מורפולוגיה מיטוכונדריאלית לחקר מצבים שונים.

קביעת מורפולוגיה מיטוכונדריאלית בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית

כאן אנו מתארים את לוקלייזר האירועים המיטוכונדריאלי (MEL), תוסף ImageJ שימושי בכימות השינויים התלת-ממדיים בביקוע המיטוכונדריאלי ובפעילות ההיתוך לאורך זמן. אנו מתארים גם צינור עיבוד תמונה שימושי לניקוי מיקרוגרפים לפני ניתוח ב-ImageJ.

הבנת השינויים במורפולוגיה המיטוכונדריאלית באמצעות מיקרוגרפים פלואורסצנטיים דינמיים ותלת מימדיים

הזרקות מקומיות של תווית צבע מיטוכונדריאלי סופית של מיטוכונדריה תא שוואן ב-vivo למיקרוסקופיה קונפוקלית. שיטה זו משתמשת בהוכחת היתכנות שהודגמה ברקמת שריר שלד של עכברים עם שריר בריא או חולה, כדי לספק הדמיה מיטוכונדרית ברזולוציה גבוהה.

שיטות לכימות במקום של מורפולוגיית מיטוכונדריה בתאי שריר וסופיים של עכברים

חקור ניתוח צפיפות מיטוכונדריה והתפלגות אורך בסיבי שריר שלד חי של חולדות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. השיטה מאפשרת כימות רשתות מיטוכונדריות ומספקת תובנות לגבי דינמיקה מיטוכונדרית בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים.

ניתוח צפיפות המיטוכונדריה והתפלגות האורך בסיבי שריר שלד חי של חולדות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי

גלה סרטונים נוספים