Name: 쥐 췌장의 생체 내 이미징을 위한 안정화된 창 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-06T13:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: 학습하세요 쥐 췌장의 생체 내 고해상도 이미징을 위한 SWIP 안정화 창 기술을 통해 췌선암과 췌장염의 병태생리학적 동역학을 연구하는 방법을. 이 기법은 세포 수준의 장기적 관찰과 치료 전략 발전에 필수적입니다.

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Evelyn Lipper Charitable Foundation, Gruss-Lipper Biophotonics Center, Integrated Imaging Program for Cancer Research, NIH T-32 Fellowship(CA200561) 및 국방부 췌장암 연구 프로그램(PCARP) 보조금 PA210223P1.

이 프로토콜에 설명된 모든 절차는 Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)의 사전 승인을 포함하여 척추동물 사용에 대한 지침 및 규정에 따라 수행되었습니다.
1. 창문의 패시베이션
알림: 스테인리스강의 패시베이션은 금속의 오염 물질을 청소하고 얇은 산화물 층을 생성하여 티타늄16을 능가하는 연조직과의 금속의 생체 적합성을 크게 증가시킵니다.
<ol><li>광학 창틀을 1%(w/v) 효소 활성 세제 용액으로 세척하여 패시베이션 과정을 시작합니다.</li>
	<li>유리병 안에 70°C의 5%(w/v) 수산화나트륨 용액에 프레임을 30분 동안 담그십시오.</li>
	<li>프레임을 꺼내 탈이온수로 헹굽니다.</li>
	<li>프레임을 55°C의 7%(w/v) 구연산 용액에 새 유리병 안에 10분 동안 담그십시오.</li>
	<li>프레임을 제거하고 탈이온수로 다시 헹굽니다.</li>
	<li>1.2단계를 반복하고 마지막으로 마지막으로 탈이온수로 창틀을 헹굽니다.</li>
</ol>2. 종양 이식 또는 창문 수술을 위한 준비
참고: 췌장 종양 연구의 경우 종양 세포를 이식하고 명백한 종양으로 자라도록 해야 합니다. 생체 내에서 종양 세포를 시각화하려면 Dendra2와 같은 형광 단백질을 발현하도록 유전적으로 변형된 세포를 사용하는 것이 좋습니다. 밝은 형광 단백질 라벨을 사용하면 조직 자가형광과 관련된 잠재적인 문제를 완화할 수 있습니다. 사용될 수 있는 다른 잠재적인 형광 단백질, 염료, 및 유전적으로 인코딩된 형광 마우스 모델은 다른 곳에서 논의되었다17,18. 수술 부위의 오염을 방지하려면 후드 또는 층류 캐비닛에서 수술 절차를 수행하고 준비, 수술 및 회복을 위해 별도의 영역이 사용되는지 확인하십시오.
<ol><li>수술 전에 모든 수술 기구를 오토클레이브에서 멸균하고 필요한 경우 후속 절차를 위해 핫 비드 멸균기를 사용하십시오. 수술이 팁만 사용하는 기술을 사용하는지 확인하십시오.</li>
	<li>가열된 수술용 패드와 비드 멸균기의 전원을 켜고 적절한 작동 온도에 도달할 때까지 기다립니다. 가열 패드 온도는 잠재적인 화상을 방지하기 위해 표면 온도계로 모니터링해야 합니다. 온도를 적절하게 제어할 수 없는 경우 가열 패드 위에 멸균 천을 놓습니다. 알림: 종양 및 창문 이식과 같은 짧은 절차(≤20분) 중 체온은 가열된 수술 패드를 사용하는 동안 최소한의 영향을 받습니다. 그러나 장시간 타임랩스 이미징과 같이 더 오랜 기간 동안 마취하려면 체온을 유지하기 위해 마우스를 가열된 챔버에 넣어야 합니다.</li>
	<li>마취실에서 5% 이소플루란으로 마우스를 마취합니다.</li>
	<li>중요 단계: 마우스가 의식을 잃으면 마취를 2%로 낮춥니다. 마취 수준과 쥐의 바이탈을 주의 깊게 모니터링합니다(예: 맥박 산소 측정기 사용)19.</li>
	<li>각막 건조를 방지하기 위해 쥐의 각 눈에 눈 윤활제를 소량 떨어뜨립니다.</li>
	<li>수술 전 왼쪽 상복부에 제모 크림을 넉넉하게 발라 제모를 제거합니다. 20초 후 물에 적신 티슈를 사용하여 모발과 제모 크림을 단단히 닦아냅니다. 수술 부위에서 모든 머리카락이 제거될 때까지 필요에 따라 이 과정을 반복합니다.</li>
	<li>수술 전 진통을 위해 PBS 90μL에 희석한 부프레노르핀 10μL(0.1mg/kg)를 피하 주사합니다.</li>
</ol>3. 췌장 종양 이식
<ol><li>원하는 농도로 종양 세포의 부분 표본을 준비합니다(종양 세포 배가시간 기준). 세포 현탁액을 인슐린 주사기에 넣고 얼음 위에 보관합니다. 이 프로토콜을 따르기 위해, Erstad et al.21에서 채택된 orthotopic 주입 프로토콜에 따라 최대 50μL의 PBS에 현탁된 106개의 syngeneic KPC 종양 세포20을 사용합니다 참고: 이 농도로 주입된 이 세포주는 10-14일까지 만져질 수 있거나 적절하게 큰 종양을 일상적으로 생성했습니다. 이 세포주 및 다른 췌장 세포주의 서브클론은 적절한 크기의 종양을 생성하기 위해 적절한 농도와 타임라인에 대해 평가되어야 합니다.</li>
	<li>소독 비누를 사용하여 손을 씻으십시오.</li>
	<li>새로운 수술을 받기 전에 새로운 멸균 장갑을 착용하십시오.</li>
	<li>마우스를 멸균 수술 후드로 옮기고 부분적인 오른쪽 측면 욕창 위치에 놓습니다.</li>
	<li>종이 테이프로 팔다리를 고정합니다. 알림: 절차 전반에 걸쳐 기기를 올바르게 사용하는 것이 중요합니다. 집게, Castroviejo 가위 및 진공 픽업 도구를 잡는 방법의 파일은 그림 2A-C에 나와 있습니다.</li>
	<li>소독제로 복부를 소독합니다(그림 2D).</li>
	<li>발가락 꼬집기 테스트를 수행하여 동물이 완전히 마취되었는지 확인하십시오.</li>
	<li>집게와 Castroviejo 가위를 사용하여 피부에 10-15mm의 왼쪽 늑골 밑 절개를 만듭니다(그림 2E).</li>
	<li>필요하다고 판단되는 경우 면봉이나 소작 펜을 사용하여 지혈을 조절합니다.</li>
	<li>집게와 Castroviejo 가위로 아래 근육을 조심스럽게 나누어 복막에 들어갑니다(그림 2F).</li>
	<li>멸균 면봉을 사용하여 췌장과 비장을 비외상적으로 외부화합니다.</li>
	<li>주름이 생기지 않도록 췌장을 벌립니다(그림 2G).</li>
	<li>췌장의 몸 또는 꼬리(혈관에서 멀어짐)에서 원하는 종양 주사 부위를 식별합니다.</li>
	<li>중요한 단계: 췌장을 조심스럽게 배치한 후 겸자를 사용하여 조직에 장력을 가하고 경사가 위쪽을 향하도록 인슐린 주사기 팁을 췌장의 원하는 부위에 4-5mm 깊이로 삽입합니다(그림 2H).</li>
	<li>종양 세포 용액을 천천히 주입합니다. 성공적인 주입을 확인하는 작은 기포를 찾습니다(그림 2I).</li>
	<li>종양 세포 주입 기포를 건드리지 않고 조심스럽게 췌장을 복부로 되돌립니다(그림 2J).</li>
	<li>흡수성 5-0 폴리디옥사논 봉합사를 사용하여 먼저 근육층을 닫은 다음 단속된 봉합사로 피부를 닫습니다(그림 2K-N).</li>
	<li>절개 부위를 시아노아크릴레이트 접착제로 덮은 다음(그림 2O) 회복을 위해 가열 램프 아래의 깨끗한 케이지에 마우스를 다시 넣습니다. 감염을 예방하기 위해 식수에 항생제를 투여하십시오. 쥐를 모니터링하고 수술 후 완전히 회복할 수 있도록 합니다. 알림: 항생제는 IACUC 프로토콜에서 요구하는 대로 투여됩니다. 모든 동물은 개별적으로 수용됩니다.</li>
	<li>종양이 복벽을 통해 만져질 수 있을 때까지 10-14일 동안 종양이 자라도록 두십시오.</li>
</ol>4. 췌장 창 수술
<ol><li>동물이 이미징할 준비가 되면 창문 이식 수술을 시작합니다. 먼저 소독 비누로 손을 씻으십시오.</li>
	<li>새로운 수술을 받기 전에 새 멸균 장갑을 착용하십시오.</li>
	<li>가열된 수술용 스탠드에서 마우스를 오른쪽 측면 욕창 위치에 놓아 왼쪽 복부를 노출시킵니다.</li>
	<li>종이 테이프를 사용하여 쥐의 앞다리와 뒷다리를 가열된 수술 단계에 두개골과 꼬리로 고정합니다. 비장(피부 아래)이 수술 필드 내에서 보이는지 확인합니다(그림 3A).</li>
	<li>멸균 상태를 유지하려면 후드에 있는 모든 수술 기구의 포장을 풉니다.</li>
	<li>소독약을 넉넉하게 바르고 쥐의 피부를 면봉으로 닦아 수술 부위를 소독합니다.</li>
	<li>발가락 꼬집기 테스트를 수행하여 동물이 완전히 마취되었는지 확인하십시오.</li>
	<li>임계 단계: 집게로 복부 왼쪽 상부 사분면의 피부를 들어 올리고 Castroviejo 가위를 사용하여 피부와 근육계를 ~10mm 원형으로 절개합니다(그림 3B,C).</li>
	<li>출혈을 조절하고 필요한 경우 면봉이나 소작기를 사용하여 지혈을 유지합니다.</li>
	<li>비장에 부착된 췌장의 위치를 파악하고 절개 부위 내에서 췌장이 놓여 있는 방향을 식별하여 지지 십자수를 배치해야 하는 위치를 결정합니다.</li>
	<li>5-0 실크 봉합사를 사용하여 첫 번째 스티치를 근육층의 원하는 위치에 놓습니다. 이 끝을 3-5 노트로 묶습니다. (그림 3D,E)</li>
	<li>절개 부위를 직접 꿰매십시오. ~ 5cm의 꼬리를 자르고 남겨 둡니다 (그림 3F).</li>
	<li>첫 번째 스티치에 수직으로 4.11 및 4.12 단계를 반복합니다 (그림 3G, H).</li>
	<li>중요 단계: 췌장을 부드럽게 들어 올려 십자수 위에 놓습니다(그림 3I,J). 조작 중에 췌장이 손상되지 않도록 주의하십시오.</li>
	<li>중요한 단계: 5-0 실크 봉합사를 사용하여 구멍에서 ~1mm 떨어진 곳에서 피부와 근육층을 원주형으로 꿰매는 지갑 끈 스티치를 수행합니다(그림 3K).</li>
	<li>원형 절개의 가장자리가 창의 홈 안에 안착되도록 창틀을 배치합니다(그림 3L).</li>
	<li>이식 된 창을 5-0 실크로 단단히 묶어 고정하십시오.</li>
	<li>100μL의 액체 시아노아크릴레이트 접착제를 1mL 주사기에 넣습니다.</li>
	<li>~10초 동안 섬세한 압축 공기 흐름을 적용하여 조직을 건조시킵니다.</li>
	<li>창틀의 바깥쪽 가장자리를 집게로 잡고 부드럽게 들어 올려 창틀 밑면에서 췌장이 분리되도록 합니다.</li>
	<li>중요한 단계: 창의 홈을 따라 액체 시아노아크릴레이트 접착제를 얇게 디스펜싱합니다(그림 3M). 췌장 조직에 접착제가 묻지 않도록 하십시오.</li>
	<li>진공 픽업을 사용하여 5mm 커버슬립을 들어 올립니다.</li>
	<li>광학 창틀 중앙의 홈에 커버슬립을 조심스럽게 놓습니다. 시아노아크릴레이트 접착제가 굳을 수 있도록 가벼운 압력으로 유지합니다(~25초).</li>
	<li>집게를 사용하여 진공 픽업에서 커버슬립을 분리합니다.</li>
	<li>십자수 봉합사를 조여 췌장을 커버슬립에 꼭 맞게 고정합니다(그림 3N,O). 참고 : 십자수는 췌장에 손상과 허혈을 일으킬 수 있으므로 너무 세게 조이지 마십시오.</li>
	<li>봉합사의 끝을 자릅니다.</li>
	<li>마우스에서 테이프를 벗겨냅니다.</li>
	<li>이소플루란 기화기를 끕니다.</li>
	<li>마우스를 깨끗한 케이지로 옮기거나 생체 내 현미경으로 직접 옮깁니다.</li>
	<li>창문 수술 후 동물을 개별적으로 수용하고 완전히 회복될 때까지 모니터링하십시오.</li>
	<li>그런 다음 이미징은 이전에 설명한 대로 22,23,24 긴 이미징 세션의 경우 마우스를 가열된 챔버에 넣어 체온을 유지하고 IACUC 표준에 따라 보조 유체를 제공합니다.</li>
</ol>5. 췌장염 유도를 위한 세룰레인 치료
<ol><li>췌장염의 발병을 조사하려면 SWIP를 이식한 후 건강한 쥐에게 세룰레인을 투여합니다. 쥐가 14-18 시간 동안 금식되고 세룰레인 투여 전에 ad libitum 물을 주는지 확인하십시오.</li>
	<li>멸균 1x DPBS 100μL에 세룰레인 50μg/kg을 1시간 간격으로 복강내로 최대 8회 주입합니다. 동일한 부피의 1x DPBS만 투여하고 복강내로 주사하여 대조군 마우스에 투여합니다.</li>
	<li>이미징 후 IACUC 표준에 따라 자궁 경부 탈구에 의한 첫 번째 주사 후 24시간 후에 마우스를 희생합니다.</li>
	<li>앞서 설명한 대로 22,23,24에서 2레이저 다광자 현미경에서 이미징을 수행합니다. 긴 이미징 세션의 경우 마우스를 가열된 챔버에 넣어 체온을 유지하고 IACUC 표준에 따라 보조 유체를 제공합니다.</li>
</ol>

Implanted Stabilized Window를 사용한 쥐 췌장 영상

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<li>Seynhaeve, A. L. B., Ten Hagen, T. L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+of+tumor-associated+vasculature+using+advanced+dorsal+skinfold+window+chambers+on+transgenic+fluorescent+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy of tumor-associated vasculature using advanced dorsal skinfold window chambers on transgenic fluorescent mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (131), 55115(2018).</li>
<li>Gorelick, F. S., Lerch, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+animal+models+of+acute+pancreatitis+reproduce+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Do animal models of acute pancreatitis reproduce human disease.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (2), 251-262 (2017).</li>
<li>Dolai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+the+membrane-fusion+regulator+Munc18c+attenuates+caerulein+hyperstimulation-induced+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Depletion of the membrane-fusion regulator Munc18c attenuates caerulein hyperstimulation-induced pancreatitis.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (7), 2510-2522 (2018).</li>
<li>Niederau, C., Ferrell, L. D., Grendell, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caerulein-induced+acute+necrotizing+pancreatitis+in+mice%3A+protective+effects+of+proglumide%2C+benzotript%2C+and+secretin%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Caerulein-induced acute necrotizing pancreatitis in mice: protective effects of proglumide, benzotript, and secretin.</a> Gastroenterology. 88 (5 Pt 1), 1192-1204 (1985).</li>
<li>Dunphy, M. P., Entenberg, D., Toledo-Crow, R., Larson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+microcartography+and+subcellular+imaging+of+tumor+angiogenesis%3A+a+novel+platform+for+translational+angiogenesis+research%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">In vivo microcartography and subcellular imaging of tumor angiogenesis: a novel platform for translational angiogenesis research.</a> Microvascular Research. 78 (1), 51-56 (2009).</li>
<li>Shanja-Grabarz, X., Coste, A., Entenberg, D., Di Cristofano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time%2C+high-resolution+imaging+of+tumor+cells+in+genetically+engineered+and+orthotopic+models+of+thyroid+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine-Related+Cancer%22%5BJournal%5D)">Real-time, high-resolution imaging of tumor cells in genetically engineered and orthotopic models of thyroid cancer.</a> Endocrine-Related Cancer. 27 (10), 529-539 (2020).</li>
</ol>

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

여기에 설명된 SWIP 프로토콜은 십자수 바스켓 기술을 활용하여 췌장 조직 안정화의 개선된 방법을 제공합니다. 초기 복부 영상 창(AIW)은 복부 내부 장기의 생체 내 영상(IVI)을 가능하게 했지만 췌장과 같은 연조직의 움직임을 적절하게 제한하지 못했습니다. 이에 대응하여 Park et al.은 수평 금속 선반을 통합하고 유리 커버슬립과의 접촉을 유지하면서 췌장 조직의 안정화를 개선할 수 있는 췌장 이미징 창(PIW)을 개발했습니다. 이 접근법은 측면 안정성을 향상시키지만, 고형 췌장 종양의 크기가 선반과 커버 유리 사이의 좁은 공간을 초과하기 때문에 이미징을 제한합니다. SWIP는 십자수 바스켓으로 췌장을 안정화하고 축 방향 및 측면 이동을 모두 제한하는 동시에 큰(≤10mm) 고형 종양을 수용할 수 있도록 하여 이 문제를 해결합니다.
SWIP를 AIW 및 PIW와 같은 이전 이미징 창과 직접 비교한 것은이전에 15였습니다. 이는 D...

양성 및 악성 췌장 질환은 잠재적으로 생명을 위협할 수 있으며, 병태생리학에 대한 이해에 상당한 격차가 있습니다. 췌장염(췌장 염증)은 미국에서 위장 질환 관련 입원 및 재입원의 세 번째 주요 원인이며 상당한 이환율, 사망률 및 사회경제적 부담과 관련이 있다1. 암 관련 사망의 세 번째 주요 원인으로 꼽히는췌관 선암(PDAC)은 대부분의 췌관 악성 종양3을차지하며3 5년 생존율이 11%에 불과하다2. PDAC에서 암 관련 사망률의 주요 원인은 압도적인 전이성 부담입니다. 불행히도 대부분의 환자는 전이성 질환을 가지고 있습니다. 따라서 PDAC에서 전이의 역학을 이해하는 것은 암 연구 분야에서 중요한 미충족 요구입니다.
염증과 췌장의 전이성 연쇄 작용을 뒷받침하는 메커니즘은 잘 알려져 있지 않습니다. 이러한 지식 격차의 주요 원인은 생체 내에서 췌장 세포 역학을 관찰할 수 없다는 것입니다. 이러한 세포 역학을 직접 관찰하면 췌장 질환 환자의 진단 및 치료를 활용하고 개선할 수 있는 중요한 표적을 밝힐 수 있습니다.
생체 내 영상(IVI)은 연구원들이 살아있는 동물의 생물학적 과정을 실시간으로 시각화하고 연구할 수 있는 현미경 기술입니다. IVI는 생체 내 및 해당 생물학적 과정의 기본 환경 내에서 세포 내 및 미세환경 역학을 고해상도로 직접 시각화할 수 있습니다. 따라서 IVI는 건강한 과정과 병리학적 과정에 대한 생체 내 관찰을 허용한다.
MRI, PET, CT와 같은 현대의 전신 영상 기법은 전체 장기를 잘 볼 수 있으며 임상 증상이 나타나기 전에도 병리를 밝힐 수 있다4. 그러나 그들은 단일 세포 분해능을 얻거나 질병-췌장염 또는 악성 종양의 초기 단계를 밝힐 수 없습니다.
이전 연구에서는 단세포 분해능 IVI를 사용하여 피부 5,6, 유방7, 폐8, 간 9, 뇌10, 췌장 종양11의 양성 및 악성 질환을 관찰하여 질병 진행 기전을 규명했다12. 그러나 쥐 췌장은 IVI를 사용하여 단세포 분해능을 달성하는 데 상당한 장애물이 되는데, 이는 주로 깊은 내장 위치와 높은 순응도로 인해 발생합니다. 더욱이 장간막은 장간막 내에서 비장, 소장, 위와 연결되는 분지화되어 확산되어 분포된 기관으로 접근하기 어렵습니다. 조직은 또한 인접한 연동 운동과 호흡으로 인한 움직임에 매우 민감합니다. 췌장의 움직임을 최소화하는 것은 단일 세포 해상도 현미경 검사에 필수적인데, 몇 미크론의 움직임 아티팩트도 이미지를 흐리게 하고 왜곡할 수 있어 개별 세포의 역학을 추적하는 것이 불가능하기 때문입니다13.
IVI를 시행하기 위해서는 복부 영상창(AIW)을 외과적으로 이식해야 한다 9,11. AIW를 외과적으로 이식하기 위해 금속 창틀을 복벽에 봉합합니다. 그 후, 관심 기관은 시아 노 아크릴레이트 접착제를 사용하여 프레임에 부착됩니다. 일부 경직된 내부 장기(예: 간, 비장, 경직 종양)에는 이것으로 충분하지만, 건강한 쥐 췌장을 이미징하려는 시도는 조직의 순응적인 질감과 복잡한 구조로 인해 차선의 측면 및 축 안정성으로 인해 손상됩니다14. 이러한 한계를 해결하기 위해 Park 등[14]은 건강한 췌장을 위해 특별히 설계된 이미징 창을 개발했습니다. 이 췌장 영상 창(PIW)은 커버슬립 바로 아래의 창틀 내에 수평 금속 선반을 통합하여 조직을 안정화하고 커버 유리와의 접촉을 유지함으로써 장 운동과 호흡의 영향을 최소화합니다. PIW는 향상된 측면 안정성을 제공하지만, 이 창은 여전히 축 방향 드리프트를 나타내며 금속 선반과 커버슬립 사이의 좁은 간격으로 인해 큰 고형 종양의 이미징을 추가로 방지한다는 것을 발견했습니다15.
이러한 한계를 해결하기 위해 건강한 췌장과 병든 췌장 모두에 대한 안정적인 장기 이미징을 달성할 수 있는 이식형 이미징 창인 SWIP( Stabilized Window for Intravital imaging of the murine Pancreas)를 개발했습니다(그림 1)15. 여기에서는 SWIP를 이식하는 데 사용되는 수술 절차에 대한 포괄적인 프로토콜을 제공합니다. 주요 목적은 전이와 관련된 동적 메커니즘을 연구하는 것이었지만 이 방법은 췌장 생물학 및 병리학의 다양한 측면을 탐구하는 데에도 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>효소 활성 세제</td><td>Alconox Inc</td><td>NA</td><td>농축, 음이온 세제와 프로테아제 효소로 수동 및 초음파 세척을 위한</td>1% (</tr><tr><td>w/v) 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td>패시베이션 시약</td></tr><tr><td>5mm 커버 유리</td><td>전자 현미경 과학</td><td>72296-05</td><td>라운드 글라스 커버슬립&nbsp;</td></tr><tr>구연산 <td>Sigma-Aldrich</td><td>의 7 % (w / v) 용액</td>&nbsp;<td>251275</td><td>패시베이션 시약</td></tr><tr><td>28G 1 mL BD 인슐린 주사기</td><td>BD</td><td>329410</td><td>세포 주입용 주사기</td></tr><tr><td>Baytril 100 (enrofloxacin)</td><td>Bayer (Santa Cruz Biotechnology)</td><td>sc-362890Rx</td><td>항생제</td></tr><tr><td>벤치 마운트 열 램프</td><td>McMaster-Carr</td><td>3349K51</td><td>열 램프</td></tr><tr><td>부프레노르핀 0.3 mg/mL</td><td>Covetrus North America</td><td>059122</td><td>부프레노르핀 Analgesia</td></tr><tr><td>Castroviejo 곡선 가위</td><td>세계 정밀 기기</td><td>WP2220</td><td>절단 조직</td></tr><tr><td>C57BL/6J 마우스</td><td>잭슨 연구소</td>용 가위 <td>000664&nbsp;</td><td>C57BL/6J 마우스</td></tr><tr><td>클로르헥시딘 용액</td><td>Durvet</td><td>7-45801-10258-3</td><td>클로르헥시딘 소독제 용액</td></tr><tr><td>압축 공기 캐니스터</td><td>Falcon</td><td>DPSJB-12</td><td>조직 건조 용 압축 공기</td></tr><tr><td>시아 노 아크릴 레이트 - 젤 Superglue</td><td>스테이플</td><td>234790-6</td><td>스킨 접착제</td></tr><tr><td>시아 노 아크릴 레이트 - 액체 초 접착제</td> 스테이<td>플</td><td>LOC1647358</td><td>커버 슬립 접착제</td></tr><tr><td>DPBS 1x</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td>DPBS for cerulein/cell injections</td></tr><tr><td>Gemini Cautery Kit</td><td>Harvard Apparatus</td><td>726067</td><td>Cautery Pen</td></tr><tr><td>Germinator 500</td><td>CellPoint Scientific</td><td>GER&nbsp; 5287-120V</td><td>비드 살균기</td></tr><tr><td>Graefe 마이크로 해부 겸자; 톱니 모양의; 약간의 곡선; 0.8mm 팁 너비; 4" 길이</td><td>Roboz 수술용</td><td>RS-5135&nbsp;</td><td>Graefe 마이크로 절개 겸자</td></tr><tr><td>이미징 현미경</td><td>NA</td><td></td><td>NA See Entenberg et al. 2011 [27]</td></tr><tr><td>이미징 소프트웨어</td><td>NA</td><td>NA</td><td>See Entenberg et al. 2011 [27]</td></tr><tr><td>Isoethesia (isoflurane)</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>50033</td><td>Isoflurane Anesthesia</td></tr><tr><td>Kim Wipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666-A&nbsp;</td><td>킴 물티슈</td></tr><tr><td>실험실 테이프</td><td>Fisher Scientific</td><td>159015R</td><td>실험실 테이프</td></tr><tr><td>마우스 해부 키트</td><td>세계 정밀 기기</td><td>MOUSEKIT</td><td>수술 도구</td></tr><tr><td>마우스 발 맥박 산소 농도계 센서</td><td>Kent Scientific</td><td>Corpo MSTAT 센서-MSE</td><td>맥박 산소 농도계</td></tr><tr><td>마우스 Surgisuite</td><td>Kent Scientific</td><td>SURGI-M04</td><td>가열 플랫폼</td></tr><tr><td>Nair 제모 로션</td><td>Amazon</td><td>B001RVMR7K</td><td>탈모 로션</td></tr><tr><td>산소</td><td>TechAir</td><td>OX TM</td><td>산소</td></tr><tr><td>PERMA-HAND 블랙 브레이드 실크 봉합사, ETHICON 크기 5-0</td><td>VWR</td><td>95056-872</td><td>실크 봉합</td></tr>사 <tr><td>인산염 완충 식염수 1x</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td>PBS</td></tr><tr><td>PhysioSuite 시스템</td><td>Kent Scientific</td><td>PhysioSuite</td><td>가열 플랫폼 컨트롤러</td></tr><tr><td>Puralube</td><td>Henry Schein 동물 건강</td><td>008897</td><td>눈 윤활제</td></tr><tr><td>Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>867WCNOGLUE</td><td>면봉</td></tr><tr><td>SHARP 정밀 배리어 팁, P-100, 100 &마이크로용; L</td><td>덴빌 사이언티픽 Inc.</td><td>P1125</td><td>100 &마이크로; L 피펫 팁</td></tr><tr><td>테트라메틸로다민 이소티오시아네이트; Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1287-500MG</td><td>혈관 라벨</td></tr><tr><td>창 고정 플레이트</td><td>NA</td><td>NA</td><td>현미경 스테이지의 창 배치를 위한 맞춤형 플레이트. 플레이트는 0.008의 스테인레스 스틸 심 스톡으로 만들어졌습니다. 플레이트의 치수는 Entenberg et al., 2018[8]을 참조하십시오.</td></tr><tr><td>창틀</td><td>NA</td><td>NA</td><td>창은 5mm 커버슬립을 수용하는 중앙 구멍이 있는 강철 프레임으로 구성됩니다. 프레임 둘레에 1.75mm의 홈이 있어 복막 근육과 피부층이 부착할 수 있는 공간을 제공합니다. Entenberg et al., 2018[8]을 참조하십시오.</td></tr></tbody></table>

쥐 췌장의 생체 내 이미징을 위한 안정화된 창

Stabilized Window for Intravital Imaging of the Murine Pancreas

췌장의 생리학과 병태생리학은 복잡합니다. 췌장염 및 췌장 선암(PDAC)과 같은 췌장 질환은 이환율과 사망률이 높습니다. 생체 내 영상(IVI)은 건강한 상태와 질병 상태 모두에서 조직의 고해상도 이미징을 가능하게 하는 강력한 기술로, 세포 역학을 실시간으로 관찰할 수 있습니다. 쥐 췌장의 IVI는 장기의 깊은 내장 및 순응적 특성으로 인해 손상과 움직임 인공물이 발생하기 쉽기 때문에 심각한 문제를 안고 있습니다. 
여기에 설명된 것은 쥐 P안장(SWIP)의 Intravital 이미징을 위한 Stabilized Window의 이식 과정입니다. SWIP는 건강한 췌장에서 세룰레인에 의해 유발된 급성 췌장염으로 변하는 동안, 그리고 췌장 종양과 같은 악성 상태에서 쥐 췌장의 IVI를 허용합니다. SWIP는 유전적으로 표지된 세포 또는 형광 염료 투여와 함께 단일 세포 및 세포 내 역학(단일 세포 및 집단 이동 포함)을 측정할 수 있을 뿐만 아니라 여러 날에 걸쳐 동일한 관심 영역의 연속 이미징을 가능하게 합니다.
PDAC에서 암 관련 사망률의 주요 원인은 압도적인 전이성 부담이기 때문에 종양 세포 이동을 포착하는 능력이 특히 중요합니다. PDAC에서 전이의 생리학적 역학을 이해하는 것은 중요한 미충족 요구이며 환자 예후를 개선하는 데 매우 중요합니다. 전반적으로 SWIP는 향상된 영상 안정성을 제공하고 건강한 췌장 및 악성 췌장 질환에서 IVI의 적용을 확대합니다.

그림 1은 Du et al.15에서 발췌한 것으로, 쥐 췌장의 IVI 타임랩스 동영상의 이미지 스틸을 보여줍니다. 일부 조직 움직임은 초기 안정화 기간(이미징 첫 시간, 그림 1A) 내에 관찰할 수 있습니다. 그러나 이 안정화 기간(&gt;75분) 이후에도 이미징을 계속하면 측면 및 축 안정성이 증가하는 것을 관찰할 수 있습니다(그림 1B). SWIP의 안정성을 이전 AIW 및 PIW 이미징 창과 비교하면 모든 창에 초기 정착 기간이 필요하다는 것을 알 수 있습니다. 그러나 SWIP는 전반적으로 가장 낮은 수준의 드리프트를 나타내며 장기 이미징에 가장 적합합니다(그림 1C-K). 이미지는 880nm에서 조명하고 프레...

우리는 쥐 췌장의 세포 내 해상도 이미징을 위한 안정화된 유치 광학 창의 외과적 이식을 위한 프로토콜을 제시하여 건강한 췌장과 병든 췌장에 대한 연속 및 종단 연구를 가능하게 합니다.

The physiology and pathophysiology of the pancreas are complex. Diseases of the pancreas, such as pancreatitis and pancreatic adenocarcinoma (PDAC) have ...

고해상도 생체 내 영상과 개선된 췌장 안정화 방법을 사용하여 췌장 선암, 췌장염 및 건강한 췌장의 생리학적 역학에 대한 이해를 높이는 것을 목표로 합니다. 이 접근법은 병태생리학적 이해의 격차를 해소할 수 있게 하여 잠재적으로 이러한 고위험 질환에 대한 치료 전략을 발전시킬 수 있습니다. 단일 세포 해상도 생체 내 이미징은 다양한 조직에서 질병 진행의 생리학과 메커니즘을 조명했습니다.그러나 췌장은 깊은 위치, 순응도 및 움직임 인공물에 대한 민감성으로 인해 고유한 문제를 제시하여 양성 및 악성 상태 모두에 대한 관찰을 위한 효과적인 접근을 방해합니다. 당사의 SWIP 기술은 이전의 복부 영상 창에 비해 쥐 췌장 안정화를 향상시킵니다. 독특하게 설계된 프레임은 마이크로 지도 제작을 위한 에칭 라인을 특징으로 하며, 이를 통해 여러 이미징 세션에서 일관된 영역 재위치추정이 가능합니다.이를 통해 며칠 동안 세포 내 역학을 쉽게 측정할 수 있어 귀중한 통찰력을 얻을 수 있습니다. SWIP 프로토콜은 정상 및 질병 상태에서 쥐 췌장의 안정적인 고해상도 단일 세포 생체 내 이미징을 가능하게 합니다. 장시간 3D 및 4D 이미징에 특히 유용하며 세포 상호 작용 및 질병 메커니즘에 대한 통찰력을 제공합니다.췌장 생리학 및 병리학을 밝히는 데 매우 유용한 이 기술은 생체 내에서 단일 세포와 그 맥락을 시각화합니다.

stabilized-window-for-intravital-imaging-of-the-murine-pancreas

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

이 비디오는 췌장 미세 구조의 종방향 타임 랩스 고해상도 이미징을 위해 췌장 이미징 창을 이식하여 췌장을 장에서 분리하는 절차를 보여줍니다.

마우스 모델의 췌장 생체 내 이미징 창 설치: 쥐 췌장 미세 구조의 타임랩스 생체 내 이미징을 위한 통합 췌장 이미징 창

이 비디오에서는 세포 역학의 장기적인 시각화를 위해 안정화된 창을 통해 쥐 췌장의 생체 내 이미징에 대해 설명합니다.

Intravital Imaging: 안정화된 이미징 창을 통해 마우스 췌장의 세포 수준을 관찰하는 방법

췌장의 생체 내 고해상도 이미징은 췌장 내 생체 내 이미징 창으로 촉진되었다.

췌장 인트라바이탈 이미징 창이 있는 뮤린 모델에서 췌장의 생체 내 세포 수준 시각화안정화

관심 조직/기관 및 피부에 직접 접착할 수 있는 광학적으로 투명한 실리콘 창을 사용하여 장기간 생체 내 이미징을 위한 접근법이 제시됩니다. 이 창문은 현재 현장에서 사용되는 다른 창문보다 저렴하고 다재다능하며 외과 적 삽입은 동물에게 제한된 염증과 고통을 유발합니다.

투명한 실리콘 윈도우를 통한 종방향 생체 내 이미징

이 프로토콜은 다광자 현미경을 사용하여 진공 안정화 이미징 창을 사용하여 실시간으로 온전한 폐의 장기 고해상도 단일 세포 이미징을 수행하는 방법을 설명합니다.

진공 안정 이미징 창으로 폐의 장기 고해상도 생체 내에 현미경

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침략적인 외과 생검에 응하여 뇌종양 세포 행동의 경도 내 활력 화상 진찰

이 프로토콜은 0-4일 된 마우스의 피부로부터 멜라닌세포 및 섬유아세포 배양을 동시에 생성하는 신속한 방법을 간략하게 설명한다. 이러한 1차 배양은 피부 세포 생물학, 색소 침착, 상처 치유 및 흑색종을 포함한 다양한 생리학적 관련 과정을 연구하기 위해 시험관 내에서 유지 및 조작될 수 있다.

1 차적인 뮤린 멜라닌세포 및 섬유아세포 배양물의 급속한 생성

학습하세요 쥐 췌장의 생체 내 고해상도 이미징을 위한 SWIP 안정화 창 기술을 통해 췌선암과 췌장염의 병태생리학적 동역학을 연구하는 방법을. 이 기법은 세포 수준의 장기적 관찰과 치료 전략 발전에 필수적입니다.

쥐 췌장의 생체 내 이미징을 위한 안정화된 창

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