Name: Onderzoek naar de farmacologische werking en het moleculaire mechanisme van salidroside bij het remmen van MCF-7-celproliferatie en -migratie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-09T12:20:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Ontdek hoe salidroside de proliferatie en migratie van MCF-7 borstkankercellen remt via het PI3K-AKT-HIF-1a-FoxO1-signaalpad. Deze methode ondersteunt onderzoek naar natuurlijke kankertherapieën.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door de Gezondheidscommissie van de provincie Sichuan (120025).

De MCF-7-cellen die voor dit onderzoek zijn gebruikt, zijn afkomstig van een commerciële bron (zie de materiaaltabel).
1. Celkweek
<ol><li>Kweek de MCF-7-cellen in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 bij 37 °C met DMEM dat 10% FBS en 1% penicilline (10.000 E/ml)/streptomycine (10.000 μg/ml) bevat (zie de materiaaltabel). OPMERKING: De cellen die 90% van de bodem van de schaal bedekten, werden voor het experiment gebruikt en ingedeeld in de volgende groepen: controlegroep, doxorubicinehydrochloridegroep (DXR, 5 μM) en Sal-groepen (20 μM, 40 μM en 80 μM), of controlegroep, LY294002 (10 μM, een remmer van PI3K) groep, Sal (80 μM) groep en LY294002 (10 μM) + Sal (80 μM) groep (zie de Tabel met materialen).</li>
</ol>2. Levensvatbaarheidstest van de cel
OPMERKING: Voor meer informatie over deze procedure wordt verwezen naar een eerder rapport27.
<ol><li>Zaad MCF-7-cellen met een dichtheid van 8 x 104 cellen/putje in platen met 96 putjes, en incubeer met Sal (10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM, 160 μM en 320 μM) gedurende 24 uur of Sal (20, 40, 80 μM) gedurende 12 uur/24 uur/36 uur/48 uur 's nachts totdat de cellen hechten.</li>
	<li>Co-incubeer na de behandeling de MCF-7-cellen met 10 μL/putje CCK-8-oplossing (zie de materiaaltabel) gedurende 2 uur. Meet vervolgens de optische dichtheid bij 450 nm (OD450) met een automatische microplaatlezer.</li>
</ol>3. Celmigratie en invasie
OPMERKING: Voor details over deze procedure wordt verwezen naar een eerder rapport35.
<ol><li>Incubeer 2 ml van 5 x 10 cellen van 6 cellen/ml in platen met6 putjes om 90% van de bodem van de schaal te bedekken.</li>
	<li>Voer een lineaire kraswond uit langs het midden van de monolaag van de cel met een steriele pipetpunt. Maak beelden met een optische microscoop om 0 uur, 24 uur en 48 uur.</li>
	<li>Gebruik Image J-software om de breedte van de kraswonden te meten.</li>
	<li>Voor de transwell-test suspendeert u MCF-7-cellen zonder serummedium en zaad in de bovenste transwellkamer die vooraf is gecoat met of zonder Matrigel (zie de tabel met materialen).</li>
	<li>Gebruik op de bodem van de transwellkamer DMEM compleet medium als chemische inductor. Verwijder na 24 uur de cellen in de bovenste kamer en fixeer de resterende invasieve en migrerende cellen in methanol35.</li>
	<li>Kleur de MCF-7-cellen met een kristalviolette oplossing (zie de tabel met materialen). Leg de beelden vast met een optische microscoop.</li>
</ol>4. Activiteitsevaluatie van Na+-K+-ATPase en Ca 2+-Mg2+-ATPase
<ol><li>Gebruik een bicinchoninezuurkit (BCA) om de eiwitconcentratie in gelyseerde MCF-7-cellen te meten, volgens de instructies van de fabrikant (zie de materiaaltabel).<ol><li>Voeg monsters van de gelyseerde cellen in hun overeenkomstige groepen toe aan de platen met 96 putjes. Voeg daarna de werkoplossing toe om verder te incuberen bij 37 °C gedurende 5 minuten. Meet ten slotte de waarden van OD636 met een multifunctionele microplaatlezer.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Flowcytometrie-analyse van apoptose en de celcyclus
OPMERKING: Voor details over deze procedure wordt verwezen naar een eerder rapport31.
<ol><li>Verbeter de cellen en oogst ze om te resuspenderen in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende een kleuring van 20 minuten met annexine V-FITC en propidiumjodide (PI) (zie de materiaaltabel) en bepaal vervolgens het aantal apoptotische cellen met behulp van een flowcytometer.</li>
	<li>Meng de geresuspendeerde monsteroplossing met PI-oplossing gedurende een incubatie van 30 minuten, gevolgd door detectie met een flowcytometer.</li>
</ol>6. DCFH-DA en Fluo-4 AM fluorescentiekleuring
OPMERKING: Voor details over deze procedure wordt verwezen naar een eerder rapport29.
<ol><li>Incubeer de MCF-7-cellen gedurende 20 minuten met een 10 μM DCFH-DA fluorescentiesonde (zie de materiaaltabel) bij 37 °C. Nadat u het overschot aan DCFH-DA grondig hebt verwijderd door drie keer te wassen met PBS, test u de fluorescentie-intensiteit bij excitatie- en emissiegolflengten van respectievelijk 488 nm en 525 nm met behulp van een fluorescentiemicroscoop.</li>
	<li>Incubeer de MCF-7-cellen met een 5 μM Fluo-4 AM fluorescerende sondeoplossing (zie de materiaaltabel) gedurende 45 minuten bij 37 °C. Bepaal na drie keer wassen met PBS de fluorescentie-intensiteitswaarden bij excitatie- en emissiegolflengten van respectievelijk 488 nm en 516 nm met behulp van een fluorescentiemicroscoop.</li>
</ol>7. Westelijke vlek
<ol><li>Voeg 2 ml van 5 x 10 6 cellen/ml celsuspensies met verschillende geneesmiddelen toe aan platen met6 putjes en kweek gedurende 24 uur in een incubator van 37 °C, 5% CO2 . OPMERKING: De groepen voor de western blot-analyse werden als volgt ingesteld: controlegroep, LY294002 (10 μM)-groep, Sal-groep (80 μM)-groep en LY294002-groep (10 μM) + Sal (80 μM) (zie de materiaaltabel).</li>
	<li>Verzamel de cellen en het supernatant en centrifugeer bij 560 × g bij 4 °C gedurende 3 min. Gooi het supernatant weg en was twee keer met voorgekoelde PBS. Centrifugeer de cellen na elke wasbeurt bij 560 × g bij 4 °C gedurende 3 min.</li>
	<li>Voeg 50 μL lysisbuffer toe aan het celmonster uit stap 7.2 voor een ijsbad van 15 minuten. Centrifugeer bij 8550 × g bij 4 °C gedurende 10 minuten om het bovenstaande eiwitmonster te verzamelen.</li>
	<li>Na het detecteren van de eiwitconcentratie met behulp van een BCA-methode, mengt u het eiwitmonster in stap 7.3 met de laadbuffer in een verhouding van 4:1, denatureert u gedurende 10 minuten bij 100 °C in een metaalbad en koelt u af tot kamertemperatuur.</li>
	<li>Voeg 20 μg van het eiwitmonster uit stap 7.4 toe, scheid de eiwitten met verschillende molecuulgewichten35met behulp van 10% SDS-PAGE (zie de tabel met materialen) en breng het vervolgens over naar PVDF-membranen van 0,22 μm. Na blokkade met 5% BSA de membranen met de bijbehorende primaire antilichamen 's nachts bij 4 °C incuberen. OPMERKING: De verdunde concentratie van de volgende primaire antilichamen is 1:1.000: gespleten caspase-9/7/3 (CC-9/7/3), Bim, Bax, Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α, FoxO1 en β-actine (zie de materiaaltabel).</li>
	<li>De volgende dag de membranen incuberen met secundair IgG-antilichaam van geiten tegen konijnen gedurende 2 uur bij 37 °C. Ontwikkel de membranen met behulp van een ECL-chemiluminescente oplossing en leg beelden vast met behulp van een contactloos kwantitatief western blot-beeldvormingssysteem (zie de materiaaltabel).</li>
</ol>8. qRT-PCR
<ol><li>Voer centrifugatie uit om MCF-7-cellen te verzamelen bij 560 x g bij 4 °C gedurende 3 minuten en voeg 500 μL buffer RL1 toe aan 5 × 106 cellen. Blaas en meng herhaaldelijk met een pipet totdat er geen celmassa's meer zichtbaar zijn. OPMERKING: Buffer RL1 is een van de componenten in de totale RNA-isolatiekit (zie de materiaaltabel).</li>
	<li>Breng de in stap 8.1 bedoelde celhomogenaten over naar de DNA-reinigingskolom die in de verzamelbuis is ingebed en centrifugeer bij 8.550 × g bij 4 °C gedurende 2 min. Verwijder de DNA-reinigingskolom en bewaar het supernatans in de opvangbuis. OPMERKING: De DNA-reinigingskolom en de verzamelbuis zijn twee van de componenten in de totale RNA-isolatiekit (zie de materiaaltabel).</li>
	<li>Voeg 800 μL buffer RL2 toe aan 500 μL van het supernatans uit stap 8.2 en meng voorzichtig. OPMERKING: Buffer RL2 is een van de componenten in de totale RNA-isolatiekit (zie de materiaaltabel). Voeg voor gebruik 120 ml watervrije ethanol toe aan 60 ml buffer RL2.</li>
	<li>Breng 700 μl van het mengsel uit stap 8.3 over in de kolom met alleen RNA die in de verzamelbuis is ingebed en centrifugeer bij 8.550 × g bij 4 °C gedurende 1 minuut. Gooi de afvalvloeistof weg in de opvangbuis. OPMERKING: De kolom met alleen RNA is een van de componenten in de totale RNA-isolatiekit (zie de tabel met materialen).</li>
	<li>Herhaal stap 8.4 om het resterende mengsel van stap 8.3 te verwerken.</li>
	<li>Voeg 500 μL buffer RW1 toe aan de kolom met alleen RNA en centrifugeer gedurende 1 minuut bij 8.550 × g bij 4 °C. Gooi de afvalvloeistof weg in de opvangbuis. OPMERKING: Buffer RW1 is een van de componenten in de totale RNA-isolatiekit (zie de materiaaltabel).</li>
	<li>Voeg 700 μL buffer RW2 toe aan de kolom met alleen RNA en centrifugeer bij 8.550 × g bij 4 ◦C gedurende 1 minuut. Gooi de afvalvloeistof weg in de opvangbuis. Herhaal stap 8.7 eenmaal. OPMERKING: Buffer RW2 is een van de componenten in de totale RNA-isolatiekit (zie de materiaaltabel).</li>
	<li>Plaats de RNA-kolom terug in de verzamelbuis en centrifugeer gedurende 2 minuten bij 8550 × g bij 4 °C om de resterende buffer RW2 te verwijderen.</li>
	<li>Breng de RNA-kolom over naar een nieuwe verzamelbuis en druppel 100 μL RNase-vrije ddH2O voorverwarmd bij 65 °C in het midden van het membraan voor de RNA-only kolom. Breng gedurende 2 minuten bij 25 °C en vang de RNA-oplossing op door centrifugatie bij 8.550 × g bij 4 °C gedurende 1 min. OPMERKING: RNase-vrij ddH2O is een van de componenten in de totale RNA-isolatiekit (zie de materiaaltabel).</li>
	<li>Voeg 4 μL 5x reactiebuffer, 1 μL oligo (dT)18 primer, 1 μL willekeurige hexameerprimer, 1 μL genspecifieke primer (zie tabel 1), 1 μL enzymmix en 5 μg van de RNA-oplossing uit stap 8.9 toe aan een strip van 100 μL met 8 buizen. Vul het reactiesysteem aan met RNasevrij water tot 20 μL.</li>
	<li>Stel de reactiecondities van het systeem als volgt in: (1): 95 °C, 30 s, 1 cyclus; (2): 95 °C, 5 s, 50 cycli, 60 °C, 34 s; (3): 95 °C, 5 s, 1 cyclus, 65 °C, 60 s, 97 °C, 1 s; en (4): 42 °C, 30 s, 1 cyclus. Voer de qRT-PCR-procedure uit. OPMERKING: De relatieve expressieniveaus van de doelgenen werden kwantitatief geanalyseerd met behulp van de 2−ΔΔCT-methode 36,37. De primerinformatie van elk gen dat voor de qRT-PCR-analyse wordt gebruikt, staat vermeld in tabel 1.</li>
</ol>9. Statistische analyse
<ol><li>Druk de gegevens uit als het gemiddelde ± standaarddeviatie van drie onafhankelijke experimenten.</li>
	<li>Analyseer de vergelijkingen tussen meerdere groepen met behulp van grafiek- en analysesoftware (zie de tabel met materialen) met een eenrichtingsvariantieanalyse (ANOVA) gevolgd door een Tukey's test. In dit werk werd P < 0,05 gedefinieerd als statistisch significant.</li>
</ol>

Het mechanisme van salidroside bij het onderdrukken van MCF-7-celmigratie en -proliferatie

De auteurs hebben niets te onthullen.

Borstkanker treft mensen van alle leeftijden en veroorzaakt een onberekenbare fysieke en mentale belasting en grote economische druk1. Borstkanker, met zijn toenemende morbiditeit en mortaliteit elk jaar, heeft ook wereldwijd de aandacht getrokken in termen van het zoeken naar effectieve op kruiden gebaseerde samengestelde therapieën die verder gaan dan conventionele behandelingen 4,5. Veelbelovend is dat een grote hoeveelheid bewijs de an...

Als een van de meest gediagnosticeerde vormen van kanker en de meest voorkomende maligniteiten, geven de laatste statistieken aan dat er in 2020 wereldwijd 2,3 miljoen gevallen van borstkanker zijn ontstaan, goed voor 11,7% van alle gevallen vankanker1. Veel voorkomende symptomen van borstkanker zijn gevoelige en tintelingen in de borsten, knobbels en pijn in de borst, tepelafscheiding, erosie of ingevallen huid en vergrote oksellymfeklieren 1,2. Nog alarmerender is dat het aantal nieuwe gevallen en de totale incidentie van borstkanker elk jaar in een overweldigend tempo blijft toenemen, goed voor 6,9% van de kankergerelateerde sterfgevallen. Op dit moment bestaat de interventie bij borstkanker nog steeds voornamelijk uit chemotherapie, chirurgie, radiotherapie en uitgebreide behandeling. Hoewel behandeling het recidiefpercentage en het sterftecijfer van patiënten effectief kan verminderen, veroorzaakt langdurige behandeling vaak resistentie tegen meerdere geneesmiddelen, haaruitval op grote oppervlakken, misselijkheid en braken, en ernstige mentale en psychologische belasting 2,3. Met name het potentiële risico op meerdere orgaanmetastasen van borstkanker dwingt mensen ook om nieuwe kruidenbronnen van medicamenteuze therapie te zoeken 4,5.
Fosfoinositide 3-kinase (PI3K)-gemedieerde signalering is betrokken bij de groei, proliferatie en overleving van borstkanker door middel van splicing die de expressie van meerdere genen beïnvloedt6. Als een stroomafwaarts signaalgevoelig eiwit van PI3K, suggereert talrijk bewijs dat eiwitkinase B (AKT) zou kunnen paren met het zoogdierdoelwit van rapamycine (mTOR) -eiwit om borstkanker verder te verhogen 7,8,9. Bovendien wordt beweerd dat de deactivering van PI3K/AKT/mTOR-signalering ook een sleutelcomponent is in geneesmiddelen die kwaadaardige proliferatie remmen en apoptose stimuleren bij borstkanker10,11,12. Het is bekend dat extreme hypoxie in de micro-omgeving van de tumor een enorme toename van hypoxie-induceerbare factor 1-alfa (HIF-1α) veroorzaakt, wat de progressie van borstkanker verder verergert13,14,15. Tegelijkertijd leidt AKT-stimulatie ook tot overmatige accumulatie van HIF-1α, waardoor apoptose in borstkankermonsters wordt beperkt16,17. Interessant is dat is bevestigd dat de activering van PI3K-AKT-HIF-1α-signalering betrokken is bij pathologische progressie en metastase bij verschillende vormen van kanker, waaronder longkanker18, colorectale kanker19, eierstokkanker20 en prostaatkanker21. Naast het feit dat het wordt georkestreerd door HIF-1α, wordt overexpressie van gevorkte hoofdtranscriptiefactor 1 (FoxO1) ook veroorzaakt door AKT-signaleringsstimulatie, die cyclusstilstand en remming van apoptose in borstkankercellen bevordert22,23. Samen suggereert het bovenstaande solide bewijs dat de remming van de cascade van PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-signalering een potentieel nieuw doelwit kan zijn voor medicamenteuze behandeling bij borstkanker.
Van salidroside (Sal) is algemeen aangetoond dat het anti-kanker 24,25, anti-hypoxie26,27,28,29 en immuunversterkende farmacologische activiteiten uitoefent 30. Het is een lichtbruin of bruin poeder dat gemakkelijk oplosbaar is in water, een soort fenylehanoïde glycoside is en een chemische structuurformule heeft van C14H 20 O7 en een molecuulgewicht van300,331,32. Modern farmacologisch onderzoek heeft aangetoond dat Sal de apoptose van maagkankercellen kan bevorderen door PI3K-AKT-mTOR-signalering te beperken24. Verder bewijs suggereert ook dat de onderdrukking van PI3K-AKT-HIF-1α-signalering door Sal-behandeling kan bijdragen aan de apoptose van kankercellen door hun gevoeligheid voor chemotherapeutische middelen te vergroten25. Er zijn ook aanwijzingen dat Sal celmigratie en -invasie beperkt en cyclusstilstand veroorzaakt door apoptose te bevorderen in de MCF-7-cellen van borstkanker bij de mens33,34. Het valt echter nog te bezien of Sal de PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-signalering kan reguleren en de kwaadaardige proliferatie van MCF-7-cellen kan remmen. Daarom was dit protocol gericht op het onderzoeken van de effecten van Sal op MCF-7-celmigratie, invasie, celcyclus en apoptose via de PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-route. De geïntegreerde onderzoeksstrategieën die conventionele, goedkope en onafhankelijke experimenten omvatten, zoals celmigratie- en invasiebeoordelingen, apoptose en celcyclusdetectie door flowcytometrie, reactieve zuurstofspecies (ROS) en Ca2+ fluorescentiebepaling, enz., kunnen een referentie vormen voor het algemene ontwerp van experimenten voor antikankeronderzoek met traditionele kruidengeneeskunde. Het experimentele proces van deze studie is weergegeven in figuur 1.

<table><tbody><tr><td>1% penicillin/streptomycin</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>AKT antilichaam</td><td>ImmunoWay Biotechnology Company</td><td>YT0185</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V-FITC/PI kit</td><td>MultiSciences Biotech Co., Ltd.</td><td>AP101</td><td></td></tr><tr><td>Automatische microplaatlezer</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax iD5</td><td></td></tr><tr><td>Bax antilichaam</td><td>Cell Signaling Technology, Inc.</td><td>#5023</td><td></td></tr><tr><td>BCA kit</td><td>Biosharp Life Sciences</td><td>BL521A</td><td></td></tr><tr><td>Bcl-2 antilichaam</td><td>Cell Signaling Technology, Inc.</td><td>#15071</td><td></td></tr><tr><td>Bim antilichaam</td><td>Cell Signaling Technology, Inc.</td><td>#2933</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+&ndash;ATPase testkit</td><td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td><td>A070-4-2</td><td></td></tr><tr><td>Celtelling kit-8</td><td>Biosharp Life Sciences</td><td>BS350B</td><td></td></tr><tr><td>Celcyclus kleuring kit</td><td>MultiSciences Biotech Co., Ltd.</td><td>CCS012</td><td></td></tr><tr><td>Geknipt caspase-3</td><td>Cell Signaling Technology, Inc.</td><td>#9661</td><td></td></tr><tr><td>Geknipt caspase-7</td><td>Cell Signaling Technology, Inc.</td><td>#8438</td><td></td></tr><tr><td>Geknipt caspase-9</td><td>Cell Signaling Technology, Inc.</td><td>#20750</td><td></td></tr><tr><td>Kristal violet oplossing</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>C0121</td><td></td></tr><tr><td>DMEM hoge glucose kweekmedium</td><td>Servicebio Technology Co., Ltd.</td><td>G4510</td><td></td></tr><tr><td>Doxorubicine hydrochloride</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-15142</td><td></td></tr><tr><td>ECL chemiluminescentie oplossing</td><td>Biosharp Life Sciences</td><td>BL520B</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal runderserum</td><td>Procell Life Science &amp; Technology Co., Ltd.</td><td>164210</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometer</td><td>BD</td><td>FACSCanto <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65634/65634eq01.jpg" style="margin: auto;"/></td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>S1060</td><td></td></tr><tr><td>FoxO1 antilichaam</td><td>ImmunoWay Biotechnology Company</td><td>YT1758</td><td></td></tr><tr><td>Geit anti-konijn IgG secundair antilichaam</td><td>MultiSciences Biotech Co., Ltd.</td><td>70-GAR0072</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism software</td><td>La Jolla</td><td>Versie 6.0</td><td></td></tr><tr><td>HIF-1&alpha; antilichaam</td><td>Affinity Biosciences</td><td>BF8002</td><td></td></tr><tr><td>Menselijke borstkanker cellijn MCF-7</td><td>Procell Life Science &amp; Technology Co., Ltd.</td><td>CL-0149</td><td></td></tr><tr><td>Loading buffer</td><td>Biosharp Life Sciences</td><td>BL502B</td><td></td></tr><tr><td>LY294002</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-10108</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Thermo&nbsp;</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>mTOR antilichaam</td><td>Servicebio Technology Co., Ltd.</td><td>GB11405</td><td></td></tr><tr><td>Na+&ndash;K+&ndash;ATPase testkit</td><td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td><td>A070-2-2</td><td></td></tr><tr><td>Optische microscoop</td><td>Olympus</td><td>IX71PH</td><td></td></tr><tr><td>p-AKT antilichaam</td><td>ImmunoWay Biotechnology Company</td><td>YP0006</td><td></td></tr><tr><td>PI3K antilichaam</td><td>Servicebio Technology Co., Ltd.</td><td>GB11525</td><td></td></tr><tr><td>p-PI3K antilichaam</td><td>Affinity Biosciences</td><td>AF3241</td><td></td></tr><tr><td>Kwantitatief western blot beeldvormingssysteem</td><td>Touch Image Pro</td><td>eBlot</td><td></td></tr><tr><td>Omgekeerde transcriptie eerste streng cDNA synthesekit</td><td>Servicebio Technology Co., Ltd.</td><td>G3330-100</td><td></td></tr><tr><td>ROS testkit</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>S0033S</td><td>DCFH-DA fluorescentie probe is hierbij inbegrepen</td></tr><tr><td>Salidroside</td><td>Chengdu Herbpurify Co., Ltd.</td><td>H-040</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE kit</td><td>Servicebio Technology Co., Ltd.</td><td>G2003-50T</td><td></td></tr><tr><td>Totale RNA isolatie kit</td><td>Foregene</td><td>RE-03014</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>HyClone</td><td>SH30042.01</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-actin</td><td>Affinity Biosciences</td><td>AF7018</td><td></td></tr></tbody></table>

onderzoek naar de farmacologische werking en het moleculaire mechanisme van salidroside bij het remmen van mcf-7-celproliferatie en -migratie

Exploring the Pharmacological Action and Molecular Mechanism of Salidroside in Inhibiting MCF-7 Cell Proliferation and Migration

Salidroside (Sal) bevat anticarcinogene, antihypoxische en ontstekingsremmende farmacologische activiteiten. De onderliggende anti-borstkankermechanismen zijn echter slechts onvolledig opgehelderd. Vandaar dat dit protocol bedoeld was om het potentieel van Sal te decoderen bij het reguleren van de PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-route in de kwaadaardige proliferatie van MCF-7-cellen van menselijke borstkanker. Ten eerste werd de farmacologische activiteit van Sal tegen MCF-7 geëvalueerd door middel van CCK-8- en celkrastesten. Bovendien werd de resistentie van MCF-7-cellen gemeten door middel van migratie- en Matrigel-invasietests. Voor celapoptose en cyclusassays werden MCF-7-cellen in stappen verwerkt met respectievelijk annexine V-FITC/PI en detectiekits voor celcycluskleuring voor flowcytometrieanalyses. De niveaus van reactieve zuurstofsoorten (ROS) en Ca2+ werden onderzocht door middel van DCFH-DA en Fluo-4 AM immunofluorescentiekleuring. De activiteiten van Na+-K+-ATPase en Ca2+-ATPase werden bepaald met behulp van de bijbehorende commerciële kits. De eiwit- en genexpressieniveaus in apoptose en de PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-route werden verder bepaald met behulp van respectievelijk western blot- en qRT-PCR-analyses. We ontdekten dat Sal-behandeling de proliferatie, migratie en invasie van MCF-7-cellen aanzienlijk beperkte, met dosisafhankelijke effecten. Ondertussen dwong de toediening van Sal MCF-7-cellen ook dramatisch om apoptose en celcyclusstilstand te ondergaan. De immunofluorescentietests toonden aan dat Sal de productie van ROS en Ca2+ in MCF-7-cellen waarneembaar stimuleerde. Verdere gegevens bevestigden dat Sal de expressieniveaus van pro-apoptotische eiwitten, Bax, Bim, gespleten caspase-9/7/3 en hun overeenkomstige genen bevorderde. Consequent verminderde Sal-interventie prominent de expressie van de Bcl-2-, p-PI3K/PI3K-, p-AKT/AKT-, mTOR-, HIF-1α- en FoxO1-eiwitten en hun overeenkomstige genen. Concluderend kan Sal worden gebruikt als een potentiële van kruiden afgeleide verbinding voor de behandeling van borstkanker, omdat het de kwaadaardige proliferatie, migratie en invasie van MCF-7-cellen kan verminderen door de PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-route te remmen.

Effecten van Sal op het remmen van overmatige proliferatie en het vertragen van wondgenezing in MCF-7-cellen Om het potentieel van Sal tegen borstkanker te onderzoeken, hebben we eerst de kankerbestrijdende eigenschappen getest met behulp van celproliferatietoxiciteit en krastesten van de MCF-7-cellijn van borstkanker bij mensen. Deze cellen werden gedurende 24 uur gecoördineerd met een concentratiereeks van Sal (5-320 μM) en de celproliferatie werd geëvalueerd met behulp van een CCK-8-test. Er werd e...

Het huidige protocol beschrijft een alomvattende strategie voor het evalueren van de farmacologische werking en het mechanisme van salidroside bij het remmen van de proliferatie en migratie van MCF-7-cellen.

Onderzoek naar de farmacologische werking en het moleculaire mechanisme van salidroside bij het remmen van MCF-7-celproliferatie en -migratie

Salidroside (Sal) contains anti-carcinogenic, anti-hypoxic, and anti-inflammatory pharmacological activities. However, its underlying anti-breast cancer ...

We richten ons op het onderzoeken van actieve stoffen die zijn afgeleid van natuurlijke producten en hun potentieel bij de behandeling van borstkanker. Daarom willen we specifiek de farmacologische effecten van salidroside en zijn moleculaire mechanismen bij het combineren van borstkanker ophelderen. Momenteel ontbreken betrouwbare experimentele technieken om de moleculaire doelwitten van salidroside bij de behandeling van borstkanker te valideren.Een belangrijke bevinding in het veld is een potentieel moleculair mechanisme van salidroside bij het verbeteren van de proliferatie en migratie van MCF7-cellen door de regulatie van PI3K/AKT/HIF-1 alfa/FoxO1-signalering. Het toekomstige onderzoek van het laboratorium is gericht op het verkennen van de pathofysiologische mechanismen die ten grondslag liggen aan het begin, de ontwikkeling, de prognose en de uitkomst van borstkanker. Daarnaast screenen we op actieve kleine moleculaire geneesmiddelen die zijn afgeleid van natuurlijke bronnen en die kunnen bijdragen aan de preventie en behandeling van borstkanker.

exploring-pharmacological-action-molecular-mechanism-salidroside

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Een methode wordt beschreven voor de menselijke retinoblastoom tumoren verspreiden in muizen. Tumorcellen worden rechtstreeks geïnjecteerd in de ogen van het immuunsysteem van deficiënte muizen. Secundaire tumoren zijn met succes gebruik van beide cellen direct geoogst van menselijke tumoren en beschaafde tumorspheres.

Oprichting en Voortplanting van Human Retinoblastoom Tumoren in het immuunsysteem van deficiënte muizen

Een compartimentering microfluïdische apparaat voor het onderzoeken van kanker stamcellen migratie wordt beschreven. Deze roman platform creëert een levensvatbare cellulaire micro-omgeving en maakt microscopische visualisatie van levende cellen voortbewegen. Zeer beweeglijke kankercellen worden geïsoleerd om moleculaire mechanismen van agressieve infiltratie, wat kan leiden tot een meer doeltreffende toekomstige therapieën te bestuderen.

Evaluatie van kankerstamcel Migratie Met behulp van compartimentering microfluïdische apparaten en live cell imaging

Een gestructureerd protocol wordt gepresenteerd voor een cel-gebaseerde test als een functionele test om de prognose van idiopathische scoliose te voorspellen met behulp van cellulaire diëlektrische spectroscopie (CDS). De test kan worden uitgevoerd met vers of ingevroren perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) en de procedure binnen 4 dagen.

Cel-gebaseerde test protocol voor de prognostische Voorspelling van Idiopathische scoliose met behulp van cellulaire diëlektrische spectroscopie

Neovascularisatie (NV) van het hoornvlies kan compliceren meerdere visuele pathologieën. Met behulp van een gecontroleerde, alkali-brandwonden-model, kan een kwantificeerbare niveau van de cornea NV worden geproduceerd voor mechanistische studie van het hoornvlies NV en evaluatie van potentiële therapieën voor neovascular aandoeningen.

Een alkali-brandwonden Model van Cornea Neovascularisatie in de muis

We ontwikkelden een in vitro model van dormantie in het beenmerg voor oestrogengevoelige borstkankercellen. Het doel van dit protocol is om het gebruik van het model aan te tonen voor de studie van de moleculaire en cellulaire biologie van dormantie en voor het genereren van hypothesen voor verder testen in vivo.

Een<em&gt; In Vitro</em&gt; Kiemrust Model van oestrogeen-gevoelige Borstkanker in het beenmerg: A Tool for Molecular Mechanism Studies en Hypothese Generation

We beschrijven twee complementaire methoden met behulp van de fluorescentie ubiquitinatie celcyclus indicator (FUCCI) en beeldanalyse of flowcytometrie om cellen in de binnenste G1-gearresteerde en buitenste proliferatieve regio's van 3D-sferoïden te identificeren en isoleren.

Beeldverwerking en flowcytometrie-gebaseerde analyse van de Cel standpunt en de celcyclus in 3D Melanoom Sferoïden

Dit manuscript beschrijft hoe incisie-achtige letsels gemaakt op gekweekte epitheliale cel monolayers gunstig model wond genezing in vitro, waardoor voor beeldvorming door confocal of laser scanning microscopie, en die kan voorzien van kwalitatief hoogwaardige kwantitatieve en kwalitatieve gegevens voor het bestuderen van zowel cel gedrag en de mechanismen die betrokken zijn bij migratie.

Methoden voor de beoordeling van epitheliale cel migratie tijdens het In Vitro wondgenezing op basis van microscopie

Hier presenteren we een protocol voor een in vitro Scratch assay met primaire fibroblasten en voor een in vivo huid wond genezings test bij muizen. Beide assays zijn eenvoudige methoden om te beoordelen in vitro en in vivo wondgenezing.

Scratch Migration assay en dorsale skinfold Chamber voor in vitro en in vivo analyse van wondgenezing

Ontduiking van natuurlijke killer (NK) celgemedieerde uitroeiing door kankercellen is belangrijk voor kanker initiatie en progressie. Hier presenteren we twee niet-radioactiviteit-gebaseerde protocollen om NK cel-gemedieerde cytotoxiciteit te evalueren in de richting van levertumorcellen. Daarnaast wordt een derde protocol gepresenteerd om NK-celmigratie te analyseren.

Meting van Natural Killer Cell-Gemedieerde Cytotoxiciteit en Migratie in de context van levertumorcellen

In deze studie presenteren we een real-time beeldvormingsmethode met confocale microscopie om cellen te observeren die naar beschadigd weefsel bewegen door ex vivo incubatie met het cochleaire epitheel dat het orgaan van Corti bevat.

In vitro time-lapse live-cell imaging om celmigratie naar het orgaan van Corti te verkennen

Ontdek hoe salidroside de proliferatie en migratie van MCF-7 borstkankercellen remt via het PI3K-AKT-HIF-1a-FoxO1-signaalpad. Deze methode ondersteunt onderzoek naar natuurlijke kankertherapieën.

Onderzoek naar de farmacologische werking en het moleculaire mechanisme van salidroside bij het remmen van MCF-7-celproliferatie en -migratie (Video) | JoVE Journal

Onderzoek naar de farmacologische werking en het moleculaire mechanisme van salidroside bij het remmen van MCF-7-celproliferatie en -migratie

Meer video's verkennen