Name: Immunoperoksidaz Testi İnsan coronavirüsleri Titrasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-04-28T22:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Öğrenin, insan coronavirüslerini immunoperoksidaz testi ile titrasyon yöntemiyle nasıl tespit edeceğinizi. Bu teknik, sitopatik etki göstermeyen virüsler için güvenilir bir alternatif sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu deneysel bir yaklaşım için tam metin protokolü mevcuttur <a href="http://www.springerprotocols.com/">Springer Protokolleri</a> .

Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/751/">Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay</a>. A revised abstract was republished due to a publisher error.
Revised Abstract:
Determination of infectious viral titers is a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for viruses that do not cause significant cytopathic effects, which is the case for prototype strains 229E and OC43 of human coronavirus (HCoV). Therefore, an alternative indirect immunoperoxidase assay (IPA) was developed for the detection and titration of these viruses and is described herein. Susceptible cells are inoculated with serial logarithmic dilutions of virus-containing samples in a 96-well plate format. After viral growth, viral detection by IPA yields the infectious virus titer, expressed as 'Tissue Culture Infectious Dose 50 percent' (TCID50). This represents the dilution of a virus-containing sample at which half of a series of laboratory wells contain infectious replicating virus. This technique provides a reliable method for the titration of HCoV-229E and HCoV-OC43 in biological samples such as cells, tissues and fluids. This article is based on work first reported in Methods in Molecular Biology (2008) volume 454, pages 93-102.
Original Abstract:
Calculation of infectious viral titers represents a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for viruses that do not cause significant cytopathic effects, which is the case for strains 229E and OC43 of human coronavirus (HCoV). An alternative indirect immunoperoxidase assay (IPA) is herein described for the detection and titration of these viruses. Susceptible cells are inoculated with serial logarithmic dilutions of samples in a 96-well plate. After viral growth, viral detection by IPA yields the infectious virus titer, expressed as "Tissue Culture Infectious Dose" (TCID50). This represents the dilution of a virus-containing sample at which half of a series of laboratory wells contain replicating virus. This technique is a reliable method for the titration of HCoV in biological samples (cells, tissues or fluids).

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/751/">Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay</a>. A revised abstract was republished due to a publisher error.

Erratum: Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay

immunoperoksidaz testi İnsan coronavirüsleri titrasyon

Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay

Bulaşıcı viral titreleri Hesaplama virologlar için bir temel ve temel deneysel bir yaklaşımı temsil ediyor. Klasik plak Testler insan coronavirüs (HCoV) suşları 229E ve OC43 durumda önemli sitopatik etkileri, yol açmazlar virüsler için kullanılamaz. Bu virüslerin saptanması ve titrasyonu için bir alternatif dolaylı immunoperoksidaz assay (IPA) burada açıklanmıştır. Duyarlı hücreler 96 plaka örnekleri seri logaritmik dilüsyonları inoküle. IPA virüs tespiti viral büyüme sonra, bulaşıcı bir virüs titresi, &quot;Doku Kültürü Bulaşıcı Doz&quot; (TCID50) olarak ifade verir. Bu, bir dizi laboratuar kuyuların yarısının kopyalayan virüs içeren bir virüs içeren bir örnek seyreltme temsil eder. Bu teknik, biyolojik örnekler HCoV titrasyonu (hücre, doku veya sıvıları) için güvenilir bir yöntem.

Bu video, immunoperoksidaz tahlil olarak bilinen bir enzimatik antijen algılama tekniği kullanılarak virüslerin tespit edilmesi ve titering için alternatif bir yöntem gösteriyor. Burada, biz, nasıl virüs örnekleri toplamak için size göstermek için test hücreleri hazırlamak ve viral titresi belirlemek için seri dilüsyonları kullanarak nihayet immunoperoksidaz tahlil olacak.

Immunoperoksidaz Testi İnsan coronavirüsleri Titrasyon

Enfeksiyöz viral titrelerin belirlenmesi, virologlar için temel ve zorunlu bir deneysel yaklaşımdır. Klasik plak sayım yöntemleri ... için kullanılamaz.

Enfeksiyöz viral titrelerin hesaplanması temel bir deneysel yaklaşımdır. Ancak, plak sayım yöntemini kullanan klasik yöntem, insan koronavirüsleri gibi sitopatik etki oluşturmayan virüsler için en güvenilir yöntem değildir. Bu videoda, immünoperoksidaz testi olarak bilinen enzimatik bir antijen saptama tekniği kullanarak, bir virüsün saptanması ve titrasyonu için alternatif bir yöntem gösteriyoruz.Burada size viral örneklerin nasıl toplanacağını, hücrelerin test için nasıl hazırlanacağını ve son olarak viral titreyi belirlemek için seri dilüsyon kullanılan immünoperoksidaz assay yöntemini göstereceğiz. Merhaba, ben Dr. Pierre Albo, Kanada'nın Quebec eyaletindeki Laval'da bulunan AM RIP Enstitüsü Nöroimmünoloji Laboratuvarı direktörüyüm. Bugün, kültürde plak oluşturmayan bu virüslerin prototip suşları olan insan koronavirüs suşları OT 43 ve 29E'nin nasıl kantifiye edileceğini göstereceğiz.Bu nedenle, bu sorunu aşmak için bir analiz yöntemi geliştirdik. Buna İmmünoperoksidaz analizi denir. Bu protokolü göstermek için size öğrencim Gabrielle Marol'u, teknisyenim Francis Nader'i ve araştırma görevlim Ellan Jacob'ı tanıtacağım.Öyleyse başlayalım. İlk olarak, doku örneklerimizi hazırlamak istiyoruz. Her organı toplamak için kullanacağımız steril tüpleri önceden tartarak işe başlıyoruz.Her bir boş tüpün ağırlığını belirledikten sonra, steril koşullar altında ilgili organları hızla diseke edeceğiz ve ardından buz üzerinde saklayacağız. Her diseksiyon arasında aletlerin %70 ethanol ile durulanması gerektiğini unutmamak önemlidir. Organları topladıktan sonra, her bir biyolojik örneğin ağırlığını belirliyoruz.Ardından, doku örneklerini laminar akışlı kabin içerisinde, polytron homogenizatör kullanarak %10 steril PBS ile homogenize edeceğiz. Homogenizatörü çalıştırın ve dokuyu parçalamak için tüpü yukarı-aşağı hareket ettirin. Her örneği homogenize ettikten sonra, bir sonraki doku örneğine geçmeden önce cihazı bir kez steril su ile, bir kez %70 etanol ile ve son olarak PBS ile yıkayın.Numuneler homojenize edildikten sonra, tüpleri dört derece Celsius'ta 20 dakika boyunca santrifüjleyin. 1000 Gs hızında süpernatanları yeni steril tüplere toplayın. Bu aşamada, viral numuneler immunoperoksidaz tespiti için işlenebilir.Aksi takdirde, bunları hemen -80 °C'de dondurabilir ve analizlere hazır olana kadar saklayabilirsiniz. Ardından, hücre örneklerini hazırlamak istiyoruz. Adherent ve non-adherent hücrelerin hazırlanması için farklı yöntemler vardır ancak her iki yöntem de hücre içi ve hücre dışı viral titrelerin toplanmasını içerir.Adherent hücrelerde hücre dışı viral üretimi belirlemek için, enfeksiyon sonrası uygun zamanlarda test edilmek üzere enfekte hücrelerden süpernatantlar ve steril tüpler topluyoruz. Hücre içi viral titrelerin tahmini için ise önce besiyerini uzaklaştırmak, hücreleri sıcak ve steril PBS ile yıkamak, ardından aynı hacimde veya bilinen bir hacimde besiyeri eklemek ve eksi 80 santigrat derecede üç kez dondurma-çözme döngüsü uygulamak istiyoruz. Bu işlem hücreleri lize edecek ve viral partiküllerin besiyerine salınmasını sağlayacaktır.Yapışmayan hücreler için, öncelikle hücreleri beş dakika boyunca bin G'de santrifüj ediyoruz. Hücreleri çökelttikten sonra, süpernatantları steril tüplere topluyoruz. Bu kısım, enfektif virüsün hücre dışı kısmını temsil eder.Ardından, hücre peletini toplanan süpernatant ile aynı hacimde veya bilinen bir hacimdeki kültür ortamında süspansiyona getiririz. Hücreleri liz etmek ve viral partikülleri ortama salmak için -80 °C'de üç döngü dondurma-çözme işlemi uygularız. Bu işlem, enfeksiyöz virüsün hücre içi kısmını temsil eder.Yapışkan veya yapışkan olmayan hücrelerin lizisinden sonra, örnekleri bin g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Artık süpernatan yeni steril tüplere toplanabilir ve titrelere immunoperoksidaz analizi ile bakılabilir. Alternatif olarak örnek, hemen dondurularak -80 °C'de analiz aşamasına kadar saklanabilir.Biyolojik örneklerimizdeki insan koronavirüs enfeksiyonunun verimliliğini test etmek amacıyla, koronavirüse duyarlı hücreler üzerinde bir immün peroksidaz testi kullanmak istiyoruz. Konfluen bir monokatmandan duyarlı hücre süspansiyonu oluşturmak için ilk pasajlar ve işlem uygulanır. İnsan koronavirüsü ile çalışırken, duyarlı hücreler olarak 2 29 EL 1 32 hücreleri kullanılır ve insan koronavirüsü OC 43 için, duyarlı hücre süspansiyonu oluşturulduktan sonra HRT 18 hücre hattı kullanılır. Bunlar, doku kültürü için 96 kuyucuklu bir plakaya ekilir.Çok kanallı pipet kullanılıyorsa, hücrelerin uygun konsantrasyonu kullanılarak her kuyucuğa yüz mikrolitre hücre süspansiyonu aktarın. Kuyucuk başına düşen duyarlı hücre sayısı, kullanılan hücre tipine ve hücre ekiminin ne zaman gerçekleştirileceğine bağlı olarak değişecektir. Ekim işleminden sonrası için lütfen daha detaylı bilgi içeren Springer protokolümüze bakınız.İmmünoperoksidaz analizine başlamadan önce, duyarlı hücrelerin daha önce hazırladığımız örneklerle enfekte edilmesi gerekir. Duyarlı hücreler %70 ila %80 konfluense ulaştığında, 96 kuyucuklu plakayı steril kağıt havluya sarıp başka bir steril kağıt tabakası üzerinde yüzü aşağı bakacak şekilde hafifçe sallayarak her bir plakadaki besiyerini uzaklaştırın. Ardından, her bir kuyucuğa %1 FBS ile desteklenmiş 100 µL alpha MEM ekleyin.Her bir örnek, yan yana dört kolonda test edilmelidir. Aynı plaka içinde, ilk satırda test edilecek olan alikotların her bir kuyucuğuna yüz mikrolitre ekleyin. Genellikle duyarlı hücreler, enfekte örneklerin seri logaritmik dilüsyonları ile inoküle edilir.Bunu yapmak için, aynı örnekten dört kuyuya tekrar kuyu başına 11 µL ekleyin. Şimdi, 96 kuyucuklu plakanın ikinci sırasındakileri, çok kanallı pipetle üç kez yukarı-aşağı pipetleyerek karıştırın ve her kuyucuktan 11 µL'yi üçüncü sıradaki kuyucuklara ve plakadaki son sıraya kadar bu şekilde aktarın. Hücreleri inoküle ettikten sonra, insan koronavirüsü için plakaları nemlendirilmiş bir inkübatörde 33 °C'de %5 CO2 ile inkübe edin.2290 enfekte hücreleri beş gün boyunca, insan koronavirüsü OC 43 enfekte hücreleri ise dört gün boyunca inkübe edilir. Bu sürenin ardından virüs tespit aşamasına geçilebilir.İnkübasyon sonrası, virüsü tespit etmeye hazırız. İlk olarak, besiyerini tamamen uzaklaştırarak başlarız. Bunu, plakaları laminar akışlı kabinde steril olmayan kağıt havlular üzerine vurarak yaparız.Ardından, kuyucukları nazikçe PBS ile doldurarak hücreleri hassas bir şekilde duruluyoruz. Çok kanallı bir pipet kullanarak PBS'yi kuyucuklardan hızla boşaltıyoruz ve her plakayı kağıt havluya sararak kalan PBS kalıntılarını temizliyoruz.Hücreler yıkandıktan sonra, onları %0,3 hidrojen peroksit içeren yüzde yüz metanol ile fikse etmeniz gerekecektir. Metanol karışımını hücrelere ekleyin ve plağı oda sıcaklığında 15 ila 30 dakika bekletin. 30 dakikalık inkübasyonun ardından, fiksatif plaklar lavabo üzerinde sallanarak uzaklaştırılır. Kalan fiksatif, plakların tezgah üzerine serilmiş birkaç kağıt havlu üzerine yüzüstü getirilip sallanmasıyla temizlenir.Ardından, hücreler kururken yaklaşık 15 ila 30 dakika boyunca yüzeyleri yukarı bakacak şekilde tamamen havada kurumaya bırakın. PBS içinde uygun dilüsyonda, virüse özgü bir antikor çözeltisi hazırlayabilirsiniz. Daha sonra, her bir kuyucuğa yüz mikrolitre özgün viral antikor ekleyin ve plakaları 37 °C'de iki saat boyunca inkübe edin.İnkübasyon sonrası, plakayı lavaboya doğru hafifçe vurarak ortamı tamamen boşaltın. Kuyucukları PBS ile doldurarak plağı yıkayın. Ardından plağı lavaboya doğru vurarak boşaltın ve PBS ile durulayın.İki kez daha tekrarlayın. Kalan tüm PBS'yi, kuyucukları tezgahta duran steril olmayan kağıt havluların üzerine yüzüstü vurarak uzaklaştırın. Ardından, her kuyucuğa 1:1000 oranında sulandırılmış sekonder antikordan 100 µL ekleyin.PBS ile seyreltin, plağı CO₂ olmadan 37 derecede iki saat boyunca inkübe edin ve inkübasyonun bitiminden 30 dakika önce işlemi tamamlayın. DAB'nin PBS ve %0,01 hidrojen peroksit ile karışımından oluşan saptama reaktifini hazırlayın. Plağı, daha önce yapıldığı gibi üç kez PBS ile durulayın.Plaka yıkandıktan sonra, her kuyucuğa yüz mikrolitre geliştirme reaktifi ekleyin. Pozitif kontrol boyanana kadar veya oda sıcaklığında 10 ila 20 dakika boyunca inkübe edin. Reaksiyonu durdurmak için, plakayı daha önce PBS ile yapıldığı gibi bir kez suyla yıkayın ve her kuyucuğu yüz mikrolitre deiyonize su ile doldurun.Son olarak, boyanmış hücrelerin bulunduğu tüm kuyucukları sayımlamak için plakları ışık mikroskobuyla inceleyin. Artık nihayet virüsümüzün titresini belirleyebiliriz. Bu değer, bu videoya eşlik eden Springer protokolünde denklemini bulabileceğiniz car yöntemi kullanılarak hesaplanabilir.Bu prosedürü gerçekleştirirken insan koronavirüslerinin nasıl titre edileceğini size göstermiş olduk. Hem virüsler içeren numunelerle çalıştığınızı hem de steril koşullar altında çalışmanız gerektiğini hatırlamanız önemlidir. Hepsi bu kadar.İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

titration-of-human-coronaviruses-using-an-immunoperoxidase-assay

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu yöntem, yüksek hassasiyet enfekte olmuş fareler bronkoalveoler lavaj (BAL) sıvısında H1N1 tespiti için Kızılötesi boya temelli görüntüleme sisteminin kullanımı açıklanmaktadır. Bu metodoloji, bir 96 veya plaka 384-iyi, test malzemesi &lt;10 ul hacmi gerektirir ve birden fazla patojenlerin eşzamanlı tarama için bir potansiyele sahiptir.

Gribi için yüksek verimlilik Tespit Yöntemi

Kaynak: Bouillier, C., et al. Rekombinant Respiratuvar Sinsityal Virüslerin Üretimi, Amplifikasyonu ve Titrasyonu. J. Vis. Exp. (2019)Bu video, epitel hücre monokatmanlarındaki enfeksiyöz rekombinant respiratuar sinsityal virüsün (RSV) miktarını belirlemek için kullanılan bir plak titrasyon analizini göstermektedir. Videoda, konak hücrelerin seri dilüye edilmiş viral süspansiyonlarla enfekte edilmesi, viral yayılımın selüloz bazlı yarı katı bir overlay ile sınırlandırılması ve sitopatik etkiler...

Enfeksiyöz Respiratuar Sinsityal Virüsün Kantifikasyonu için Plak Titrasyon Analizi

Bu video, insan serumunda α2,6'ya bağlı sialik asidi aşırı eksprese eden Madin-Darby Köpek Böbrek hücrelerini kullanarak nötralize edici antikorları ölçmek için Mikronötralizasyon testlerini göstermektedir. Bu test genellikle influenza insan serolojisi için...

İnsan Serumunda Nötralize Edici Antikor Titrelerini Ölçmek için Bir Mikronötralizasyon Testi

Bu video, SARS-CoV-2 virüslerini nötralize etmede serum etkinliğini ölçen bir nötralizasyon testini göstermektedir. Nötralizasyon titresini ortaya çıkaran psödotiplenmiş virüsleri, serum seyreltmesini ve lüminesans tabanlı nicelemeyi içerir.

Fonksiyonel SARS-CoV-2 Nötralize Edici Antikorların Değerlendirilmesi

Serumlarda influenza nöraminidaz (NA)-inhibisyon antikor titrelerini ölçmek için enzime bağlı lektin testini (ELLA) tarif ediyoruz. Tahlil, NA'nın fetuin kaplı, 96 oyuklu plakalardan sialik asidi çıkardığında erişilebilir hale gelen galaktoz kalıntılarını ölçmek için fıstık aglütinini kullanır.

Enzim-linked Lektin Testi tarafından Grip Nöraminidaz İnhibisyon antikor titreleri Ölçme

Bu çalışma, bir açıklar   görüntüleme bazlı mikro-nötralizasyon deneyi virüsler arasında antijenik ilişkileri analiz etmek. protokol düz yataklı tarayıcı kullanır ve titrasyon, titrasyon kantitatif, nötralizasyon ve nötralizasyon kantitatif olmak üzere dört adım vardır. Tahlil akımı dolaşan grip A (H1N1) pdm09, A (H3N2) ve B virüsleri ile iyi çalışır.

Bir Kantitatif Mikro-nötralizasyon Testi optimizasyonu

Grip nötralize antikorlar grip enfeksiyonlar korunması ile aralarındaki ilişkileri belirlemektir. Microneutralization deneyleri insan sera nötralize antikor ölçmek ve sık sık grip insan seroloji için kullanılır. Biz bir microneutralization tahlil nötralize antikor titreleri çağdaş 3C.2a ve 3C.3a A(H3N2) virüs grip aşısı ya da enfeksiyon takip için ölçmek için MDCK-SIAT1 hücreleri kullanarak açıklar.

MDCK-SIAT1 hücreleri kullanarak antikor yanıt için Microneutralization tarafından insan Sera A(H3N2) virüsleri nötralize grip ölçme deneyi

Burada açıklanan protokol, sars-CoV-2 spike proteinine karşı nötralize edici antikorları ölçmek için hızlı ve etkili bir yöntemi özetlemektedir, iyileşen serum örneklerinin gelişmiş yeşil floresan protein etiketli veziküler stomatit virüsü psödotip ile enfeksiyonu inhibe etme yeteneğini değerlendirerek spike glikoprotein ile.

Psödovirüs Enfeksiyonunun Yüksek Verimli Floresan Görüntülemesi Kullanılarak SARS-CoV-2 Nötralize Edici Antikorların Tespiti

Bu protokol, viral titrasyonları optik mikroskopi ve immünositokimyasal boyama ile karşılaştırarak kristal mor kullanarak görselleştirmek için doğru ve objektif bir yaklaşım göstermektedir.

TCID50 Tahlilleri Kullanarak Viral Titrasyon için Görsel Sitopatik Etki Tabanlı Okumayı Geliştirmek için Kristal Menekşe Kullanımı

Psödotipli virüsler (PV'ler), otantik virüsleri işlemekten daha güvenli koşullar altında konak-virüs etkileşimlerini incelemek için kullanılan replikasyon kusurlu virionlardır. Burada, SARS-CoV-2 PV'lerin COVID-19 aşılamasından sonra hastaların serumunun nötralize edici yeteneğini test etmek için nasıl kullanılabileceğini gösteren ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır.

Nötralizasyon Testi Yoluyla SARS-CoV-2'ye Karşı Humoral İmmün Yanıtları İzlemek İçin Moleküler Bir Araç Olarak Psödotiplenmiş Virüsler

Bu protokol, SARS-CoV-2 varyantlarının enfektivitesinin ve nötralize edici antikorlara duyarlılıklarının hızlı bir şekilde ölçülmesi için bir platform olarak yeni bir hibrit alfavirüs-SARS-CoV-2 psödovirüsünün (Ha-CoV-2) uygulanmasını açıklar.

SARS-CoV-2 Varyantlarının Hızlı Miktar Tayini ve Nötralize Edici Antikorlar için Ha-CoV-2 Psödovirüsünün Uygulanması

Öğrenin, insan coronavirüslerini immunoperoksidaz testi ile titrasyon yöntemiyle nasıl tespit edeceğinizi. Bu teknik, sitopatik etki göstermeyen virüsler için güvenilir bir alternatif sunar.

Immunoperoksidaz Testi İnsan coronavirüsleri Titrasyon

Daha fazla video keşfet