Assay ההתנהגות כדי למדוד את התגובה של דג הזברה לשינויים לעוצמות אור

במעבדת דאולינג אנו חוקרים את הפיזיולוגיה וההתפתחות של הרשתית בדגי זברה כדי לקבוע אם מוטציות של דגי זברה שאינן מסוגלות לזהות תנועה יכולות לזהות אור ואינן עיוורות. אנו בודקים את התגובה המוטורית החזותית שלהם או VMR כדי לעשות זאת. אנו אוספים דגי זברה כארבעה ימים לאחר ההפריה.

מקם אותם ב-96. צלחות באר מכינות מתקן הדמיה מתאים, מיישרות את תוכנת מעקב הווידאו עם הצלחת, ולאחר מכן עוקבות אחר התגובה המוטורית של הדגים לאחר מעברים מאור לחושך או מחושך לאור, שזה מה שאנו מכנים VMR. היי, אני פארידה אימראן מהמעבדה של ג'ון דאולינג והמחלקה לביולוגיה מולקולרית ותאית באוניברסיטת הרווארד.

ואני ג'ייסון ריו. אני מהמעבדה של אלכסנדר שיר, גם היא במחלקה לביולוגיה מולקולרית ותאית באוניברסיטת הרווארד. היום נראה לכם את התגובה המוטורית החזותית בדגי הזברה לעלייה וירידה קלה.

אז בואו נתחיל. כדי להתחיל את בדיקת התגובה המוטורית החזותית, יש לגדל תחילה זחלי דג זברה מסוג בר תחת מחזור אור כהה ב-28 מעלות צלזיוס עד לפחות ארבעה ימים לאחר ההפריה. מחזור האור הטיפוסי שלנו הוא 14 שעות של אורות דולקים החל מהשעה 9:00 בבוקר ו-10 שעות של כיבוי אורות החל מהשעה 23:00 לקבלת התוצאות ההתנהגותיות הטובות ביותר.

הימנע מצפיפות יתר של הזחלים. בדרך כלל אנו שומרים לא יותר מ-50 זחלים בצלחת פטרי אחת. לאחר חמישה ימים לאחר ההפריה, אנו מעבירים את דגי הזברה לצלחת של 96 בארות בגודל באר של 650 מיקרוליטר על מנת לתת לזחלים חדר שחייה גדול.

בעזרת פיפטת העברה מפלסטיק מעבירים בעדינות זחל אחד לכל באר. לאחר העברת הדגים לבארות, מלאו כל באר במספיק מי דגים כך שפני המים כמעט נשטפים לראש הבארות. היזהר לא למלא יתר על המידה או למלא את הבארות כדי למנוע בעיות אופטיות עבור מצלמת ההקלטה.

כמו כן, הקפידו לא להכניס בועות לבארות. הדגים מוכנים כעת למעקב אחר תגובות הקטר שלהם לאור ולחושך. בואו ניקח את דג הזברה המצופה למכשיר ההקלטה.

אז בואו נמשיך בסקירת מכשיר ההקלטה. צלחת 96 הבארות המכילה דגים תונח בתוך תא ההקלטה כאן במגש הלבן הזה ותוחזק במקומה עם קפיץ או גומיה. המצלמה ממוקמת בחלק האחורי של הקופסה כאן וממוקדת בצלחת באמצעות מראות מהחלק העליון של הקופסה הממוקמת כאן.

ניתן לכוונן את הזווית של מראות אלו על ידי סיבוב הברגים המחזיקים את המראות במקומן. תא ההקלטה מואר מלמטה על ידי נוריות אינפרא אדום. זה מאפשר למצלמה להקליט את הדג גם בחושך.

הזחלים אינם יכולים לזהות אור IR, ולכן תאורת IR קבועה זו אינה משפיעה על הניסוי. נוריות LED לבנות מאירות גם את תא ההקלטה מלמטה. הם נשלטים בנפרד מנורות ה-IR לניסויים שנמשכים יותר מכמה שעות.

ניתן למלא את החדר במים זורמים בעדינות כדי לסייע בשמירה על טמפרטורה קבועה למשך הניסוי. המים נשאבים ממאגר על ידי משאבת אקווריום קטנה ומחוממים ל-28 מעלות עם מחמם אקווריום תת ימי טיפוסי. המים מתנקזים דרך חור ניקוז גדול ומוחזרים למאגר כדי למזער את הרטט התועה מהחדר.

יחידת ההקלטה כולה יושבת על גבי שולחן איזון כבד. כאשר מכשיר ההקלטה מוכן, נעשה שימוש במכסה קופסה כדי לכסות את בעלי החיים ולבודד אותם עוד יותר מהאור. עכשיו בואו נמשיך עם היישור של ה-96.

צלחת באר עם רשת המחשב של תוכנת מעקב הווידאו כדי לעשות זאת במקום הראשון, צלחת 96 בארות המכילה את הדג לתוך תא ההקלטה. בעת שימוש באמבט מים לניסויים ארוכי טווח, הנח לאט את הצלחת במים, ותן למפלס המים הזדמנות להסתגל מבלי להישפך על הצלחת. בתוכנת מסלול הווידאו Viewpoint בדוק כדי לוודא שכל הזחלים והניסוי נראים על מסך המחשב.

באמצעות פקדי התוכנה, יישר את הרשת של תוכנת מעקב הווידאו עם הבארות של צלחת 96 הבארות כך שכל דג נמצא בתוך ריבוע מהרשת. שלב זה חשוב מאוד עבור כל ההקלטות שלך. מחשב המעקב יחשב את התנועה בנפרד עבור כל אחת מהתיבות הללו.

אז אם אתה מיישר לא נכון את רשת המחשב, חלק מתנועות הדגים עלולות ללכת לאיבוד או אפילו גרוע מכך. שני דגים סמוכים יתפסו את אותו שטח ויספרו כדג אחד לאחר היישור. התזמון שבו האורות יידלקו ויכבו מתוכנת במחשב.

בדרך כלל אנו מאפשרים שלוש שעות של הסתגלות כהה בהירה יותר בקופסה. זה לא רק משיג רמת פעילות בסיסית, אלא גם נותן לזחלים הזדמנות להירגע לאחר הפיפטינג והטיפול. לאחר מכן, אנו סוגרים את דלת תא ההקלטה שלנו ומתחילים להקליט.

בפועל, אנו מתעדים את הפעילות של כל דג בשנייה, אך תוכנת נקודת התצפית למעשה מתעדת את נתוני המסגרת אחר המסגרת. כאן מתחת למסך תוכלו לראות עקבות בזמן אמת של דג בודד. מבחינת תנועת הפיקסלים, הקו הלבן מציין שמספר שינויי הפיקסלים נמוך מסף מוגדר והירוק מציין ששינוי הפיקסלים הוא מעל הגדרת הסף.

ערך הסף יהיה תלוי במידה מסוימת במצלמה ובמערך התאורה הספציפי שלך. להגדרה שלנו, אנחנו משתמשים בדרך כלל בסף של ארבעה פיקסלים. כלומר, אם פחות מארבעה פיקסלים משתנים, זה נחשב לרקע.

אם יותר מארבעה פיקסלים זזים, זה מציין שהדג זז. קבענו אמפירית שהחתך הזה מזהה כמעט את כל תנועות השחייה והסיבוב של הזחלים. למרות שקופסאות ההקלטה מבודדות את הזחלים די טוב, אנחנו עדיין מכבים את האור בחדר ודואגים למזער הפרעות עם רעש מכני, כמו סגירה ופתיחה של דלתות בחדר, מסיבת ריקודים או ביצוע שגרת האימונים שלנו.

לאחר השלמת הניסוי, העבר את הנתונים שנאספו לגיליון אקסל או לחבילת הניתוח המועדפת עליך. כך נראים הנתונים. הוא מכיל את הזמן והשניות מתחילת הניסוי ואת הפעילות של כל זחל בשנייה.

הנה גרף שמראה את הפעילות של זחל בודד לאורך כל הניסוי, עם כמה תגובות הפעלה וכיבוי שמסומנות על ידי החצים בגרף. הגרף הזה מראה את הפעילות הממוצעת של 40 דגים לאורך כל הניסוי, עם כמה תגובות הפעלה וכיבוי כפי שמצוין על ידי החצים. כפי שאתה יכול לראות, תגובות ההפעלה והכיבוי בולטות ועקביות.

ניסוי תגובה מוטורית חזותית זה יכול להתבצע גם על דגים מוטנטיים. עבור מחקרים אלה, אנו בדרך כלל לוחים דגי בר ודגים מוטנטיים על אותה צלחת במתאר לוח שחמט למטרות בקרה אופטימליות. בעת שימוש בדגים מוטנטיים באותה צלחת כמו דגי בר, הקפד לרשום איזה סוג דג היה מצופה בכל אחד מהם. ובכן.

להלן הצעה כיצד לעקוב אחר הדגים המצופים בכל אחד מהם. ובכן. להלן תוצאות תגובה מוטורית חזותית, המשווים זחלים מסוג בר וזחלים מוטנטיים. שוב, אנו רואים את התגובות הבולטות והעקביות לסירוגין של זחלי בר.

עם זאת, הזחלים המוטנטיים של הגיר, חסרי התפתחות העיניים, אינם מגבירים באופן משמעותי את פעילותם לעלייה קלה או לירידה ויש להם רמת פעילות בסיסית נמוכה. תוצאות אלה משוות תגובות מסוג פרא עם מוטציות NO OKR, הנקראות גם מוטציות NRC. המוטציה של ה-NRC נחשבה עיוורת לחלוטין על סמך מבחן ה-OKR.

באמצעות מבחן ה-VMR, אנו מדגימים שלמוטנט ה-NRC יש תגובה כבויה נורמלית ותגובה מאוחרת ואיטית. לפיכך, המוטציה של ה-NRC אינה עיוורת לחלוטין כפי שחשבו בעבר. זה עתה הראינו לכם את התגובה המוטורית החזותית של דג הזברה לעלייה וירידה באור.

בעת ביצוע הליך זה. חשוב לזכור לבצע את הניסוי במהלך היום מכיוון שדגים פעילים יותר ומגיבים לשינויים בעוצמת האור במהלך היום לעומת במהלך הלילה. אז זהו.

תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.