Mutagênese in vitro

Para aprender mais sobre a função de um gene, os investigadores podem observar o que acontece quando o gene é inativado ou “knocked out”, criando animais knockout geneticamente modificados. Murganhos knockout têm sido particularmente úteis como modelos para doenças humanas como cancro, doença de Parkinson e diabetes.

O Processo

Genes podem ser aleatoriamente eliminados, ou podem ser alvos específicos. Para realizar o knockout de um gene em particular, uma porção de DNA chamada vector de clonagem é criada e usada para substituir o gene normal, inativando-o dessa forma.

Esses vectores de clonagem têm sequências em cada extremidade idênticas—ou homólogas—às sequências que flanqueiam cada lado do gene de interesse. Essas sequências homólogas permitem que o vector de clonagem substitua o gene através da recombinação homóloga—um processo que ocorre naturalmente entre DNA com sequências semelhantes durante a meiose.

O vetor de clonagem é introduzido em células estaminais embrionárias de murganho em cultura, usando métodos como eletroporação—uso de pulsos elétricos para criar temporariamente poros na membrana celular. Normalmente, para identificar células onde o vector substituiu corretamente o gene, ele é desenhado para incluir um marcador de seleção positivo—como o gene para resistência à neomicina (Neo^R)—entre as regiões homólogas; e um marcador de seleção negativo—como o gene da quinase de timidina viral (TK)—após uma das regiões homólogas.

As células são expostas à neomicina, e somente aquelas que incorporaram o vetor no seu DNA irão sobreviver porque têm o gene Neo^R. Além disso, as células, onde o vector substituiu o gene alvo através da recombinação homóloga, não terão o gene TK, permitindo-lhes sobreviver na presença do fármaco ganciclovir. Portanto, a exposição ao ganciclovir é usada para eliminar células que têm o vetor aleatoriamente inserido no seu genoma, porque essas células terão o gene TK.

As células com o knockout correto do gene são então inseridas em um embrião de murganho, que é implantado no útero de uma fêmea, onde se desenvolve até o nascimento. O murganho resultantes é uma quimera—o que significa que é composto por uma mistura de células—algumas com DNA normal do embrião, e algumas com o gene eliminado em um cromossoma das células transformadas. Estes murganhos são cruzados, e os descendentes que contêm o gene na sua linha germinativa são ainda mais cruzados entre si para criar uma linha de murganhos onde cada célula é homozigótica para o knockout. Estes murganhos knockout podem ser então usados para estudar a função genética.