Back to chapter

16.1:

In vitro Mutagenesis

JoVE Core
Biologia Molecular
This content is Free Access.
JoVE Core Biologia Molecular
In vitro Mutagenesis

Idiomas

COMPARTILHAR

يمكن للعلماء تعطيل أو استقصاء جبن في الحيوانات الفئران عادة لمعرفة المزيد عن وظيفة الجين عادة عن طريق استبداله بموجه استهداف قطعة هندسية من الحمض النووي. يحتوي متجه الاستهداف على تسلسل متماثلة مطابقة لتسلسلات الجين قبل وبعد عادة ما يكون لها أيضًا علامة اختيار إيجابية مثل الجين لمقاومة النيوميسين نيو-آر”في الوسط وعلامة اختيار سلبية مثل الجين للثيميدين كيناز في النهاية. عندما يُقدّم في الخلايا الجذعية الجنينية يحل محل الجين من خلال إعادة التركيب المثلي الذي يحدث بشكل طبيعي بين امتدادات الحمض النووي مع تسلسل مماثل.خلايا تم فيها استبدال الجين بشكل صحيح سوف تحتوي على علامة إيجابية ولكن ليست السلبية لتسمح لهم بالتعريف في الثقافة. ثم يتم إدراج هذه الخلايا في جنين الفأر وزرعها في رحم الأنثى. يحتوي الفأر الناتج على مجموعة من الخلايا الطبيعية والخلايا مع الجينات المستأصلة على كروموسوم واحد.ثم تربى هذه الفئران لتوليد ما يسمى بالـ”الفئران المستأصلون”التي هي متماثلة اللقاح عن خروج المستأصل في جميع الخلايا.

16.1:

In vitro Mutagenesis

لمعرفة المزيد عن وظيفة الجين ، يمكن للباحثين ملاحظة ما يحدث عندما يكون الجين مثبطاً أو ”معطلاً“ من خلال إنشاء حيوانات معطلة جينيا(knockout) معدلة وراثياً. لقد كانت الفئران المعطلة جينياً من الفئران المفيدة بشكل خاص كنماذج للأمراض البشرية مثل السرطان ومرض باركنسون ومرض السكري.

العملية

يمكن القضاء على الجينات بشكل عشوائي ، أو يمكن استهداف جينات معينة. للقضاء على جين معين ، يتم استخدام قطعة هندسية من الحمض النووي تسمى ناقل الاستهداف لتحل محل الجين الطبيعي ، وبالتالي تعطيله.

تحتوي نواقل الاستهداف على تسلسلات في كل طرف تكون متطابقة _ أو متجانسة _ مع التسلسلات التي تحيط بكل جانب من الجين محل الاهتمام. تسمح هذه التسلسلات المتماثلة لناقل الاستهداف باستبدال الجين من خلال إعادة التركيب المتماثل _ وهي عملية تحدث بشكل طبيعي بين الحمض النووي مع تسلسلات متماثلة أثناء الانقسام الاختزالي.

يتم إدخال ناقل الاستهداف في الخلايا الجذعية الجنينية للفأر في المزرعة ، باستخدام طرق مثل التثقيب الكهربائي _ استخدام النبضات الكهربائية لإنشاء مسام مؤقتة في غشاء الخلية. عادةً ، لتحديد الخلايا حيث يتم استبدال الجين بالناقل بشكل صحيح ، يحتوي تصميمها علي علامة اختيار إيجابية _ مثل جين مقاومة النيوميسين (NeoR) _ بين المناطق المتجانسة ؛ وعلامة اختيار سلبية _ مثل جين ثيميدين كيناز الفيروسي (TK) _ بعد إحدى المناطق المتجانسة.

تتعرض الخلايا لنيومايسين ، وتلك التي أدمجت الناقل في حمضها النووي هي فقط التي ستبقى على قيد الحياة لأنها تمتلك الجين NeoR. كذلك ، فإن الخلايا ، حيث تم استبدال الجين المستهدف بالناقل من خلال إعادة التركيب المتماثل ، لن يكون لديها جين ثيميدين كيناز الفيروسي ، مما يسمح لها بالبقاء على قيد الحياة في وجود عقار جانسيكلوفير. لذلك ، يتم استخدام التعرض لعقار الجانسيكلوفير للقضاء على الخلايا التي تم إدخال الناقل بشكل عشوائي في جينومها ، لأن هذه الخلايا ستحتوي على جين ثيميدين كيناز الفيروسي.

يتم بعد ذلك إدخال الخلايا التي تم تعطيل الجين بها بشكل صحيح في جنين الفأر ، والذي يتم زرعه في رحم الأنثى ، حيث يتطور حتى الولادة. الفأر الناتج عبارة عن كيمر _ بمعنى أنه يتكون من مزيج من الخلايا _ بعضها يحتوي على حمض نووي طبيعي من الجنين ، وبعضها يحتوي على الجين الذي تم التخلص منه على كروموسوم واحد من الخلايا المعدلة هندسياً. يتم تربية هذه الفئران ، ويتم تهجين النسل الذي يحتوي على الجين في خطها التناسلي بشكل أكبر لإنشاء خط من الفئران حيث تكون كل خلية متماثلة الزيجوت للعطل الجيني. يمكن بعد ذلك استخدام هذه الفئران المعطلة جينياً لدراسة وظيفة الجينات.

Leitura Sugerida

Hall, Bradford, Advait Limaye, and Ashok B Kulkarni. “Overview: Generation of Gene Knockout Mice.” Current Protocols in Cell Biology / Editorial Board, Juan S. Bonifacino … [et Al.] CHAPTER (September 2009): Unit-19.1217. [Source]