Assay für Neural Induction im Hühnerembryo
Summary
Neuronale Induktion ist der erste Schritt bei der Bildung des Gehirns. Es ist ein Mechanismus, durch den Hensen den Knoten (Veranstalter), weist benachbartes Gewebe ein neuronales Schicksal anzunehmen, dh zu steigen, um das Nervensystem zu geben. Dieses Video zeigt ein Test für neuronale Induktion in Hühnerembryo.
Abstract
Der Hühnerembryo ist ein wertvolles Werkzeug in der Studie der frühen Embryonalentwicklung. Seine Transparenz, Zugänglichkeit und einfache Handhabung machen ihn zu einem idealen Werkzeug für die Erforschung der Entstehung und ersten Strukturierung des Nervensystems. Dieses Video zeigt, wie Graft Veranstalter Gewebe in einen Wirt, ein Verfahren, mit dem Hensen s Knoten (der Veranstalter im Hühnerembryo) an einen Host zuständige Ektoderm aufgepfropft wird. Der Veranstalter Transplantat weist darüber liegenden na Gewebe bereits in ein neuronales Schicksal über neurale Induktion Signale anzunehmen. Dieser Mechanismus wird als neuronale Induktion bezeichnet und stellt den ersten Schritt in die Bildung von Gehirn und Rückenmark in Amnioten. Diese Methode ist wesentlich für die Charakterisierung von putativen neuralen Induktion Moleküle in chick verwendet. Dieses Video zeigt die verschiedenen Schritte in der Assay für neuronale Induktion; Erste, der donnor Embryo explantiert und merken sich auf einem Teller. Dann wird die Host-Embryo für Neue Kultur vorbereitet. Das Transplantat wird herausgeschnitten und transplantiert werden, um den Host-Bereich pellucida Marge. Der Gastgeber ist für 18-22 Stunden kultiviert. Die Montage ist fixiert und für weitere Anwendungen (zB in-situ-Hybridisierung). Diese Methode wurde ursprünglich von Waddington entwickelt<sup> 1,2</sup> Und Gallera<sup> 3,4</sup>.
Protocol
Discussion
Dieses Video zeigt die verschiedenen Schritte bei der Durchführung eines Assays für neuronale Induktion; Dieser Test ist im Wesentlichen für die Charakterisierung von putativen neuralen Induktion Moleküle in chick verwendet, und kann somit für eine Vielzahl von Anwendungen, angefangen von embryonalen Mikromanipulationen 1-4 verwendet werden; 6 bis entwirren neue Signalkaskaden 7,8, alle mit dem Ziel, das Verständnis der erste Schritt bei der Bildung des Gehirns und des restlichen N…
Acknowledgements
DP ist Empfänger von Ruth Kirschstein-Award 1F32 DA021977-01A1 aus dem National Institute on Drug Abuse. Diese Arbeit wurde von der Margaret M. Alkek Stiftung RHF unterstützt.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Eggs | Animal | Charles River Laboratories | Premium Fertile | Fertilized, HH3+ (14 hr) |
| Stereomicroscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 or similar | |
| Hybridization Incubator | Equipment | Robbins Scientific | M1000 | Use with inverted Pyrex dish and 500 ml ddH2O beaker |
| Marsh Automatic Incubator | Equipment | Lyon | RX | |
| Pyrex dish | ||||
| Watchmaker’s glass 50mm | Tool | VWR | 66112-060 | |
| Glass rings | Tool | Physical Plant facility | cut 4 mm thick sections of glass tubing (27 mm outer diam, 25 mm inner diam). Do not fine polish. | |
| Curved Forceps (1) | Tool | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| Forceps (2) | Tool | Fine Science Tools | 11002-13 | blunt ended using sharpening Stone and 100ul mineral oil |
| Fine scissors | Tool | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| Plastic dishes | Tool | Falcon | 353001 | |
| Rubber Bulb | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70980 | |
| DiI | Reagent | Invitrogen | D-282 | |
| Aspirator tube assembly | Tool | Sigma | A5177-5EA | |
| Microelectrode puller | Equipment | Sutter Instruments | Sutter Instruments P-97 Flaming/Brown Micropipette | |
| Pasteur Capillary Pipette | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | round edge under flame |
| Culture chamber | Tool | Pioneer Plastics | 030C | |
| Microcapillary tube | Tool | Sigma | P1049-1PAK | |
| Microdissecting knife | Tool | Fine Science Tools | 10056-12 | Use to puncture cavities prior to in situ hybridization |
| Minuten pins 0.2mm diam | Tool | Fine Science Tools | 26002-20 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C |
| Diethylpyrocarbonate (depc) | Reagent | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base | Dow Corning | 0001986475 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C | |
| Diethylpyrocarbonate (depc) | Acros Organics | 10025025 | Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave | |
| 16% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15710 |
Referências
- Waddington, C. H. Experiments on the development of chick and duck embryos, cultivated in vitro. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. 221, 179-230 (1932).
- Waddington, C. H. Induction by the primitive streak and its derivatives in the chick. J. Exp. Biol. 10, 38-46 (1933).
- Gallera, J. Excision et transplantation des différentes régions de la ligne primitive chez le poulet. C. R. Ass. Anat. 49, 632-639 (1964).
- Gallera, J. Primary induction in birds. Adv. Morph. 9. , 149-180 (1971).
- Serbedzija, G. N., Fraser, S. E., Bronner-Fraser, M. Pathways of neural crest cell migration in the mouse embryo as revealed by vital dye labeling. Development 108. , 605-612 (1990).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen’s node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development 122. , 3263-3273 (1996).
- Joubin, K., Stern, C. D. Molecular interactions continuously define the organizer during the cell movements of gastrulation. Cell. 98, 559-571 (1999).
- Streit, A., Berliner, A. J., Papanayotou, C., Sirulnik, A., Stern, C. D. Initiation of neural induction by FGF signaling before gastrulation. Nature. , 406-474 (2000).
- Psychoyos, D., Finnell, R. Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture. JoVE. 20, 10-3791 (2008).
